JoVE Logo
Autores
Entre em contato

Entrar

É necessária uma assinatura da JoVE para visualizar este conteúdo. Faça login ou comece sua avaliação gratuita.

Neste Artigo

  • Resumo
  • Resumo
  • Introdução
  • Protocolo
  • Resultados
  • Discussão
  • Divulgações
  • Agradecimentos
  • Materiais
  • Referências
  • Reimpressões e Permissões

Resumo

O desenvolvimento de modelos de urina com genes específicos mutados em pacientes com câncer de cabeça e pescoço é necessário para a compreensão da neoplasia. Aqui, apresentamos um protocolo para a transformação in vitro das células primárias da língua murina usando um sistema de vírus-Cas9 associado ao adeno para gerar linhas celulares murine HNC com alterações genômicas específicas.

Resumo

O uso de células epiteliais normais primárias torna possível induzir reprodutivelmente alterações genômicas necessárias para a transformação celular através da introdução de mutações específicas em oncogenes e genes supressores tumorais, usando interespaçados regulamentares agrupados repetição palindrômica curta (CRISPR) baseado em tecnologia de edição do genoma em ratos. Esta tecnologia nos permite imitar com precisão as mudanças genéticas que ocorrem em cânceres humanos usando ratos. Ao transformar geneticamente as células primárias de urina, podemos estudar melhor o desenvolvimento do câncer, progressão, tratamento e diagnóstico. Neste estudo, usamos células epiteliais de língua de camundongo Cas9 indutoras para permitir a edição do genoma usando vírus associado ao adeno (AAV) in vitro. Especificamente, alterando KRAS, p53 e APC em células epiteliais normais da língua, geramos uma linha celular de câncer de murine na cabeça e no pescoço (HNC) in vitro, que é tumorigenic em camundongos singênticos. O método apresentado aqui descreve em detalhes como gerar linhas celulares HNC com alterações genômicas específicas e explica sua adequação para prever a progressão tumoral em camundongos singênicos. Nós imaginamos que este método prometedor será informativo e útil estudar a biologia e a terapia do tumor de HNC.

Introdução

HNC é uma malignidade comum em todo o mundo1. Modelar a gênese da neoplasia hnc está atualmente em um ponto de viragem científica2. Enquanto muitas mutações genéticas foram identificadas no HNC2,3,4 (por exemplo, TP53, PIK3CA, NOTCH1, FAT1 e RAS) as combinações específicas de alterações genômicas necessárias em conjunto para induzir o HNC permanecem obscuras.

O uso atual de linhas celulares humanas hnc tem ajudado significativamente a elucidar os mecanismos associados com patogênese e tratamento3. No entanto, o estudo das linhas celulares humanas em sistemas de urina imunocomprometida tem suas limitações, porque esses sistemas não abordam o processo neoplástico in vivo, o papel de mutações genéticas específicas e respostas de tratamento em um microambiente imunológico. Assim, o desenvolvimento e o estabelecimento de linhas celulares de urina com alterações genéticas específicas são de importância primária para estudar como diferentes genes contribuem para o processo de transformação e testar novas terapias baseadas em moléculas em camundongos imunocompetentes.

Estudos de função gênica em pesquisa biomédica têm sido significativamente afetados pelos avanços nas tecnologias de edição de DNA, introduzindo quebras de cadeia dupla (DSBs), porexemplo, 5. Essas tecnologias, incluindo o uso de nucleases de dedos de zinco, nucleases de efetores efetivos semelhantes a ativadores de transcrição e repetições palindrômicas curtas interespaçadas e agrupadas (CRISPR/Cas9), permitem a manipulação de qualquer gene de interesse em seu locus. Os mais recentes sistemas CRISPR/Cas9 são compostos por um RNA guia (gRNA) que direciona a nuclease Cas9 para gerar um DSB em um local específico do genoma. Este sistema ganhou amplo reconhecimento na modificação de genes endógenos em qualquer célula ou tecido alvo, mesmo nos organismos mais tradicionalmente difíceis de tratar5. Ele tem múltiplas vantagens sobre outros sistemas devido à sua simplicidade, velocidade e eficiência.

Em oncologia, a tecnologia CRISPR/CAS9 cumpriu a necessidade de imitar efetivamente as células cancerosas. Para estabelecer este sistema em HNC, manipulamos o potente oncogene KRAS e dois genes supressores tumorais importantes, APC e p536. De acordo com o banco de dadosgenie 7, esta combinação é rara no HNC. Mutações RAS (HRAS, NRAS e KRAS) estão presentes em apenas ~7% de todas as populações de HNC. Estes tumores tendem a ser resistentes à terapia8,9.

A entrega de Cas9 e seu gRNA é alcançada através da transdução viral usando AAVs ou lentivírus. O AAV recombinante é muitas vezes o método preferido para fornecer genes para células-alvo devido ao seu alto díter, resposta imune leve, capacidade de transduzir uma ampla gama de células e segurança geral. Usando um sistema AAV, várias linhas de células de camundongos específicas do tecido foram geradas, e novas linhas celulares ainda estão sendo desenvolvidas10,11,12. No entanto, um sistema de edição genômica eficiente que pode gerar células modelos de linha celular MNC murine continua a ser desenvolvida. Neste estudo, procuramos desenvolver um sistema in vitro baseado em AAV-Cas9 para transformar as células primárias da língua de urina em um estado tumorigenic. Este protocolo de transformação CRISPR/Cas9 único e a linha de células tumorais estabelecidas podem ser usados para entender melhor a biologia do HNC induzida por uma diversidade de alterações genômicas.

Protocolo

Este estudo foi aprovado pela Universidade Ben Gurion do Negev Animal Care and Use Committee. Experimentos com animais foram aprovados pela IACUC (IL.80-12-2015 e IL.29-05-2018 (E)). Todos os aspectos dos testes em animais, habitação e condições ambientais utilizadas neste estudo foram em conformidade com o Guia para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório13.

1. Produção de vírus associada a Adeno

  1. Dia 1: Cultura celular
    1. Sementes 4 x 106 células HEK293T por placa de 14,5 cm em 15 mL de DMEM. Prepare 10 placas para transfecção com polietiletilimina (PEI) (1 μg/μL).
  2. Dia 2: Transfecção de células HEK293T usando PEI
    1. Retire a mídia e refeed com DMEM quente 1 h antes da transfecção.
    2. Reagentes de transfecção pré-enxame e DMEM.
    3. Use 10 μg do plasmídeo de interesse contendo AAV ITR (AAV pCM109 EFS Cre sg APC sg KRAS sg P53- KRAS HDR), 10 μg do AAV 2/9n capsid plasmid (com o gene de representação de AAV2 e o gene do tampão de AAV9, e 10 μg do plasmid do ajudante (ajudante do F5 do pAdDelta) por a placa (veja a tabela dos materiais).
      NOTA: Uma nova geração de plasmid ajudante - pAdDeltaF614,15,16 que também pode ser usado para a produção de AAV está disponível.
    4. Misture os plasmídeos em 1 mL de DMEM simples por placa. Em seguida, adicione 90 μL de polietilenomina (plasmídeo total: concentração PEI = 1:3) para a mistura plasmídeo e vórtice brevemente.
    5. Incubar a mistura de DNA PEI-plasmid por 20 min à temperatura ambiente (RT).
    6. Adicione a mistura dropwise em cima das células HEK293T e transfira as placas para a incubadora de cultura celular em 37 °C com 5% de CO2 para 24 h.
  3. Dia 3: Mudança média após transfecção
    1. Retire o meio completamente e adicione 15 mL de DMEM fresco.
  4. Dia 5: Colhendo o vírus
    1. Prepare um banho seco de gelo/etanol.
    2. Coletar as células com um raspador de células e transferi-los para tubos de 50 mL (2 placas por tubo de 50 mL).
    3. Tubos de spin a 800 x g por 15 min à temperatura ambiente.
    4. Descarte o supernatant de todos os tubos. Adicione 0,5 mL do buffer de lofe (150 mM NaCl, 50 mM Tris-HCl, pH = 8,5) por placa (ou seja, 5 mL para 10 placas) apenas para o primeiro tubo. Resuspenda as células e transfira o volume total para o próximo tubo e continue até o último tubo.
    5. Transfira a suspensão celular para um tubo fresco de 50 mL. Lave os tubos com o mesmo volume de dbuffer de lyse (0,5 mL por placa) usando o mesmo método de transferência descrito na etapa 1.4.4.
    6. Subme a suspensão celular a três rodadas de ciclos de congelamento/degelo de ~10 min entre um banho seco de gelo/etanol e um banho de água de 37 °C. Vórtice brevemente após cada descongelamento.
    7. Se a purificação for realizada no mesmo dia, defina o tampão de equilíbrio e elução (ver Tabela 1 para a receita) na RT.
    8. Adicione 50 unidades de benzonase por placa e incubar a 37 °C para 1,5 h.
      NOTA: Benzonase é usado para digerir ácidos nucleic residuais das células produtoras hospedeiras e do DNA plasmídeo presente na suspensão celular.
    9. Gire os tubos a 3.000 x g por 15 min a 4 °C.
    10. Colete o supernatant em uma seringa usando uma agulha de aço 18 G e empurre a solução através de um filtro de 0,45 μm em um tubo de 15 mL para obter o lysate bruto.
    11. Guarde o lysate bruto em 4 °C por algumas semanas até a purificação ou continuar a purificação.

2. Purificação aAV

  1. Dia 5 ou depois
    1. Coloque o tampão de equilíbrio e elução na RT.
    2. Lave colunas de cromatografia com 10 mL do amortecedor de equilíbrio.
    3. Adicione 0,5 mL por placa de heparina-agarose à coluna17 e, em seguida, adicione o buffer de equilíbrio (4x o volume da heparina-agarose). Misture as soluções invertendo a coluna e deixe o sedimento agarose.
    4. Elute o amortecedor de equilíbrio da coluna pela gravidade.
      NOTA: Deixe algum amortecedor de equilíbrio para evitar que a agarose seque.
    5. Carregue o lysate cru sobre a coluna e incubar por 2 h a 4 °C com agitação constante. Traga a coluna em uma posição ereta e permita que a agarose aos sedimentos.
    6. Lute o liceu bruto pela gravidade.
    7. Lave a coluna com tampão de equilíbrio (4x o volume da heparina-agarose).
    8. Coloque um filtro de proteína centrífuga de 100 kDa abaixo da coluna e alute o vírus usando um buffer de elução (3x o volume da heparina-agarose) no filtro.
      NOTA: O buffer de elução não deve exceder 15 mL.
    9. Centrífuga o filtro em 3.000 x g para ~ 30 min até menos de 1 mL é deixado no filtro.
    10. Encha o filtro com PBS e centrífuga a 3.000 x g por ~ 30 min até menos de 1 mL é deixado no filtro. Repita este passo 2x para remover todos os sais.
    11. Concentre a solução do vírus no filtro por centrífuga a 3.000 x g para chegar a um volume tão pequeno quanto possível (menos de 200 μL).
    12. Aspeto a solução do vírus com uma agulha e seringa e empurre a solução através de um filtro de 0,22 μm em um tubo.
    13. Faça alíquotas de partículas virais concentradas para armazenamento.
      NOTA: Os alíquotas devem ser ~20 μL para armazenamento a curto prazo em 4 °C e ~5 μL para armazenamento a longo prazo em -80 °C.
    14. Determine o titer viral e a eficiência viral da transdução como descrito previamente14,18,19,20.

3. Isolamento e cultura das células primárias

  1. Dia 1
    1. Eutanásia um B6;129-Gt (ROSA)26Sortm1 (CAG-cas9*,-EGFP)Fezh/J por asfixia de CO2 ou qualquer outro protocolo aprovado pela IACUC.
      NOTA: Estes camundongos knockin CRISPR/Cas9 têm expressão dependente de crecombinase de endonuclease cas9 e EGFP dirigido por um promotor CAG. A sequência de Lox-Stopx (LSL) a montante, presente no genoma destes ratinhos, impede a expressão de Cas9 e EGFP na ausência de Cre recombinando. Quando usados em combinação com RNAs guia único (sgRNAs) e uma fonte Cre, eles permitem a edição de genes de camundongos individuais ou múltiplos in vivo ou ex vivo14.
    2. Dissecar a língua dos ratos eutanasiados usando tesoura cirúrgica.
    3. Dissociar manualmente o tecido, cendendo o tecido da língua em fragmentos muito pequenos usando um bisturi. Colete os fragmentos de tecido em um tubo de 15 mL contendo 4,5 ml de rpmi médio simples (com soro fora).
    4. Adicione a mistura de enzimatrips (200 μl) (ver Tabela 1 para a receita) aos fragmentos de tecido.
    5. Incubar a mistura tissue-enzima em 37 °C para 30 min e toque o tubo a cada 10 min para melhorar a dissociação enzimática do tecido.
    6. Adicione 5% de soro bovino fetal (FBS) contendo HBSS/PBS à mistura de enzimas de tecido para parar a ação enzimática.
    7. Filtre a suspensão celular acima através de uma malha de nylon estéril de 70 μm para separar as células dispersas e fragmentos de tecido maiores.
    8. Lave a suspensão celular filtrada por centrífuga por 300 x g por 5 min em HBSS/PBS na RT.
    9. Resuspenda a pelota no meio da cultura (10% FBS em RPMI/DMEM) e cresça em pratos da cultura de 60 milímetros até que as colônias distintas da pilha estejam dadas forma.
      1. Agregados de células culturais retidos em cima do filtro em um prato de cultura de 60 mm contendo 3 mL de mídia completa (10% FBS em RPMI/DMEM) até que as colônias celulares sejam formadas.
    10. Microscópico examinar as células primárias para a presença de contaminação por fibroblasto após 1 semana de cultura. Trate as células primárias desenvolvidas a partir de agregados e suspensões celulares com 0,25 solução EDTA de 0,02% a 37 °C por 1 min para remover fibroblastos.
      NOTA: Normalmente, a cultura primária dos agregados celulares produz mais colônias em comparação com suspensões unicelulares. As células dessas colônias fornecem melhor eficiência de transdução com transdução a AAV.

4. Transdução de AAV de células primárias

  1. Dia 10
    1. Semente 2 x 105 células primárias por poço em 6 placas de poço em 2 mL de mídia completa (10% FBS em RPMI/DMEM).
    2. No dia seguinte, transduza as células com 1012 genoma/mL viral (1010 unidades transducantes/mL) e incubam as células em meios contendo partículas virais por 48 h a 37 °C.
    3. Remova os meios de maquilista virais e alimente as células transinduzidas pelo AAV com mídia completa.
      NOTA: Somente as células que foram submetidas à transdução expressarão GFP e começarão a proliferar. As células que não sofreram transdução acabarão por morrer dentro de 2 semanas.
    4. Após 2 semanas de expansão da cultura, as células de semeadura para validação e os experimentos in vivo tumorigenic.
      NOTA: O DNA genômico das células transpolitadas com AAAV e células primárias normais de camundongos Cas9 foram extraídos para validar a edição específica do genoma usando protocolos padrão. O sequenciamento do DNA extraído e a análise dos dados sequenciados(Tabela 2)foram realizados por meio de um ensaio de sequenciamento de captura de hibridização baseada em captação (por exemplo, plataforma MSK-IMPACT) conforme descrito anteriormente21.

5. Validando a transformação de células normais para células tumorigenic usando imunofluorescência e borrão ocidental

  1. Imunofluorescência
    1. Semente 2 x 105 células em 12 mm de vidro coverslips e colocá-los em uma incubadora durante a noite.
    2. Fixar células em paraformaldeído de 4% na PBS (pH = 7,4) e processo de rotulagem de imunofluorescência.
    3. Incubar as células fixas com o primeiro anticorpo primário em 1% de Soro BSA ou 1% em PBST em uma câmara umidificada por 1 h em RT ou durante a noite em 4 °C. Os anticorpos primários utilizados são o coelho monoclonal anti-KRT 14, anticorpo anti-E-cadherin monoclonal de coelho e mAb de rato Cas9.
    4. Retire a solução primária de anticorpos dos lábios covers, lavando as células 3x por 5 min com 1x PBS.
    5. Incubar as células com Cy3 burro anti-coelho IgG e / ou cabra Cy3 anti-mouse IgG anticorpos secundários em 5% BSA em PBST por 1 h em RT no escuro.
    6. Retire a solução de anticorpos secundários dos lábios e lave as células 3x conforme descrito na etapa 5.1.4.
    7. Monte os lábios com uma gota de montagem média contendo DAPI (DAPI Fluoromount).
    8. Guarde no escuro a 4 °C até que os slides sejam imagemdos usando microscopia de fluorescência.
  2. Manchaocidental
    1. Semente 1 x 106 células transformadas em um prato de cultura de 100 mm e colocá-los em uma incubadora durante a noite.
    2. Lave e raspe as células transformadas em 200 μl gelo frio PBS.
    3. Centrífuga o tubo contendo a suspensão celular por 10 min a 2.000 x g a 4 °C para dota as células.
    4. Aspirar o supernatant e lyse as células usando tampão de lofe (ver Tabela 1)contendo coquetéis inibidores de fósforo e um inibidor de protease por 10 min a 4 °C. Centrífuga sacia das lysates por 10 min a 10.000 x g e 4 °C e recolher os lysates limpos.
    5. Use um kit de ensaio de Bradford comercialmente disponível para determinar a concentração de proteínas seguindo o protocolo do fabricante. Use buffer de amostra 4x (500 mM Tris pH = 6,8, 40% glicerol, 8% SDS, 20% H2O, 0,02% bromehenol azul) para ajustar as amostras de proteína para 0,5 ou 1 μg/μL. Ferva a 96 °C por 5 min.
      NOTA: As amostras podem ser armazenadas a -80 °C ou até que uma análise de borrão ocidental seja realizada.
    6. Quantidades iguais separadas de lisato total (30 μg) por 10% de sulfato dodecyl-poliacrilamida gel (SDS-PAGE). Certifique-se de que o tinumodo atinja o fundo do gel. Transfira a proteína para a membrana de nylon por borrão semi-seco em 25 V por 30 min.
    7. Despeje 5% BSA em Tris-buffered salina (TBS) -0,1% Tween (TBST) sobre a membrana para cobri-lo completamente. Bloqueie a membrana por 1 h na RT. Incubar a mebrane com anticorpos primários (anti-Cre, anti-Cas9, anti-GFP, catetenina anti-β, anti p53, anti-fosfo-ERK e anti-β actin diluído em 5% BSA TBST) a 4 °C durante a noite.
    8. Após a incubação, lave as membranas por 10 min com 1x TBST certificando-se de que a solução cobre a membrana completamente. Realize esta lavagem 3x e, em seguida, adicione peroxidase de rábano (HRP) anticorpo secundário conjugado (diluído 1:10,000 em 5% BSA TBST) para a membrana. Incubar por 1 h em RT.
    9. Após a incubação, lave as membranas por 10 min com 1x TBST certificando-se de que a solução cobre a membrana completamente. Realize as imagens chemiluminescence (ver Tabela de Materiais)para expor as bandas, e capturar imagens em conformidade.
  3. Validando o potencial tumorigenic de pilhas transformadas em ratos imunocompetentes
    NOTA: Os ratos foram mantidos e tratados de acordo com as diretrizes institucionais da Universidade Ben-Gurion do Negev. Aceno. CB17-Prkdc-scid/NCr Hsd (NOD. Camundongos SCID) e C57BL/6 foram utilizados para os estudos in vivo. Os ratos foram alojados em armários de fluxo laminar filtrados pelo ar com um ciclo claro/escuro de 12 horas e foram alimentados com comida e água ad libitum.
    1. Use 6-8 semanas de idade nod feminino. CB17-Prkdc-scid/NCr Hsd (NOD. SCID) e camundongos C57BL/6 para o estudo.
    2. Trypsinize as células transformadas a AAV-Cas9. Pare a trippsinização usando DMEM pré-aquecido a 37 °C e recolher em um tubo de 50 mL.
    3. Centrífuga do tubo a 800 x g por 10 min à temperatura ambiente. Descarte o supernatant e resuspenda a pelota de células no meio DMEM sem FBS. Executar a centrífuga novamente e resuspender a pelota celular em 1x PBS.
      NOTA: Não mantenha as células em 1x PBS por muito tempo. Mantenha sempre a suspensão da pilha no gelo para impedir a aglomeração da pilha.
    4. Use um contador automático da pilha para contar as pilhas e diluir as pilhas à concentração desejada (2.5 x 107 pilhas/mL) usando 1x PBS. Gerar tumores através de uma injeção subcutânea da suspensão celular transformada AAV-Cas9 no flanco direito de cada NOD. CB17-Prkdc-scid/NCr Hsd (NOD. Rato SCID) (2 x 106 células/rato). Para gerar um modelo ortotrópico em camundongos singênicos, injete 0,5 × 106 células primárias ou as células transformadas a AAV-Cas9 na língua de camundongos imunocompetentes C57BL/6.
    5. Eutanásia os animais 2 semanas após a injeção por asfixia CO2, e dissecar os tumores dos ratos eutanasiados para análise imunohistoquímica.

Resultados

Usando o sistema AAV para transformar as células cas9 normais
A Figura 1 fornece um mapa vetor detalhado do plasmid transgene AAV usado neste estudo. A Figura 2 descreve o design e o funcionamento do sistema baseado em AAV-Cas9. Para produzir partículas virais, as células HEK293T foram transpartidas com o vetor transgênico AAV e outros vetores de embalagens virais usando o método de transfecção PEI. Ap?...

Discussão

Vários métodos já foram usados para transformar as células primárias na cultura com graus variáveis de sucesso25,26,27,28. A maioria desses métodos utiliza células fibroblasto de camundongos para transformação14,17,18,19 ou usa agentes cancerígenos como 4-n...

Divulgações

M.S. faz parte do Conselho Consultivo do Instituto de Biociências, e Menarini Ricerche recebeu fundos de pesquisa da Puma Biotechnology, Daiichi-Sankio, Targimmune, Immunomedics e Menarini Ricerche. M.S. também é co-fundador da Medendi Medical Travel e, nos últimos 2 anos, recebeu homenageada de Menarini Ricerche e Da ADC Pharma. Todos os outros autores não têm nada a revelar.

Agradecimentos

Queremos agradecer ao Dr. Daniel Gitler por nos fornecer o plasmid pAd Delta 5 Helper. Este trabalho foi financiado pela Israel Science Foundation (ISF, 700/16) (para ME), a United States-Israel Binational Science Foundation (BSF, 2017323) (para ME e MS), a Israel Cancer Association (ICA, 20170024) (para ME), a Israel Cancer Research Foundation (ICRF, 17-1693-RCDA) (para ME) e a Concern Foundation (#7895) (para ME). Companheirismo: a bolsa Alon para ME e Bolsas BGU Kreitman para SJ e MP.

Materiais

NameCompanyCatalog NumberComments
Antibodies
Anti mouse HRPJackson ImmunoResearch115-035-146
Anti rabbit HRPJackson ImmunoResearch711-035-152
Cas9 Mouse mAbCell Signaling Technology14697
CreBioLegend900901
Cy3-AffiniPure Goat Anti-Mouse IgGJackson ImmunoResearch115-165-062
Cy-AffiniPure Goat Anti-Rabbit IgGJackson ImmunoResearch111-165-144
GFPSanta Cruz Biotechnologysc-9996
Phospho-p44/42 MAPK (Erk1/2)Cell Signaling Technology4370
Rabbit monoclonal anti E cadherinCell Signaling Technology3195S
Rabbit monoclonal anti-KRT 14AbcamAB-ab181595
β actinMP Biomedicals691001
β cateninCell Signaling Technology9582S
Cell lines
HEK93TATCCCRL-3216
Culture Media, Chemicals and Reagents
Bradford ReagentBio-Rad30015484
BSAAmresco0332-TAM-50G
DAPI fluoromountSouthern Biotech0100-20
DMEMBiological Industries Israel Beit-Haemek Ltd.01-055-1A
ECL (Westar Supernova and Westar Nova 2.0)CyanagenXLS3.0100 and XLS071.0250
FBSBiological Industries Israel Beit-Haemek Ltd.04-127-1A
HBSSSigmaH6648
Heparin - AgaroseSigmaH6508
Isolate II Genomic DNA KitBiolineBIO-52066
MgCl2Panreac AppliChem300283
NaClBio Lab Ltd1903059100
PBSBiological Industries Israel Beit-Haemek Ltd.02-023-1A
PEIPolysciences23966-1
Pen Strep SolutionBiological Industries Israel Beit-Haemek Ltd.03-031-1B
PFASanta Cruz Biotechnology30525-89-4
Phosphatase inhibitor cocktailBiotoolB15001A/B
Protease inhibitor cocktailMilliporeSigmaP2714-1BTL
Tris bufferMERCK Millipore648311-1KG
Enzymes
BenzonaseSigmaE1014
Collagenase IVThermo Fisher Scientific17104019
DNAseThermo Fisher Scientific18047019
HyaluronidaseMilliporeSigmaH3506
TrypsinBiological Industries Israel Beit-Haemek Ltd.03-050-1B
Glass wares
Cover slipsBar NaorBNCB00130RA1
SlidesBar NaorBN9308C
Mouse strains
C57BL/6Envigo
B6;129-Gt(ROSA)26Sortm1(CAG-cas9*,-EGFP)Fezh/JJackson labs24857
NOD.CB17-Prkdc-scid/NCr Hsd (Nod.Scid)Envigo
Plasmids
AAV pCM109 EFS Cre sg APC sg Kras sg P53- Kras HDRBroad Institute of MITKind gift from Dr Randall J Platt and Dr. Joseph Rosenbluh, Broad Institute of MIT and Harvard, Cambridge, MA 02142, USA
AAV 2/9 capsid vectorAddgene112865
pAD Delta F5 helperBen Gurion University of the NegevProvided by Dr Daniel Gitler, Department of Physiology and Cell Biology, Faculty of Health Sciences, and Zlotowski Center for Neuroscience, Ben-Gurion University of the Negev, Beer-Sheva 84105, Israel.
Plastic wares
Amicon-ULTRA filter 100 KDaMilliporeUFC910024
0.22 µm sterile filters, 4 mmMillexSLGV004SL
0.45 µm sterile filters, 13 mmMillexSLHV013SL
Culture platesGreiner Bio-One
Falcon tubesGreiner Bio-One

Referências

  1. Reyes-Gibby, C. C., et al. Genome-wide association study identifies genes associated with neuropathy in patients with head and neck cancer. Scientific Reports. 8 (1), 8789 (2018).
  2. Riaz, N., Morris, L. G., Lee, W., Chan, T. A. Unraveling the molecular genetics of head and neck cancer through genome-wide approaches. Genes & Diseases. 1 (1), 75 (2014).
  3. Leemans, C. R., Snijders, P. J. F., Brakenhoff, R. H. The molecular landscape of head and neck cancer. Nature Reviews Cancer. 18 (5), 269-282 (2018).
  4. Jiang, X., Ye, J., Dong, Z., Hu, S., Xiao, M. Novel genetic alterations and their impact on target therapy response in head and neck squamous cell carcinoma. Cancer Management and Research. 11, 1321-1336 (2019).
  5. Im, W., Moon, J., Kim, M. Applications of CRISPR/Cas9 for Gene Editing in Hereditary Movement Disorders. Journal of Movement Disorders. 9 (3), 136-143 (2016).
  6. Li, H., et al. Genomic analysis of head and neck squamous cell carcinoma cell lines and human tumors: a rational approach to preclinical model selection. Molecular Cancer Research: MCR. 12 (4), 571-582 (2014).
  7. AACR Project GENIE Consortium, T.A.P.G.. AACR Project GENIE: Powering Precision Medicine through an International Consortium. Cancer Discovery. 7 (8), 818-831 (2017).
  8. Suh, Y., Amelio, I., Guerrero Urbano, T., Tavassoli, M. Clinical update on cancer: molecular oncology of head and neck cancer. Cell Death & Disease. 5 (1), e1018 (2014).
  9. Anderson, J. A., Irish, J. C., Ngan, B. Y. Prevalence of RAS oncogene mutation in head and neck carcinomas. The Journal of Otolaryngology. 21 (5), 321-326 (1992).
  10. Ryals, R. C., Boye, S. L., Dinculescu, A., Hauswirth, W. W., Boye, S. E. Quantifying transduction efficiencies of unmodified and tyrosine capsid mutant AAV vectors in vitro using two ocular cell lines. Molecular Vision. 17, 1090-1102 (2011).
  11. Smith-Arica, J. R., et al. Infection Efficiency of Human and Mouse Embryonic Stem Cells Using Adenoviral and Adeno-Associated Viral Vectors. Cloning and Stem Cells. 5 (1), 51-62 (2003).
  12. Li, J., Xiao, X., Kenniston, T., Kudlow, J., Giannoukakis, N. AAV Vectors. Molecular Therapy. 3 (5), S174-S192 (2001).
  13. Institute of Laboratory Animal Resources (U.S.). . Guide for the care and use of laboratory animals. , (1996).
  14. Platt, R. J., et al. CRISPR-Cas9 knockin mice for genome editing and cancer modeling. Cell. 159 (2), 440-455 (2014).
  15. Zhang, Y., Chirmule, N., Gao, G. P., Wilson, J. CD40 ligand-dependent activation of cytotoxic T lymphocytes by adeno-associated virus vectors in vivo: role of immature dendritic cells. Journal of Virology. 74 (17), 8003-8010 (2000).
  16. Xiao, X., Li, J., Samulski, R. J. Production of high-titer recombinant adeno-associated virus vectors in the absence of helper adenovirus. Journal of Virology. 72 (3), 2224-2232 (1998).
  17. Auricchio, A., Hildinger, M., O'Connor, E., Gao, G. P., Wilson, J. M. Isolation of Highly Infectious and Pure Adeno-Associated Virus Type 2 Vectors with a Single-Step Gravity-Flow Column. Human Gene Therapy. 12 (1), 71-76 (2001).
  18. Lock, M., et al. Characterization of a Recombinant Adeno-Associated Virus Type 2 Reference Standard Material. Human Gene Therapy. 21 (10), 1273 (2010).
  19. Challis, R. C., et al. Systemic AAV vectors for widespread and targeted gene delivery in rodents. Nature Protocols. 14 (2), 379-414 (2019).
  20. Rabinowitz, J. E., et al. Cross-packaging of a single adeno-associated virus (AAV) type 2 vector genome into multiple AAV serotypes enables transduction with broad specificity. Journal of Virology. 76 (2), 791-801 (2002).
  21. Cheng, D. T., et al. Memorial Sloan Kettering-Integrated Mutation Profiling of Actionable Cancer Targets (MSK-IMPACT). The Journal of Molecular Diagnostics. 17 (3), 251-264 (2015).
  22. Sun, H., Taneja, R. Analysis of Transformation and Tumorigenicity Using Mouse Embryonic Fibroblast Cells. Cancer Genomics and Proteomics. 383, 303-310 (2007).
  23. Durkin, M., Qian, X., Popescu, N., Lowy, D. Isolation of Mouse Embryo Fibroblasts. BIO-PROTOCOL. 3 (18), (2013).
  24. Jozefczuk, J., Drews, K., Adjaye, J. Preparation of Mouse Embryonic Fibroblast Cells Suitable for Culturing Human Embryonic and Induced Pluripotent Stem Cells. Journal of Visualized Experiments. (64), e3854 (2012).
  25. Boehm, J. S., Hession, M. T., Bulmer, S. E., Hahn, W. C. Transformation of Human and Murine Fibroblasts without Viral Oncoproteins. Molecular and Cellular Biology. 25 (15), 6464 (2005).
  26. Gupta, T., Sáenz Robles, T. M., Pipas, J. M. Cellular transformation of mouse embryo fibroblasts in the absence of activator E2Fs. Journal of Virology. 89 (9), 5124-5133 (2015).
  27. Leong, H., Blewitt, M. Retrovirus Mediated Malignant Transformation of Mouse Embryonic Fibroblasts. BIO-PROTOCOL. 3 (15), (2013).
  28. Parikh, N., Nagarajan, P., Sei-ichi, M., Sinha, S., Garrett-Sinha, L. A. Isolation and characterization of an immortalized oral keratinocyte cell line of mouse origin. Archives of Oral Biology. 53 (11), 1091-1100 (2008).
  29. Badarni, M., et al. Repression of AXL expression by AP-1/JNK blockage overcomes resistance to PI3Ka therapy. JCI Insight. 5, 125341 (2019).
  30. Chen, Y. F., et al. Establishing of mouse oral carcinoma cell lines derived from transgenic mice and their use as syngeneic tumorigenesis models. BMC Cancer. 19 (1), 281 (2019).
  31. Hoover, A. C., et al. The Role of Human Papillomavirus 16 E6 in Anchorage-Independent and Invasive Growth of Mouse Tonsil Epithelium. Archives of Otolaryngology-Head & Neck Surgery. 133 (5), 495 (2007).
  32. Smahel, M., et al. Metastatic MHC class I-negative mouse cells derived by transformation with human papillomavirus type 16. British Journal of Cancer. 84 (3), 374-380 (2001).
  33. He, L., et al. Increased Growth of a Newly Established Mouse Epithelial Cell Line Transformed with HPV-16 E7 in Diabetic Mice. PloS One. 11 (10), e0164490 (2016).

Reimpressões e Permissões

Solicitar permissão para reutilizar o texto ou figuras deste artigo JoVE

Solicitar Permissão

Explore Mais Artigos

Pesquisa do c ncerEdi o 155c ncer de cabe a e pesco omodelos de c ncer de urinaedi o gen micaCRISPRvetor de v rus associado ao adenotransforma o de c lulas in vitrolinha de c lulas tumorais

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacidade

Termos de uso

Políticas

Entre em contato

recomende à biblioteca

Newsletter

Pesquisa

Educação

Autores

Bibliotecários

SOBRE A JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. Todos os direitos reservados