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In questo articolo

  • Riepilogo
  • Abstract
  • Introduzione
  • Protocollo
  • Risultati
  • Discussione
  • Divulgazioni
  • Riconoscimenti
  • Materiali
  • Riferimenti
  • Ristampe e Autorizzazioni

Riepilogo

Per la comprensione della neoplasia è necessario lo sviluppo di modelli murini con geni specifici mutati nei pazienti affetti da cancro alla testa e al collo. Qui, presentiamo un protocollo per la trasformazione in vitro delle cellule primarie della lingua murina utilizzando un sistema adeno-associato al virus-Cas9 per generare linee cellulari MURine HNC con specifiche alterazioni genomiche.

Abstract

L'uso di cellule epiteliali normali primarie consente di indurre riproducibilmente alterazioni genomiche necessarie per la trasformazione cellulare introducendo mutazioni specifiche negli oncogeni e nei geni soppressori tumorali, utilizzando interspazii normativi raggruppati tecnologia di editing del genoma a breve ripetizione palindromica (CRISPR) nei topi. Questa tecnologia ci permette di imitare con precisione i cambiamenti genetici che si verificano nei tumori umani usando i topi. Trasformando geneticamente le cellule primarie del murino, possiamo studiare meglio lo sviluppo, la progressione, il trattamento e la diagnosi del cancro. In questo studio, abbiamo usato cellule epiteliali della lingua di topo Cas9 inducibili in Cre-inducibili per consentire l'editing del genoma utilizzando il virus adeno-associato (AAV) in vitro. In particolare, alterando KRAS, p53 e APC nelle normali cellule epiteliali della lingua, abbiamo generato una linea cellulare di cancro della testa e del collo murino (HNC) in vitro, che è cancerogena nei topi sinogene. Il metodo qui presentato descrive in dettaglio come generare linee cellulari HNC con specifiche alterazioni genomiche e spiega la loro idoneità per prevedere la progressione del tumore nei topi sinosgenici. Abbiamo immaginato che questo promettente metodo sarà informativo e utile per studiare la biologia del tumore e la terapia di HNC.

Introduzione

HNC è una malignità comune in tutto il mondo1. La modellazione della genesi della neoplasia HNC è attualmente a un punto di svolta scientifica2. Mentre molte mutazioni genetiche sono state identificate nell'HNC2,3,4 (ad esempio, TP53, PIK3CA, NOTCH1, FAT1 e RAS) le combinazioni specifiche di alterazioni genomiche necessarie in concerto per indurre HNC rimangono poco chiare.

L'attuale uso di linee cellulari umane di HNC ha contribuito in modo significativo a chiarire i meccanismi associati alla patogenesi e al trattamento3. Tuttavia, lo studio delle linee cellulari umane nei sistemi murini immunocompromessi ha i suoi limiti, perché questi sistemi non affrontano il processo neoplastico in vivo, il ruolo di specifiche mutazioni genetiche e le risposte al trattamento in un microambiente immunitario. Di conseguenza, lo sviluppo e la creazione di linee cellulari murine con specifiche alterazioni genetiche sono di primaria importanza per studiare come diversi geni contribuiscono al processo di trasformazione e per testare nuove terapie basate su molecole in topi immunocompetenti.

Gli studi sulle funzioni geniche nella ricerca biomedica sono stati significativamente influenzati dai progressi nelle tecnologie di editing del DNA, introducendo interruzioni a doppio filamento (DSB), per esempio5. Queste tecnologie, tra cui l'uso di nucleasi per dita di zinco, nucleasi effettore simili all'attivatore di trascrizione e brevi ripetizioni palindromiche regolatorie raggruppate (CRISPR/Cas9), consentono la manipolazione di qualsiasi gene di interesse nel suo locus. Gli ultimi sistemi CRISPR/Cas9 sono costituiti da una guida RNA (gRNA) che dirige la nucleacanda Cas9 per generare un DSB in un sito specifico del genoma. Questo sistema ha ottenuto un ampio riconoscimento nella modifica dei geni endogeni in qualsiasi cellula o tessuto bersaglio, anche negli organismi più tradizionalmente difficili da trattare5. Ha molteplici vantaggi rispetto ad altri sistemi grazie alla sua semplicità, velocità ed efficienza.

In oncologia, la tecnologia CRISPR/CAS9 ha soddisfatto la necessità di imitare efficacemente le cellule tumorali. Per stabilire questo sistema in HNC, abbiamo manipolato il potente oncogene KRAS e due importanti geni soppressori tumorali, APC e p536. Secondo il database GENIE7, questa combinazione è rara in HNC. Le mutazioni RAS (HRAS, NRAS e KRAS) sono presenti solo nel 7% di tutte le popolazioni di HNC. Questi tumori tendono ad essere resistenti alla terapia8,9.

La consegna di Cas9 e del suo gRNA si ottiene attraverso la trasduzione virale utilizzando AAV o lentivirus. L'AAV ricombinante è spesso il metodo preferito per fornire geni alle cellule bersaglio a causa del suo alto titro, della risposta immunitaria lieve, della capacità di trasdurli di un'ampia gamma di cellule e della sicurezza generale. Utilizzando un sistema AAV, sono state generate varie linee cellulari del topo specifiche del tessuto e nuove linee cellulari sono ancora in fase di sviluppo10,11,12. Tuttavia, rimane da sviluppare un efficiente sistema di editing genomico in grado di generare murini modelli di linee cellulari HNC. In questo studio, abbiamo cercato di sviluppare un sistema in vitro basato su AAV-Cas9 per trasformare le cellule primarie della lingua murina in uno stato tumorale. Questo protocollo unico di trasformazione CRISPR/Cas9 e la linea cellulare tumorale stabilita possono essere utilizzati per comprendere meglio la biologia dell'HNC indotta da una diversità di alterazioni genomiche.

Protocollo

Questo studio è stato approvato dall'Università Ben Gurion del Negev Animal Care and Use Committee. Gli esperimenti sugli animali sono stati approvati dall'IACUC (IL.80-12-2015 e DAL.29-05-2018(E)). Tutti gli aspetti della sperimentazione animale, dell'alloggio e delle condizioni ambientali utilizzate in questo studio erano conformi alla Guida per la cura el'usodegli animali da laboratorio 13 .

1. Produzione di virus associati ad Adeno

  1. Giorno 1: Coltura cellulare
    1. Seme 4 x 106 celle HEK293T per piastra 14,5 cm in 15 mL di DMEM. Preparare 10 piastre per la trasfezione con polietilenimine (PEI) (1 g/l).
  2. Giorno 2: Trasfezione di cellule HEK293T con PEI
    1. Rimuovere il supporto e rialimentarlo con DMEM 1 h caldo prima della trasfezione.
    2. Reagenti di trasfezione preriscaldata e DMEM.
    3. Utilizzare 10 g di plasmide di interesse contenente AAV ITR (AAV pCM109 EFS Cre sg APC sg P53- KRAS HDR), 10 g del plasmide a fladij AAV 2/9n (con il gene rep di AAV2 e il gene cap di AAV9, e 10 g del plasmide dell'helper (pAdDelta F5 helper) per piastra (vedere Tabella dei materiali).
      NOTA: è disponibile una nuova generazione di plasmide di supporto - pAdDeltaF614,15,16 che possono essere utilizzati anche per la produzione AAV.
    4. Mescolare i plasmidi in 1 mL di DMEM semplice per piastra. Aggiungete per breve tempo 90 l di polietilenimina (plasmide totale: concentrazione di PEI - 1:3) al mix e al vortice di plasmide.
    5. Incubare il mix di DNA PEI-plasmid per 20 min a temperatura ambiente (RT).
    6. Aggiungere il mix dropwise sopra le cellule HEK293T e trasferire le piastre all'incubatore di coltura cellulare a 37 s C con 5% DI CO2 per 24 h.
  3. Giorno 3: Cambio medio dopo la trasfezione
    1. Rimuovere completamente il mezzo e aggiungere 15 mL di DMEM fresco.
  4. Giorno 5: Raccogliere il virus
    1. Preparare un bagno di ghiaccio /etanolo secco.
    2. Raccogliere le cellule con un raschietto cellulare e trasferirle in tubi da 50 mL (2 piastre per tubo da 50 mL).
    3. Tubo di rotazione a 800 x g per 15 min a temperatura ambiente.
    4. Scartare il supernatante da tutti i tubi. Aggiungere 0,5 mL del buffer di lisi (150 mM NaCl, 50 mM MM Tris-HCl, pH - 8,5) per piastra (cioè 5 mL per 10 piastre) solo al primo tubo. Risospendere le cellule e trasferire il volume totale al tubo successivo e continuare fino all'ultimo tubo.
    5. Trasferire la sospensione cellulare in un tubo fresco da 50 mL. Lavare i tubi con lo stesso volume di tampone di lisi (0,5 mL per piastra) utilizzando lo stesso metodo di trasferimento descritto al punto 1.4.4.
    6. Sottoporre la sospensione cellulare a tre cicli di congelamento/scongelamento di 10 min tra un bagno di ghiaccio secco/etanolo e un bagno d'acqua di 37 gradi centigradi. Vortice brevemente dopo ogni scongelamento.
    7. Se la purificazione viene effettuata lo stesso giorno, impostare il buffer di equilibratzione ed eluizione (cfr. tabella 1 per la ricetta) su RT.
    8. Aggiungete 50 unità di benzonasi per piastra e incubate a 37 gradi centigradi per 1,5 h.
      NOTA: Il benzonasi viene utilizzato per digerire gli acidi nucleici residui dalle cellule del produttore ospite e il DNA plasmide presente nella sospensione cellulare.
    9. Girare i tubi a 3.000 x g per 15 min a 4 gradi centigradi.
    10. Raccogliere il supernatante in una siringa utilizzando un ago di acciaio 18 G e spingere la soluzione attraverso un filtro 0,45 m in un tubo da 15 mL per ottenere il lisato grezzo.
    11. Conservare il lisato grezzo a 4 gradi centigradi per alcune settimane fino alla purificazione o alla provificazione.

2. Purificazione AAV

  1. Giorno 5 o successivo
    1. Posizionare l'equilibratione e il tampone di eluizione in RT.
    2. Lavare le colonne di cromatografia con 10 mL del buffer di equilibratione.
    3. Aggiungere 0,5 mL per piastra di eparina-agarose alla colonna17 e quindi aggiungere il buffer di equilibrio (4 volte il volume dell'eparina-agarose). Mescolare le soluzioni invertendo la colonna e lasciare che il sedimento agarose.
    4. Eluso il buffer di equilibratione dalla colonna per gravità.
      NOTA: Lasciare un po 'di tampone di equilibration per evitare che l'agarose si secchi.
    5. Caricare il lisato grezzo sulla colonna e incubare per 2 h a 4 gradi centigradi con agitazione costante. Portare la colonna in posizione eretta e lasciare che l'agarose si sedimenti.
    6. Elute il lisato grezzo per gravità.
    7. Lavare la colonna con cuscinetto di equilibratore (4 volte il volume dell'eparina-agarose).
    8. Posizionare un filtro proteico centrifuga di 100 kDafugal sotto la colonna ed eluire il virus utilizzando un tampone di eluizione (3 volte il volume dell'eparina-agarose) nel filtro.
      NOTA: il buffer di eluizione non deve superare 15 mL.
    9. Centrifugare il filtro a 3.000 x g per 30 min fino a quando non viene lasciato meno di 1 mL nel filtro.
    10. Riempire il filtro con PBS e centrifugare a 3.000 x g per 30 min fino a quando non viene lasciato meno di 1 mL nel filtro. Ripetere questo passaggio 2x per rimuovere tutti i sali.
    11. Concentrare la soluzione del virus nel filtro per centrifugazione a 3.000 x g per arrivare ad un volume il più piccolo possibile (meno di 200 l).
    12. Aspirare la soluzione antivirus con ago e siringa e spingere la soluzione attraverso un filtro di 0,22 m in un tubo.
    13. Fare aliquote di particelle virali concentrate per lo stoccaggio.
      NOTA: Le aliquote devono essere di 20 gradi per l'immagazzinamento a breve termine a 4 gradi centigradi e di 5 gradi per lo stoccaggio a lungo termine a -80 gradi centigradi.
    14. Determinare il titra virale e l'efficienza della trasduzione virale come descritto in precedenza14,18,19,20.

3. Isolamento e coltura delle cellule primarie

  1. Giorno 1
    1. Eutanasia di un maschio o femmina di 6 settimane B6;129-Gt(ROSA)26Sortm1 (CAG-cas9, -EGFP)Fezh/J da CO2 asfissia o qualsiasi altro protocollo approvato IACUC.
      NOTA: questi topi knockin CRISPR/Cas9 hanno l'espressione dipendente dalla Cre ricombinante di cas9 endonuclease e EGFP diretta da un promotore CAG. La sequenza upstream Lox-Stop-Lox (LSL) presente nel genoma di questi topi impedisce l'espressione di Cas9 ed EGFP in assenza di Cre ricombinasi. Se utilizzati in combinazione con RNA a guida singola (sgRNA) e una fonte Cre, consentono l'editing di singoli o multipli geni di topo in vivo o ex vivo14.
    2. Dissezionare la lingua dai topi eutanasia utilizzando forbici chirurgiche.
    3. Dissociare manualmente il tessuto maciacquando il tessuto della lingua in frammenti molto piccoli utilizzando un bisturi. Raccogliere i frammenti di tessuto in un tubo da 15 mL contenente 4,5 ml di minimo indice (con siero esterno).
    4. Aggiungere il mix di triplo enzima (200 ol) (vedi tabella 1 per la ricetta) ai frammenti di tessuto.
    5. Incubare la miscela tessuto-enzima a 37 gradi centigradi per 30 min e toccare il tubo ogni 10 min per migliorare la dissociazione enzimatica del tessuto.
    6. Aggiungere il 5% di siero bovino fetale (FBS) contenente HBSS/PBS alla miscela tessuto-enzima per arrestare l'azione enzimatica.
    7. Filtrare la sospensione cellulare di cui sopra attraverso una rete sterile di nylon di 70 m per separare le cellule disperse e frammenti di tessuto più grandi.
    8. Lavare la sospensione filtrata delle cellule per centrifugazione per 300 x g per 5 min in HBSS/PBS a RT.
    9. Risospendere il pellet nel mezzo di coltura (10% FBS in RPMI/DMEM) e crescere in piatti di coltura 60 mm fino a formare colonie cellulari distinte.
      1. Aggregati di cellule di coltura mantenuti sopra il filtro in un piatto di coltura di 60 mm contenente 3 mL di supporti completi (10% FBS in RPMI/DMEM) fino a quando non si formano colonie cellulari.
    10. Microscopicamente esaminare le cellule primarie per la presenza di contaminazione fibroblasta dopo 1 settimana di coltura. Trattare le cellule primarie sviluppate da aggregati e sospensioni cellulari con 0,25 trypsin 0.02% soluzione EDTA a 37 s per 1 min per rimuovere i fibroblasti.
      NOTA: Di solito la coltura primaria degli aggregati cellulari produce più colonie rispetto alle sospensioni a cella singola. Le cellule di queste colonie forniscono una migliore efficienza di trasduzione con la trasduzione AAV.

4. Trasduzione AAV delle cellule primarie

  1. Giorno 10
    1. Seme 2 x 105 cellule primarie per pozzo in 6 piastre ben in 2 mL di supporto completo (10% FBS in RPMI / DMEM).
    2. Il giorno successivo, trasduci le cellule con 1012 genome/mL virale (1010 unità trasduttrici/mL) e incuba le cellule nei supporti contenenti particelle virali per 48 h a 37 .
    3. Rimuovere il supporto contenente particelle virali e nutrire le cellule trasdotte da AAV con supporti completi.
      NOTA: Solo le cellule che hanno subito la trasduzione esprimeranno GFP e inizieranno a proliferare. Le cellule che non hanno subito la trasduzione alla fine moriranno entro 2 settimane.
    4. Dopo 2 settimane di espansione della coltura, semina le cellule per la convalida e gli esperimenti in vivo tumorigenici.
      NOTA: Il DNA genomico proveniente dalle cellule trasdotte da AAV e dalle normali cellule primarie dei topi Cas9 è stato estratto per la convalida dell'editing del genoma specifico utilizzando protocolli standard. Il sequenziamento del DNA estratto e l'analisi dei dati sequenziati (Tabella 2) sono stati eseguiti utilizzando un saggio di sequenziamento basato sull'acquisizione di ibridazione (ad esempio, piattaforma MSK-IMPACT) come descritto in precedenza21.

5. Convalidare la trasformazione delle cellule normali in cellule tumorigene utilizzando l'immunofluorescenza e il gonfiore occidentale

  1. Immunofluorescenza
    1. Seme 2 x 105 cellule su 12 mm vetro coprelabbra e metterli in un'incubatrice durante la notte.
    2. Fissare le cellule in 4% paraformaldeide in PBS (pH 7.4) e processo per l'etichettatura immunofluorescenza.
    3. Incubare le cellule fisse con il primo anticorpo primario nell'1% di BSA o nell'1% del siero in PBST in una camera umidificata per 1 h a RT o durante la notte a 4 gradi centigradi. Gli anticorpi primari utilizzati sono il coniglio monoclonale anti-KRT 14, anticorpo monoclonale anti-E-cadherin coniglio e Cas9 topo mAb.
    4. Rimuovere la soluzione anticorpale primaria dai copricoperture lavando le cellule 3x per 5 min con 1x PBS.
    5. Incubare le cellule con anticorpi secondari Cy3 asini anti-coniglio IgG e/o Cy3 capra anti-topo IgG nel 5% BSA in PBST per 1 h a RT al buio.
    6. Rimuovere la soluzione anticorpale secondaria dai copricoproee e lavare le cellule 3x come descritto nel passaggio 5.1.4.
    7. Montare i copricopertine con una goccia di supporto di montaggio contenente DAPI (DAPI Fluoromount).
    8. Conservare al buio a 4 gradi centigradi fino a quando i vetrini non vengono immagine mediante microscopia a fluorescenza.
  2. Gonfiore occidentale
    1. Seme 1 x 106 cellule trasformate in un piatto di coltura 100 mm e metterle in un'incubatrice durante la notte.
    2. Lavare e raschiare le cellule trasformate in PBS freddo di ghiaccio da 200.
    3. Centrifugare il tubo contenente la sospensione cellulare per 10 min a 2.000 x g a 4 gradi centigradi per pelletare le cellule.
    4. Aspirare il supernatante e lividare le cellule utilizzando tampone di lisi (vedi tabella 1) contenente cocktail inibitori di fosforo e un inibitore della proteasi per 10 min a 4 gradi centigradi. Centrifugare i lisati per 10 min a 10.000 x g e 4 gradi centigradi e raccogliere le lismi cancellate.
    5. Utilizzare un kit di analisi Bradford disponibile in commercio per determinare la concentrazione di proteine secondo il protocollo del produttore. Utilizzare il buffer del campione 4x (500 mMM Tris pH : 6,8, 40% glicerolo, 8% SDS, 20% H2O, 0,02% di bromofenolo blu) per regolare i campioni di proteine a 0,5 o 1 g/ .
      NOTA: I campioni possono essere conservati a -80 gradi centigradi o fino a quando non viene eseguita un'analisi della macchia occidentale.
    6. Separare la stessa quantità di lisato totale (30 g) per 10% di sodio dodecyl solfato-poliacrite gel elettroforesi (SDS-PAGE). Assicurarsi che il colorante raggiunga il fondo del gel. Trasferire la proteina nella membrana di nylon svasando a 25 V per 30 min.
    7. Versare il 5% di BSA in salina (TBS) -0,1% Tween (TBST) sulla membrana per coprirlo completamente. Bloccare la membrana per 1 h a RT. Incubare il mebrane con anticorpi primari (anti-Cre, anti-Cas9, anti-GFP, anti-catenina, anti-phospho-ERK, e atto anti-z diluito nel 5% BSA TBST) a 4 gradi durante la notte.
    8. Dopo l'incubazione, lavare le membrane per 10 min con 1x TBST assicurandosi che la soluzione copra completamente la membrana. Eseguire questo lavaggio 3x, quindi aggiungere anticorpo secondario coniugato perossidasi (HRP) di rafano (diluito 1:10,000 nel 5% BSA TBST) alla membrana. Incubare per 1 h a RT.
    9. Dopo l'incubazione, lavare le membrane per 10 min con 1x TBST assicurandosi che la soluzione copra completamente la membrana. Eseguire la chemiluminescenza (vedere Tabella dei materiali) per esporre le bande e acquisire le immagini di conseguenza.
  3. Convalidare il potenziale cancerogeno delle cellule trasformate in topi immunocompetenti
    NOTA: I topi sono stati mantenuti e trattati secondo le linee guida istituzionali dell'Università Ben-Gurion del Negev. Cenno. CB17-Prkdc-scid/NCr Hsd (NOD. SCID) e c57BL/6 topi sono stati utilizzati per gli studi in vivo. I topi erano alloggiati in armadi a flusso laminare filtrati ad aria con un ciclo di 12 ore luce / buio e sono stati alimentati con cibo e acqua ad libitum.
    1. Utilizzare 6-8 settimane-vecchio NOD femminile. CB17-Prkdc-scid/NCr Hsd (NOD. SCID) e Topi C57BL/6 per lo studio.
    2. Prova a fare clic su apposta le celle trasformate AAV-Cas9. Interrompere la prova utilizzando DMEM preriscaldato a 37 gradi centigradi e raccogliere in un tubo da 50 mL.
    3. Centrifugare il tubo a 800 x g per 10 min a temperatura ambiente. Eliminare il supernatante e risospendere il pellet cellulare nel mezzo DMEM senza FBS. Eseguire nuovamente la centrifugazione e risospendere il pellet cellulare in 1x PBS.
      NOTA: non mantenere le celle in 1x PBS per troppo tempo. Mantenere sempre la sospensione cellulare sul ghiaccio per evitare l'agglomeramento delle cellule.
    4. Utilizzare un contatore cellulare automatico per contare le cellule e diluire le cellule alla concentrazione desiderata (2,5 x 107 celle/mL) utilizzando 1x PBS. Generare tumori attraverso un'iniezione sottocutanea della sospensione cellulare trasformata AAV-Cas9 nel fianco destro di ogni NOD. CB17-Prkdc-scid/NCr Hsd (NOD. SCID) mouse (2 x 106 celle/topo). Per generare un modello ortotropico nei topi sinogene, iniettare le cellule primarie 0,5 x 106 o le cellule trasformate AAV-Cas9 nella lingua dei topi immunocompetenti C57BL/6.
    5. Eutanasia gli animali 2 settimane dopo l'iniezione da CO2 asfissia, e sezionare i tumori dai topi eutanasia per l'analisi immunoistochimica.

Risultati

Utilizzo del sistema AAV per trasformare le normali celle Cas9
La figura 1 fornisce una mappa vettoriale dettagliata del plasmide transgene AAV utilizzato in questo studio. Figura 2 delinea la progettazione e il funzionamento del sistema basato AAV-Cas9. Per produrre particelle virali, le cellule HEK293T sono state trafette con il vettore transgene AAV e altri vettori di imballaggio virali utilizzando il metod...

Discussione

Diversi metodi sono stati precedentemente utilizzati per trasformare le cellule primarie nella coltura con gradi variabili di successo25,26,27,28. La maggior parte di questi metodi utilizza cellule fibroblaste di topi per la trasformazione14,17,18,19 o utilizzare agen...

Divulgazioni

M.S. fa parte dell'Advisory Board dell'Istituto di Bioscienze e Menarini Ricerche ha ricevuto fondi di ricerca da Puma Biotechnology, Daiichi-Sankio, Targimmune, Immunomedics e Menarini Ricerche. M.S. è anche co-fondatrice di Medendi Medical Travel, e negli ultimi 2 anni, ha ricevuto onorarida da Menarini E ADC Pharma. Tutti gli altri autori non hanno nulla da rivelare.

Riconoscimenti

Desideriamo ringraziare il Dr. Daniel Gitler per averci fornito il pAd Delta 5 Helper plasmid. Questo lavoro è stato finanziato dalla Israel Science Foundation (ISF, 700/16) (per me), dalla United States-Israel Binational Science Foundation (BSF, 2017323) (per ME e MS), dalla Israel Cancer Association (ICA, 20170024) (per ME), dalla Israel Cancer Research Foundation (ICRF, 17-1693-RCDA) (per ME) e dalla Concern #7895 (ME). Fellowship: la borsa di studio Alon a ME e BGU Kreitman a SJ e MP.

Materiali

NameCompanyCatalog NumberComments
Antibodies
Anti mouse HRPJackson ImmunoResearch115-035-146
Anti rabbit HRPJackson ImmunoResearch711-035-152
Cas9 Mouse mAbCell Signaling Technology14697
CreBioLegend900901
Cy3-AffiniPure Goat Anti-Mouse IgGJackson ImmunoResearch115-165-062
Cy-AffiniPure Goat Anti-Rabbit IgGJackson ImmunoResearch111-165-144
GFPSanta Cruz Biotechnologysc-9996
Phospho-p44/42 MAPK (Erk1/2)Cell Signaling Technology4370
Rabbit monoclonal anti E cadherinCell Signaling Technology3195S
Rabbit monoclonal anti-KRT 14AbcamAB-ab181595
β actinMP Biomedicals691001
β cateninCell Signaling Technology9582S
Cell lines
HEK93TATCCCRL-3216
Culture Media, Chemicals and Reagents
Bradford ReagentBio-Rad30015484
BSAAmresco0332-TAM-50G
DAPI fluoromountSouthern Biotech0100-20
DMEMBiological Industries Israel Beit-Haemek Ltd.01-055-1A
ECL (Westar Supernova and Westar Nova 2.0)CyanagenXLS3.0100 and XLS071.0250
FBSBiological Industries Israel Beit-Haemek Ltd.04-127-1A
HBSSSigmaH6648
Heparin - AgaroseSigmaH6508
Isolate II Genomic DNA KitBiolineBIO-52066
MgCl2Panreac AppliChem300283
NaClBio Lab Ltd1903059100
PBSBiological Industries Israel Beit-Haemek Ltd.02-023-1A
PEIPolysciences23966-1
Pen Strep SolutionBiological Industries Israel Beit-Haemek Ltd.03-031-1B
PFASanta Cruz Biotechnology30525-89-4
Phosphatase inhibitor cocktailBiotoolB15001A/B
Protease inhibitor cocktailMilliporeSigmaP2714-1BTL
Tris bufferMERCK Millipore648311-1KG
Enzymes
BenzonaseSigmaE1014
Collagenase IVThermo Fisher Scientific17104019
DNAseThermo Fisher Scientific18047019
HyaluronidaseMilliporeSigmaH3506
TrypsinBiological Industries Israel Beit-Haemek Ltd.03-050-1B
Glass wares
Cover slipsBar NaorBNCB00130RA1
SlidesBar NaorBN9308C
Mouse strains
C57BL/6Envigo
B6;129-Gt(ROSA)26Sortm1(CAG-cas9*,-EGFP)Fezh/JJackson labs24857
NOD.CB17-Prkdc-scid/NCr Hsd (Nod.Scid)Envigo
Plasmids
AAV pCM109 EFS Cre sg APC sg Kras sg P53- Kras HDRBroad Institute of MITKind gift from Dr Randall J Platt and Dr. Joseph Rosenbluh, Broad Institute of MIT and Harvard, Cambridge, MA 02142, USA
AAV 2/9 capsid vectorAddgene112865
pAD Delta F5 helperBen Gurion University of the NegevProvided by Dr Daniel Gitler, Department of Physiology and Cell Biology, Faculty of Health Sciences, and Zlotowski Center for Neuroscience, Ben-Gurion University of the Negev, Beer-Sheva 84105, Israel.
Plastic wares
Amicon-ULTRA filter 100 KDaMilliporeUFC910024
0.22 µm sterile filters, 4 mmMillexSLGV004SL
0.45 µm sterile filters, 13 mmMillexSLHV013SL
Culture platesGreiner Bio-One
Falcon tubesGreiner Bio-One

Riferimenti

  1. Reyes-Gibby, C. C., et al. Genome-wide association study identifies genes associated with neuropathy in patients with head and neck cancer. Scientific Reports. 8 (1), 8789 (2018).
  2. Riaz, N., Morris, L. G., Lee, W., Chan, T. A. Unraveling the molecular genetics of head and neck cancer through genome-wide approaches. Genes & Diseases. 1 (1), 75 (2014).
  3. Leemans, C. R., Snijders, P. J. F., Brakenhoff, R. H. The molecular landscape of head and neck cancer. Nature Reviews Cancer. 18 (5), 269-282 (2018).
  4. Jiang, X., Ye, J., Dong, Z., Hu, S., Xiao, M. Novel genetic alterations and their impact on target therapy response in head and neck squamous cell carcinoma. Cancer Management and Research. 11, 1321-1336 (2019).
  5. Im, W., Moon, J., Kim, M. Applications of CRISPR/Cas9 for Gene Editing in Hereditary Movement Disorders. Journal of Movement Disorders. 9 (3), 136-143 (2016).
  6. Li, H., et al. Genomic analysis of head and neck squamous cell carcinoma cell lines and human tumors: a rational approach to preclinical model selection. Molecular Cancer Research: MCR. 12 (4), 571-582 (2014).
  7. AACR Project GENIE Consortium, T.A.P.G.. AACR Project GENIE: Powering Precision Medicine through an International Consortium. Cancer Discovery. 7 (8), 818-831 (2017).
  8. Suh, Y., Amelio, I., Guerrero Urbano, T., Tavassoli, M. Clinical update on cancer: molecular oncology of head and neck cancer. Cell Death & Disease. 5 (1), e1018 (2014).
  9. Anderson, J. A., Irish, J. C., Ngan, B. Y. Prevalence of RAS oncogene mutation in head and neck carcinomas. The Journal of Otolaryngology. 21 (5), 321-326 (1992).
  10. Ryals, R. C., Boye, S. L., Dinculescu, A., Hauswirth, W. W., Boye, S. E. Quantifying transduction efficiencies of unmodified and tyrosine capsid mutant AAV vectors in vitro using two ocular cell lines. Molecular Vision. 17, 1090-1102 (2011).
  11. Smith-Arica, J. R., et al. Infection Efficiency of Human and Mouse Embryonic Stem Cells Using Adenoviral and Adeno-Associated Viral Vectors. Cloning and Stem Cells. 5 (1), 51-62 (2003).
  12. Li, J., Xiao, X., Kenniston, T., Kudlow, J., Giannoukakis, N. AAV Vectors. Molecular Therapy. 3 (5), S174-S192 (2001).
  13. Institute of Laboratory Animal Resources (U.S.). . Guide for the care and use of laboratory animals. , (1996).
  14. Platt, R. J., et al. CRISPR-Cas9 knockin mice for genome editing and cancer modeling. Cell. 159 (2), 440-455 (2014).
  15. Zhang, Y., Chirmule, N., Gao, G. P., Wilson, J. CD40 ligand-dependent activation of cytotoxic T lymphocytes by adeno-associated virus vectors in vivo: role of immature dendritic cells. Journal of Virology. 74 (17), 8003-8010 (2000).
  16. Xiao, X., Li, J., Samulski, R. J. Production of high-titer recombinant adeno-associated virus vectors in the absence of helper adenovirus. Journal of Virology. 72 (3), 2224-2232 (1998).
  17. Auricchio, A., Hildinger, M., O'Connor, E., Gao, G. P., Wilson, J. M. Isolation of Highly Infectious and Pure Adeno-Associated Virus Type 2 Vectors with a Single-Step Gravity-Flow Column. Human Gene Therapy. 12 (1), 71-76 (2001).
  18. Lock, M., et al. Characterization of a Recombinant Adeno-Associated Virus Type 2 Reference Standard Material. Human Gene Therapy. 21 (10), 1273 (2010).
  19. Challis, R. C., et al. Systemic AAV vectors for widespread and targeted gene delivery in rodents. Nature Protocols. 14 (2), 379-414 (2019).
  20. Rabinowitz, J. E., et al. Cross-packaging of a single adeno-associated virus (AAV) type 2 vector genome into multiple AAV serotypes enables transduction with broad specificity. Journal of Virology. 76 (2), 791-801 (2002).
  21. Cheng, D. T., et al. Memorial Sloan Kettering-Integrated Mutation Profiling of Actionable Cancer Targets (MSK-IMPACT). The Journal of Molecular Diagnostics. 17 (3), 251-264 (2015).
  22. Sun, H., Taneja, R. Analysis of Transformation and Tumorigenicity Using Mouse Embryonic Fibroblast Cells. Cancer Genomics and Proteomics. 383, 303-310 (2007).
  23. Durkin, M., Qian, X., Popescu, N., Lowy, D. Isolation of Mouse Embryo Fibroblasts. BIO-PROTOCOL. 3 (18), (2013).
  24. Jozefczuk, J., Drews, K., Adjaye, J. Preparation of Mouse Embryonic Fibroblast Cells Suitable for Culturing Human Embryonic and Induced Pluripotent Stem Cells. Journal of Visualized Experiments. (64), e3854 (2012).
  25. Boehm, J. S., Hession, M. T., Bulmer, S. E., Hahn, W. C. Transformation of Human and Murine Fibroblasts without Viral Oncoproteins. Molecular and Cellular Biology. 25 (15), 6464 (2005).
  26. Gupta, T., Sáenz Robles, T. M., Pipas, J. M. Cellular transformation of mouse embryo fibroblasts in the absence of activator E2Fs. Journal of Virology. 89 (9), 5124-5133 (2015).
  27. Leong, H., Blewitt, M. Retrovirus Mediated Malignant Transformation of Mouse Embryonic Fibroblasts. BIO-PROTOCOL. 3 (15), (2013).
  28. Parikh, N., Nagarajan, P., Sei-ichi, M., Sinha, S., Garrett-Sinha, L. A. Isolation and characterization of an immortalized oral keratinocyte cell line of mouse origin. Archives of Oral Biology. 53 (11), 1091-1100 (2008).
  29. Badarni, M., et al. Repression of AXL expression by AP-1/JNK blockage overcomes resistance to PI3Ka therapy. JCI Insight. 5, 125341 (2019).
  30. Chen, Y. F., et al. Establishing of mouse oral carcinoma cell lines derived from transgenic mice and their use as syngeneic tumorigenesis models. BMC Cancer. 19 (1), 281 (2019).
  31. Hoover, A. C., et al. The Role of Human Papillomavirus 16 E6 in Anchorage-Independent and Invasive Growth of Mouse Tonsil Epithelium. Archives of Otolaryngology-Head & Neck Surgery. 133 (5), 495 (2007).
  32. Smahel, M., et al. Metastatic MHC class I-negative mouse cells derived by transformation with human papillomavirus type 16. British Journal of Cancer. 84 (3), 374-380 (2001).
  33. He, L., et al. Increased Growth of a Newly Established Mouse Epithelial Cell Line Transformed with HPV-16 E7 in Diabetic Mice. PloS One. 11 (10), e0164490 (2016).

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