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要約

頭頸部癌患者で変異した特定の遺伝子を有するマウスモデルの開発は、新生物の理解のために必要とされる。ここでは、アデノ関連ウイルス-Cas9系を用いた原発マウス舌細胞の体外変換に関するプロトコルを提示し、特定のゲノム改変を有するマウスHNC細胞株を生成する。

要約

原発性正常上皮細胞の使用により、細胞内遺伝子および腫瘍抑制遺伝子に特異的な変異を導入することにより、細胞間のクラスタリング制御を用いて、細胞形質転換に必要なゲノム変化を再現的に誘導することが可能になる。マウスにおける短いパリンドロミック反復(CRISPR)ベースのゲノム編集技術。この技術により、マウスを用いてヒトがんに生じる遺伝的変化を正確に模倣することができます。マウスの一次細胞を遺伝子組み換えすることで、がんの発症、進行、治療、診断をより良く研究することができます。本研究では、クレ誘導性Cas9マウス舌上皮細胞を用いて、アデノ関連ウイルス(AAV)をインビトロでゲノム編集することを可能にした。具体的には、正常舌上皮細胞でKRAS、p53、APCを改変することにより、同系マウスの腫瘍性であるプリン頭頸部癌(HNC)細胞株をインビトロで生成した。ここで提示する方法は、特定のゲノム改変を有するHNC細胞株を生成する方法を詳細に説明し、同系マウスにおける腫瘍進行を予測するための適合性を説明する。我々は、この有望な方法がHNCの腫瘍生物学と治療を研究するのに有益かつ有用であろうことを想像する。

概要

HNCは世界的に一般的な悪性腫瘍である 1.HNC新生物の起源をモデル化することは、現在科学的転換点2にあります。HNC2、3、4(例えば、TP53、PIK3CA、NOTCH1、FAT1、RAS)では多くの遺伝子変異が同定されているが、HNCを誘導するために協調して必要なゲノム改変の特異的な組み合わせは不明のままである。

ヒトHNC細胞株の現在の使用は、病因および治療3に関連するメカニズムを解明するのに有意に役立った。しかしながら、免疫不全マウス系におけるヒト細胞株の研究には限界があり、これらのシステムは生体内新生物プロセス、特定の遺伝子変異の役割、免疫微小環境における治療応答に対処しない。したがって、特定の遺伝子改変を伴うマウス細胞株の開発と確立は、異なる遺伝子が形質転換過程にどのように寄与するかを研究し、免疫能力マウスにおける新規分子ベースの治療法を試験するために最も重要である。

生物医学研究における遺伝子機能研究は、DNA編集技術の進歩によって、二本鎖切断(DSB)を導入することにより、例えば5.これらの技術は、ジンクフィンガーヌクレアーゼの使用、転写活性化剤様エフェクターヌクレアーゼ、およびクラスター化された調節間短いパリンドロミック反復(CRISPR/Cas9)を含め、その軌跡における目的の任意の遺伝子の操作を可能にする。最新のCRISPR/Cas9システムは、ゲノム内の特定の部位でDSBを生成するようにCas9ヌクレアーゼを指示するガイドRNA(gRNA)で構成されています。このシステムは、最も伝統的に治療が困難な生物5においても、任意の細胞または標的組織における内因性遺伝子を改変する際に広範な認識を得ている。シンプルさ、スピード、効率性により、他のシステムに対して複数の利点があります。

腫瘍学では、CRISPR/CAS9技術は効果的に癌細胞を模倣する必要性を満たしています。HNCでこのシステムを確立するために、我々は強力なKRAS腫瘍遺伝子と2つの重要な腫瘍抑制遺伝子、APCおよびp536を操作した。GENIE データベース7によると、この組み合わせは HNC ではまれです。RAS突然変異(HRAS、NRAS、およびKRAS)は、すべてのHNC集団の約7%にしか存在しない。これらの腫瘍は、治療8、9に耐性である傾向がある。

Cas9とそのgRNAの送達は、AAVまたはレンチウイルスのいずれかを使用してウイルス導入を介して達成される。組換えAAVは、多くの場合、その高い力力、軽度の免疫応答、細胞の広い範囲を伝達する能力、および全体的な安全性に起因する標的細胞に遺伝子を送達するための好ましい方法です。AAVシステムを用いて、種々の組織特異的マウス細胞株が生成され、新しい細胞株が10、11、12で開発されている。しかし、マウスHNC細胞株モデル細胞を生成できる効率的なゲノム編集システムは未だに開発されている。本研究では、原発マウス舌細胞を腫瘍原性状態に変換するためのin vitro AAV-Cas9ベースのシステムの開発を模索した。このユニークなCRISPR/Cas9変換プロトコルと確立された腫瘍細胞株は、ゲノム変化の多様性によって誘発されるHNCの生物学をよりよく理解するために使用することができます。

プロトコル

この研究は、ネゲブ動物ケア・使用委員会のベン・グリオン大学によって承認されました。動物実験は、IACUC(IL.80-12-2015およびIL.29-05-2018(E))によって承認された。本研究で用いられた動物実験、住宅、環境条件のすべての側面は、実験動物のケアと使用のためのガイド13に準拠していました。

1. アデノ関連ウイルス産生

  1. 1日目:細胞培養
    1. DMEMの15 mLで14.5 cmプレートあたり種子4 x 106 HEK293T細胞。ポリエチレンニミン(PEI)(1μg/μL)でトランスフェクション用に10枚のプレートを用意します。
  2. 2日目:PEIを用いたHEK293T細胞のトランスフェクション
    1. メディアを取り外し、トランスフェクションの前に暖かいDMEM 1時間で再フィードします。
    2. 前温トランスフェクション試薬およびDMEM。
    3. AAV ITR(AAV pCM109 EFSクレSG APC Sg KRAS sg P53-KRAS HDR)を含む目的のプラスミドの10μgを使用して、AAV 2/9nキャプシドプラスミドの10μg(AAV2のrep遺伝子とAAV9のキャップ遺伝子を使用して、 プレートあたりのヘルパープラスミド(pAdDelta F5ヘルパー)の10μg(材料表を参照)。
      注:AAV生産にも使用できるヘルパープラスミドの新世代 - pAdDeltaF614、15、16が利用可能です。
    4. プレートあたりプレーンDMEMの1 mLでプラスミドを混合します。次に、90 μLのポリエチレニミン(総プラスミド:PEI濃度=1:3)をプラスミドミックスとボルテックスに簡単に加えます。
    5. PEI-プラスミドDNAミックスを室温で20分間インキュベートする(RT)。
    6. HEK293T細胞の上にミックスをドロップワイズで加え、プレートを37°Cの細胞培養インキュベーターに移し、24時間5%CO2で行います。
  3. 3日目:トランスフェクション後の中程度の変化
    1. メディアを完全に取り外し、15 mLの新鮮なDMEMを追加します。
  4. 5日目:ウイルスの収穫
    1. ドライアイス/エタノールバスを用意します。
    2. 細胞スクレーパーで細胞を収集し、50 mLチューブ(50 mLチューブあたり2プレート)に移します。
    3. 室温で15分間800 x gでスピンチューブ。
    4. すべてのチューブから上清を捨てます。1プレートあたり0.5 mLのリシスバッファー(150 mM NaCl、50 mM Tris-HCl、pH = 8.5)を最初のチューブのみに追加します(10プレートの場合は5mL)。細胞を再サスペンドし、合計体積を次のチューブに移し、最後のチューブまで続けます。
    5. セル懸濁液を新鮮な50mLチューブに移します。ステップ1.4.4で説明したのと同じ転写方法を使用して、同じ体積のリシス緩衝液(プレートあたり0.5 mL)でチューブを洗浄します。
    6. 乾燥氷/エタノール浴と37°水浴の間の細胞懸濁液を~10分の凍結/解凍サイクルの3ラウンドに供する。各解凍後に簡単に渦。
    7. 精製が同じ日に行われる場合は、RTで平衡バッファーと溶出バッファー(レシピについては表1を参照)を設定します。
    8. プレートあたり50単位のベンゾラーゼを加え、37°Cで1.5時間インキュベートします。
      注:ベンゾラーゼは、宿主の培養細胞および細胞懸濁液中に存在するプラスミドDNAから残留核酸を消化するために使用される。
    9. チューブを3,000 x gで4°Cで15分間回転させます。
    10. 18 Gスチール針を使用してシリンジで上清を収集し、溶液を0.45μmフィルターを通して15 mLチューブに押し込み、粗溶解物を得ます。
    11. 精製または精製を続行するまで、粗リサートを4°Cで数週間保存します。

2. AAV精製

  1. 5日目以降
    1. 平衡と溶出バッファをRTに配置します。
    2. 平衡バッファーの10 mLでクロマトグラフィーカラムを洗浄します。
    3. ヘパリンアガロースのプレートあたり0.5 mLをカラム17に加え、平衡バッファー(ヘパリンアガロースの体積の4倍)を加えます。カラムを反転させて溶液を混ぜ、アガロースを堆積させます。
    4. 重みによって柱から平衡バッファーを溶出します。
      メモ:アガロースが乾燥するのを防ぐために、平衡バッファーを残します。
    5. 粗リサーテをカラムにロードし、一定の攪拌で4°Cで2時間インキュベートします。カラムを直立した位置に持ち込み、アガロースが堆積できるようにします。
    6. 粗いライサートを重力で溶かします。
    7. 平衡バッファー(ヘパリンアガロースの体積の4倍)でカラムを洗浄します。
    8. カラムの下に100kDa遠心タンパク質フィルターを置き、溶出緩衝液(ヘパリンアガローの体積3倍)を使用してウイルスをフィルターに溶出させる。
      注: 溶出バッファは 15 mL を超えるべきではありません。
    9. フィルターが1mL未満になるまで3,000 x gでフィルタを~30分間遠心分離する。
    10. フィルターをPBSで満たし、3,000 x gで~30分間、フィルターに1mL未満になるまで充填します。すべての塩を除去するには、この手順2xを繰り返します。
    11. ウイルス溶液を3,000 x gで遠心分離してフィルターに濃縮し、できるだけ小さい体積(200°L未満)に到達します。
    12. 針と注射器でウイルス溶液を吸引し、チューブに0.22μmフィルターを介して溶液をプッシュします。
    13. 貯蔵のための濃縮されたウイルス粒子のアリコートを作る。
      注:アリコートは、4°Cでの短期保存の場合は~20μL、-80°Cでの長期保存の場合は~5°Lである必要があります。
    14. 前に説明した14、18、19、20に記載のウイルス性チイタおよびウイルス伝達効率を決定する。

3. 一次細胞の単離と培養

  1. 1日目
    1. 6週齢の男性または女性B6;129-Gt(ROSA)26Sortm1(CAG-cas9*,-EGFP)FEzh/JによりCO2窒息または他のIACUC承認プロトコルを安楽死させる。
      注:これらのCRISPR/Cas9ノッキンマウスは、CAGプロモーターによって指示されたcas9エンドヌクレアーゼおよびEGFPのクレコンビナーゼ依存的発現を有する。これらのマウスのゲノム中に存在する上流のLox-Stop-Lox(LSL)配列は、クレリコンビナーゼがない場合のCas9およびEGFPの発現を防止する。単一ガイドRNA(sgRNA)およびCreソースと組み合わせて使用すると、それらは生体内またはex vivo14で単一または複数のマウス遺伝子の編集を可能にする。
    2. 外科的はさみを用いて安楽死マウスから舌を解剖する。
    3. メスを使って舌組織を非常に小さな断片にミンチして組織を手動で解解解する。4.5mlのRPMIプレーン培地(血清を含む)を含む15mLチューブで組織断片を収集します。
    4. 三重酵素ミックス(200°L)を組織断片に加えます(レシピについては表1を参照)。
    5. 37°Cで30分間組織酵素ミックスをインキュベートし、10分ごとにチューブをタップして組織の酵素解離を強化します。
    6. HBSS/PBSを含む5%のウシ血清(FBS)を組織酵素ミックスに加えると、酵素作用を停止します。
    7. 滅菌70μmのナイロンメッシュを通して上記の細胞懸濁液を濾過し、分散した細胞とより大きな組織断片を分離します。
    8. フィルター処理した細胞懸濁液を、RTのHBSS/PBSで5分間、300 x gの遠心分離で洗浄します。
    9. 培養培地(RPMI/DMEMで10%FBS)でペレットを再サスペンドし、異なる細胞コロニーが形成されるまで60mm培養皿で成長する。
      1. 培養細胞凝集体は、細胞コロニーが形成されるまで3mLの完全な媒体(RPMI/DMEMで10%FBS)を含む60mm培養皿でフィルターの上に保持される。
    10. 培養1週間後に線維芽細胞汚染の存在について一次細胞を顕微鏡で調べる。凝集体および細胞懸濁液から開発された一次細胞を、37°Cで0.25トリプシン0.02%EDTA溶液で1分間治療し、線維芽細胞を除去します。
      注:通常、細胞凝集体からの一次培養は、単一細胞懸濁液と比較してより多くのコロニーを産生する。これらのコロニーからの細胞は、AAV伝達とより良い伝達効率を提供する。

4. 一次細胞のAAV伝達

  1. 10日目
    1. 完全な媒体の2 mLの6ウェルプレートの井戸あたり種子2 x 105一次細胞(RPMI/DMEMの10%FBS)。
    2. 翌日、10個の12個のウイルスゲノム/mL(1010形質導入ユニット/mL)で細胞を伝達し、ウイルス粒子含有媒体中の細胞を37°Cで48時間インキュベートする。
    3. ウイルス粒子含有媒体を除去し、AAV形取り細胞に完全な媒体を供給します。
      注:伝播を受けた細胞だけがGFPを発現し、増殖し始めます。形質導入を受けなかった細胞は、最終的に2週間以内に死ぬ。
    4. 培養展開の2週間後、細胞を種子検査用に、そして生体内腫瘍原性実験を行う。
      注:Cas9マウスのAAVトランス誘導細胞および正常一次細胞からのゲノムDNAを抽出し、標準プロトコルを用いて特定のゲノム編集を検証した。抽出されたDNAのシーケンシングおよび配列データの分析(表2)は、前に説明したようにハイブリダイゼーションキャプチャベースの次世代シーケンシングアッセイ(例えば、MSK-IMPACTプラットフォーム)を用いて行った。

5. 免疫蛍光とウェスタンブロッティングを用いた正常細胞の腫瘍原細胞への形質転換の検証

  1. 免疫蛍光
    1. 12 mmガラスカバーリップに2 x 105細胞をシードし、一晩インキュベーターに入れます。
    2. PBS(pH=7.4)の4%パラホルムアルデヒド中の細胞を固定し、免疫蛍光標識のプロセスを行う。
    3. PBSTの1%BSAまたは1%血清中の第1次抗体を用いて固定細胞を、RTで1時間または4°Cで一晩1時間、加湿室でインキュベートする。使用される一次抗体は、ウサギモノクローナル抗KRT14、ウサギモノクローナル抗E-カドヘリン抗体、およびCas9マウスmAbである。
    4. 1x PBSで細胞3xを5分間洗浄して、カバーリップから一次抗体溶液を取り除きます。
    5. 暗闇の中でRTで1時間PBSTで5%BSAでCy3ロバ抗ウサギIgGおよび/またはCy3ヤギ抗マウスIgG二次抗体を用いて細胞をインキュベートする。
    6. カバースリップから二次抗体溶液を取り出し、ステップ5.1.4の説明に従って細胞3xを洗浄します。
    7. DAPI(DAPIフルオロマウント)を含む取り付け媒体の滴でカバースリップを取り付けます。
    8. スライドが蛍光顕微鏡を使用して画像化されるまで、暗闇の中で4°Cで保存します。
  2. ウェスタンブロッティング
    1. 種子1 x106は、100ミリメートル培養皿で細胞を形質転換し、一晩インキュベーターに入れます。
    2. 形質転換した細胞を200μlの氷冷PBSに洗浄し、掻き取る。
    3. 細胞懸濁液を含むチューブを4°Cで2,000 x gで10分間遠心分離し、細胞をペレット化する。
    4. 上清を吸引し、リン酸緩衝液を用いて細胞を分解する(表1参照)。10,000 x gおよび 4 °C で 10 分間のリゼを遠心分離し、クリアされたリゼを収集します。
    5. 市販のブラッドフォードアッセイキットを使用して、メーカーのプロトコルに従ってタンパク質濃度を決定します。4xサンプルバッファー(500 mM Tris pH = 6.8、40%グリセロール、8%SDS、20%H2O、0.02%ブロモフェノールブルー)を使用して、タンパク質サンプルを0.5または1μg/μLで5分間沸騰させます。
      メモ:サンプルは-80°Cで、またはウェスタンブロット分析が実行されるまで保存することができます。
    6. 全リサートの等量(30μg)を10%ドデシル硫酸-ポリアクリルアミドゲル電気泳動(SDS-PAGE)で分離します。染料がゲルの底部に達していることを確認します。25Vで30分間半ドライブロッティングでナイロン膜にタンパク質を移します。
    7. トリス緩衝生理線(TBS)-0.1%ツイーン(TBST)に5%BSAを注ぎ、完全に覆います。一次抗体(抗クレ、抗Cas9、抗GFP、抗βカテニン、抗p53、抗ホスホERK、および5%BSA TBSTで希釈した抗βアクチン)でメブラーネを1時間ブロックします。
    8. インキュベーション後、1x TBSTで膜を10分間洗浄し、溶液が膜を完全に覆っていることを確認します。この洗浄3xを行い、次いでホースラディッシュペルオキシダーゼ(HRP)共役二次抗体(5%BSA TBSTで1:10,000希釈)を膜に加えます。RTで1時間インキュベートします。
    9. インキュベーション後、1x TBSTで膜を10分間洗浄し、溶液が膜を完全に覆っていることを確認します。化学発光イメージング(材料表参照)を実行してバンドを露出させ、それに応じて画像をキャプチャします。
  3. 免疫担当マウスにおける形質転換細胞の腫瘍原性電位の検証
    注:マウスは、ネゲブのベングリオン大学の制度的ガイドラインに従って維持され、治療されました。うなずく。CB17-Prkdc-scid/NCr Hsd (NOD.SCID)およびC57BL/6マウスを生体内研究に用いた。マウスは、12時間の光/暗いサイクルで空気濾過された層流キャビネットに収容され、食物と水のアドリビタムを供給された。
    1. 6-8週齢の女性NODを使用してください。CB17-Prkdc-scid/NCr Hsd (NOD.SCID)およびC57BL/6マウスの研究用。
    2. AAV-Cas9形質転換細胞をトリプシン化する。37°Cで前温したDMEMを使用してトリプシン化を停止し、50 mLチューブで収集します。
    3. 室温で10分間、800 x gでチューブを遠心分離します。上清を廃棄し、FBSなしでDMEM培地中の細胞ペレットを再サスペンドします。遠心分離をもう一度実行し、1x PBSで細胞ペレットを再サスペンドします。
      注: セルを 1x PBS に長時間保持しないでください。細胞の塊を防ぐために、常に細胞懸濁液を氷の上に置いてください。
    4. 自動セルカウンタを使用して細胞をカウントし、1x PBS を使用して細胞を目的の濃度(2.5 x 107セル/mL)に希釈します。各NODの右側にAAV-Cas9形質転換細胞懸濁液の皮下注射を介して腫瘍を生成する。CB17-Prkdc-scid/NCr Hsd (NOD.SCID)マウス(2 x 106セル/マウス)。同系マウスで直交異方性モデルを生成するには、0.5× 106一次細胞またはAAV-Cas9形質細胞をC57BL/6免疫担当マウスの舌に注入する。
    5. CO2窒息による2週間の後注入で動物を安楽死させ、免疫ヒストケミストリー分析のために安楽死マウスから腫瘍を解剖する。

結果

AAV システムを使用して正常な Cas9 セルを変換する
図1は、本研究で用いられるAAVトランスジーンプラスミドの詳細なベクターマップを提供する。図 2は、AAV-Cas9 ベースシステムの設計と動作の概要を示しています。ウイルス粒子を生成するために、HEK293T細胞をPEIトランスフェクション法を用いてAAVトランス?...

ディスカッション

いくつかの方法は、以前に成功の程度が可変で培養中の一次細胞を変換するために使用されてきました25,26,27,28.これらの方法のほとんどは、形質転換14、17、18、19にマウス線維芽細胞を使用するか、または4-ニトロキノ...

開示事項

M.S.はバイオサイエンス研究所の諮問委員会にて、メナリーニ・リケルシュはプーマバイオテクノロジー、第一三潮、タルグミン、免疫薬、メナリーニ・リケルシュから研究資金を受け取っています。M.S.はメデンディ・メディカル・トラベルの共同創設者でもあり、過去2年間にメナリーニ・リケルシュとADCファーマから名誉を受けています。他のすべての著者は、開示するものは何もありません。

謝辞

pAdデルタ5ヘルパープラスミドを提供してくれたダニエル・ギトラー博士に感謝します。この作品はイスラエル科学財団(ISF、 700/16(ME)、米国・イスラエル二国籍科学財団(BSF、2017323)(MEおよびMS)、イスラエル癌協会(ICA、20170024)(ME)、イスラエル癌研究財団(ICRF、17-1693-RCDA)(ME)、懸念財団(#7895)(ME)。フェローシップ:私とBGUクリットマンへのアロン・フェローシップとSJとMPへのフェローシップ。

資料

NameCompanyCatalog NumberComments
Antibodies
Anti mouse HRPJackson ImmunoResearch115-035-146
Anti rabbit HRPJackson ImmunoResearch711-035-152
Cas9 Mouse mAbCell Signaling Technology14697
CreBioLegend900901
Cy3-AffiniPure Goat Anti-Mouse IgGJackson ImmunoResearch115-165-062
Cy-AffiniPure Goat Anti-Rabbit IgGJackson ImmunoResearch111-165-144
GFPSanta Cruz Biotechnologysc-9996
Phospho-p44/42 MAPK (Erk1/2)Cell Signaling Technology4370
Rabbit monoclonal anti E cadherinCell Signaling Technology3195S
Rabbit monoclonal anti-KRT 14AbcamAB-ab181595
β actinMP Biomedicals691001
β cateninCell Signaling Technology9582S
Cell lines
HEK93TATCCCRL-3216
Culture Media, Chemicals and Reagents
Bradford ReagentBio-Rad30015484
BSAAmresco0332-TAM-50G
DAPI fluoromountSouthern Biotech0100-20
DMEMBiological Industries Israel Beit-Haemek Ltd.01-055-1A
ECL (Westar Supernova and Westar Nova 2.0)CyanagenXLS3.0100 and XLS071.0250
FBSBiological Industries Israel Beit-Haemek Ltd.04-127-1A
HBSSSigmaH6648
Heparin - AgaroseSigmaH6508
Isolate II Genomic DNA KitBiolineBIO-52066
MgCl2Panreac AppliChem300283
NaClBio Lab Ltd1903059100
PBSBiological Industries Israel Beit-Haemek Ltd.02-023-1A
PEIPolysciences23966-1
Pen Strep SolutionBiological Industries Israel Beit-Haemek Ltd.03-031-1B
PFASanta Cruz Biotechnology30525-89-4
Phosphatase inhibitor cocktailBiotoolB15001A/B
Protease inhibitor cocktailMilliporeSigmaP2714-1BTL
Tris bufferMERCK Millipore648311-1KG
Enzymes
BenzonaseSigmaE1014
Collagenase IVThermo Fisher Scientific17104019
DNAseThermo Fisher Scientific18047019
HyaluronidaseMilliporeSigmaH3506
TrypsinBiological Industries Israel Beit-Haemek Ltd.03-050-1B
Glass wares
Cover slipsBar NaorBNCB00130RA1
SlidesBar NaorBN9308C
Mouse strains
C57BL/6Envigo
B6;129-Gt(ROSA)26Sortm1(CAG-cas9*,-EGFP)Fezh/JJackson labs24857
NOD.CB17-Prkdc-scid/NCr Hsd (Nod.Scid)Envigo
Plasmids
AAV pCM109 EFS Cre sg APC sg Kras sg P53- Kras HDRBroad Institute of MITKind gift from Dr Randall J Platt and Dr. Joseph Rosenbluh, Broad Institute of MIT and Harvard, Cambridge, MA 02142, USA
AAV 2/9 capsid vectorAddgene112865
pAD Delta F5 helperBen Gurion University of the NegevProvided by Dr Daniel Gitler, Department of Physiology and Cell Biology, Faculty of Health Sciences, and Zlotowski Center for Neuroscience, Ben-Gurion University of the Negev, Beer-Sheva 84105, Israel.
Plastic wares
Amicon-ULTRA filter 100 KDaMilliporeUFC910024
0.22 µm sterile filters, 4 mmMillexSLGV004SL
0.45 µm sterile filters, 13 mmMillexSLHV013SL
Culture platesGreiner Bio-One
Falcon tubesGreiner Bio-One

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