Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

وغالبا ما تسترشد هجره الخلايا الجماعية في التنمية ، والتئام الجروح ، وورم خبيث السرطان من التدرجات من عوامل النمو أو الجزيئات الإشارات. وصف هنا هو نظام تجريبي الجمع بين المجهر الجر مع نظام ميكروفلويدريك ودليلا علي كيفيه قياس أليات الهجرة الجماعية تحت التدرج البيوكيميائية.

Abstract

تغير الخلايا أنماط الهجرة استجابه للمؤثرات الكيميائية ، بما في ذلك تدرجات المحفزات. الهجرة الخلوية في اتجاه التدرج الكيميائي ، والمعروفة باسم chemotaxis ، يلعب دورا هاما في التنمية ، والاستجابة المناعية ، التئام الجروح ، والسرطان الانبثاث. في حين ينظم شموتاكسيس هجره خلايا واحده ، فضلا عن مجموعات من الخلايا في الجسم المجري ، يركز البحث في المختبر علي المحور الكيميائي أحاديه الخلية ، ويرجع ذلك جزئيا إلى عدم وجود الاداات التجريبية المناسبة. لسد هذه الفجوة ، الموصوفة هنا هو نظام تجريبي فريد يجمع بين ميكروفلويديكس ميكروباتيرنينج لإظهار اثار التدرجات الكيميائية علي هجره الخلايا الجماعية. وعلاوة علي ذلك ، يتم دمج المجهر الجر والمجهر أحادي الطبقة الإجهاد في النظام لتوصيف التغيرات في القوه الخلوية علي الركيزة ، وكذلك بين الخلايا المجاورة. كدليل علي المفهوم ، يتم اختبار هجره الجزر الدائرية المجهرية من الكليات البوليسية مادان-داربي (MDCK) تحت التدرج من عامل نمو الخلايا الكبدية (HGF) ، عامل تشتت معروف. وقد وجد ان الخلايا الواقعة بالقرب من تركيز اعلي من HGF تهاجر أسرع من تلك الموجودة علي الجانب الآخر داخل جزيرة الخلية. داخل نفس الجزيرة ، والجر الخلوية متشابهة علي كلا الجانبين ، ولكن الإجهاد بين الخلايا هو اقل بكثير علي الجانب من تركيز HGF اعلي. هذا النظام التجريبي يمكن ان يوفر فرصا جديده لدراسة ميكانيكا الهجرة الكيميائية من قبل التعاونيات الخلوية.

Introduction

الهجرة الخلوية في النظم البيولوجية هي ظاهره أساسيه تشارك في تكوين الانسجه ، والاستجابة المناعية ، والتئام الجروح1،2،3. الهجرة الخلوية هي أيضا عمليه هامه في بعض الامراض مثل السرطان4. غالبا ما تهاجر الخلايا كمجموعه بدلا من ان تكون فرديه ، والتي تعرف باسم هجره الخلايا الجماعية4،5. للخلايا للتحرك بشكل جماعي ، والاستشعار عن البيئة الدقيقة ضروري6. علي سبيل المثال, الخلايا تصور المحفزات الفيزيائية والاستجابة عن طريق تغيير الحركة, التفاعلات الخلية الركيزة, والتفاعلات خليه خليه, مما ادي إلى الهجرة الاتجاهية علي طول التدرج الكيميائي7,8, 9و10. واستنادا إلى هذا الاتصال ، تم احراز تقدم سريع في تقنيات مختبر علي رقاقه التي يمكن ان تخلق البيئات الدقيقة الكيميائية التي تسيطر عليها جيدا مثل التدرج من تشيمواتراكتانت11،12،13 . في حين ان هذه المختبر علي أساس رقاقه المستندة إلى موائع قد استخدمت سابقا لدراسة شموتاكسيس من الفرقة الخلوية أو خزان الخلوية14,15,16,17, انها وقد استخدمت في الغالب في سياق الهجرة خليه واحده18،19،20،21. أليات الكامنة وراء الاستجابة الجماعية الخلوية إلى التدرج الكيميائي لا تزال غير مفهومه جيدا14،22،23،24،25،26 . التالي ، فان تطوير منصة تمكن من السيطرة المكانية علي العوامل القابلة للذوبان وكذلك مراقبه الخلايا البيوفيزيائية في الموقع سيساعد علي كشف أليات الكامنة وراء هجره الخلايا الجماعية.

وضعت ووصفت هنا هو نظام ميكروفلويدريك متعددة التوجيه التي تمكن من توليد التدرج التركيز من العوامل القابلة للذوبان التي ينظم الهجرة من مجموعات الخلايا المنقوشة. في هذه الدراسة ، يتم اختيار عامل نمو الخلايا الكبدية (HGF) لتنظيم سلوك المهاجرة من Madin-داربي الكلية البوليسية (MDCK) الخلية. ومن المعروف hgf للتخفيف من سلامه خليه خليه وتعزيز حركيه الخلايا27,28. في النظام ميكروفلويديك, تحويل fourier المجهر الجر والمجهر أحاديه الطبقة الإجهاد وأدرجت أيضا, الذي يسمح تحليل الحركة, قوه مقلص, والتوتر بين الخلايا الناجمة عن الخلية التاسيسيه ردا علي hgf التدرج. داخل نفس الجزيرة ، والخلايا الموجودة بالقرب من تركيز اعلي من HGF تهاجر بشكل أسرع وتظهر مستويات التوتر بين الخلايا اقل من تلك الموجودة علي الجانب مع تركيز HGF اقل. وتشير النتائج إلى ان هذا النظام التجريبي الجديد مناسب لاستكشاف اسئله أخرى في مجالات تتعلق بالهجرة الخلوية الجماعية في اطار التدرجات الكيميائية لمختلف العوامل القابلة للذوبان.

Protocol

ملاحظه: الطباعة الحجرية لقوالب SU-8 الاستنسل (سمك = 250 μm) وأجزاء ذات قنو (سمك = 150 μm) ، والنقش الزجاج (عمق = 100 μm) ، والصب المصبوب والاستعانة بمصادر خارجيه عن طريق إرسال التصاميم باستخدام برامج التصميم بمساعده الكمبيوتر للمصنعين.

1. تصنيع الاستنسل بوليميثيلسيلاوكسان (PDMS) والقناة المجهرية

  1. تصميم النمط المصغر من الاستنسل و micropattern.
  2. افتعال أو الاستعانة بمصادر خارجيه سو-8 قوالب (سمك ~ 250 μm لقوالب الاستنسل و ~ 150 μm للقنوات الدقيقة) علي رقائق السيليكون (4 "القطر).
  3. اعداد PDMS الخليط عن طريق خلط المطاط المرن قاعده وعامل العلاج بنسبه 10:1.
    1. ضع 15 مل من اللدائن الاساسيه في أنبوب مخروطي 50 mL وأضافه 1.5 مل من وكيل علاج. جهز اثنين من هذه
    2. دوامه الخليط PDMS لمده 5 دقائق. الطرد المركزي الخليط PDMS في 196 x ز ل 1 دقيقه لأزاله فقاعات.
  4. لافتعال الاستنسل PDMS ، صب ~ 1 مل من خليط PDMS علي رقاقه ، مع تجنب SU-8 المناطق منقوشة بحيث PDMS اللمسات الجانب من ركائز سو-8 ولكن ليس الجزء العلوي من نمط سو 8.
    1. ضع الرقاقة علي سطح مستو لأكثر من 30 دقيقه في درجه حرارة الغرفة (RT). علاج PDMS في فرن جاف في 80 درجه مئوية لأكثر من 2 ساعة.
    2. قشر بعناية قباله PDMS من العفن سو 8 وتقليم غشاء PDMS رقيقه باستخدام لكمه جوفاء 14 مم. أزاله الغبار علي سطح القطع PDMS باستخدام شريط لاصق والاوتوكلاف الاستنسل PDMS.
  5. لافتعال PDMS microchannel ، صب ~ 30 مل من خليط PDMS علي العفن سو 8.
    1. Degas لمده 30 دقيقه في غرفه فراغ وعلاج PDMS في فرن جاف في 80 درجه مئوية لأكثر من 2 ساعة.
    2. قشر بعناية قباله PDMS من العفن سو 8 وقطع PDMS إلى حجم 24 مم × 24 ملم. في كل كتله PDMS ، إنشاء منفذ واحد وثلاثه مداخل باستخدام 1 ملليمتر خزعة لكمه.

2. اعداد الزجاج السفلي مع هلام بولياكريلاميد (PA)

  1. تصنيع أو الاستعانة بمصادر خارجيه زجاجات الشرائح المستطيلة (24 مم × 24 مم × 1 مم) مع مستطيله الصغرى بئر (6 مم × 12 ملم ، 100 ميكرومتر عمق29) بواسطة قطع والنقش النظارات.
  2. Silanize سطح الزجاج السفلي30.
    1. اعداد حل سيلان الربط عن طريق خلط 200 مل من الماء منزوع الأيونات (diw) ، 80 μl من حمض الخليك ، و 50 μl من 3-(trimethoxysilyl) بروبيل ميثاكريليت (tmspma) لمده 1 ساعة.
      تنبيه: TMSPMA هو سائل قابل للاحتراق. اتبع التوصيات الواردة في صحائف بيانات سلامه المواد. يستخدم فقط في غطاء الدخان الكيميائي.
    2. أزاله الغبار من سطح الزجاج عن طريق شريط لاصق والاوتوكلاف الزجاج.
    3. تغطيه سطح محفور من الزجاج السفلي مع 100 μl من محلول سيلان الربط وترك الزجاج في RT لمده 1 ساعة.
    4. شطف الزجاج مع DIW 3x والسماح للزجاج الجاف في درجه حرارة الهواء المحيط أو عن طريق نفخ الهواء.
  3. اعداد محلول هلام لل PA هلام31.
    1. اعداد حل جديد من 0.5 ٪ (ث/ف) فوق كبريتات الأمونيوم (APS) عن طريق تذويب 5 ملغ من aps في 1 مل من diw.
    2. اعداد حل هلام السلطة الفلسطينية التي تتكون من 138 μL من 40 ٪ محلول اكريلاميد ، 101 μL من 2 ٪ مكررا-محلول اكريلاميد ، 5 μL من محلول الجزيئات الفلورية (0.2 μm) ، و 655 μL من DIW.
      تحذير: حلول الاكريلاميد والبياكرياميد سامه. ارتداء قفازات واقيه ، والملابس ، وحماية العين. حماية الحل هلام السلطة الفلسطينية التي تحتوي علي جزيئات الفلورسنت من الضوء.
      ملاحظه: دوامه الحل حبه الفلورسنت قبل الأنابيب للحصول علي عدد موحد من حبات الفلورسنت لكل دفعه.
    3. بعد أضافه 100 μl من الحل APS و 1 μl من تيتراميثيليثيلينيدياميني (temed) ، ونقل 10 μl من محلول هلام مختلطة علي الصغيرة مستطيله جيدا ، ووضع علي راس كوفيرسليب دائري (18 ملم).
      ملاحظه: لملء الزجاج السفلي مع هلام السلطة الفلسطينية دون فقاعات ، ووضع الحل هلام كافيه علي الأخدود من الزجاج السفلي ، والشريحة بعناية في كوفيرسليب علي حل هلام وأزاله اي حل هلام الزائدة.
      تحذير: يتم الشفاء ببطء هلام لمده 40 دقيقه تقريبا. وينبغي ان يتم الاجراء التالي ليطرد الهلام في أقرب وقت ممكن.
    4. الوجه التجمع من الزجاج المخصص ، حل هلام ، و coverslip ، ثم أجهزه الطرد المركزي لمده 10 دقيقه في 96 x ز لجلب جزيئات الفلورسنت إلى الطبقة العليا من هلام السلطة الفلسطينية.
    5. قم بازاله التجميع من جهاز الطرد المركزي ووضعه علي السطح المسطح مع مواجهه الشفة الاماميه.
      ملاحظه: بدءا من الخطوة التالية ، التعامل مع العينات في خزانه السلامة الاحيائيه.
    6. بعد 30 دقيقه ، والوجه التجمع ووضعه في صحن بيتري مم 35 ، وملء مع 2 مل من diw ، و (باستخدام ملقط) بلطف أزاله كوفيرسليب عن طريق الانزلاق إلى جانب واحد.
      ملاحظه: يمكن تخزين هلام السلطة الفلسطينية الشفاء في DIW لمده 1 شهر. ومع ذلك ، مره واحده يتم المغلفة الكولاجين علي هلام السلطة الفلسطينية ، وينبغي ان تستخدم في تجربه في غضون يوم واحد.
  4. معطف الكولاجين علي هلام السلطة الفلسطينية.
    1. تذوب 1 ملغ/مل سولفوسكاليديديل 6-(4 '-ازيدو-2 '-نيتروفينيلاميني) هيكسانواتي (سولفو-سانبا) في الحارة 50 mM HEPES العازلة. إسقاط 200 μL من الحل علي سطح الهلام وتنشيط بواسطة ضوء الاشعه فوق البنفسجية (365 nm الطول الموجي) لمده 10 دقيقه.
      ملاحظه: حماية سولفو-سانبا من الضوء.
    2. شطف هلام مع 0.1 M [4-(2-هيدروكسي ايثيل) حمض -1-بيبيرازينيثانيسولفونيك ؛ HEPES] المخزن المؤقت 2x ومع 1x تلفزيوني.
    3. معطف هلام السلطة الفلسطينية مع محلول الكولاجين (100 ميكروغرام/مل في تلفزيوني ، الفئران ذيل الكولاجين نوع I) في 4 °C بين عشيه وضحيها. في اليوم التالي ، وغسل مع تلفزيوني 3x.

3-ميكروباتيرنينج الجزر الخلوية

  1. اعداد F-127 (جدول المواد) الحل [2 ٪ (ث/v) في المكتب التلفزيوني] وتزج الاستنسل pdms الاوتوكلاف في الحل f-127. يبقيه في 37 درجه مئوية حاضنه لمده 1 ساعة.
  2. اعداد حل الخلية (2 × 106 خليه/مل) في وسائل الاعلام الثقافة الخلية التي تتكون من: دولبيكو المتوسطة النسر المعدلة (dmem) مع 10 ٪ مصل البقر الجنين (الدم) و 1 ٪ المضادات الحيوية-انتيليكوتيك (AA).
  3. اغسل الاستنسل PDMS مع 3x تلفزيوني وأزاله السائل من كل من الاستنسل PDMS وهلام السلطة الفلسطينية. وضع الاستنسل PDMS علي هلام السلطة الفلسطينية وأضافه تلفزيوني إلى الاستنسل.
  4. أزاله فقاعات في ثقوب الاستنسل PDMS عن طريق السحب برفق. بعد أزاله فقاعات ، وأزاله تلفزيوني من سطح الاستنسل PDMS.
  5. بعد وضع 200 μL من محلول الخلية علي الاستنسل PDMS ، والحفاظ علي هلام السلطة الفلسطينية في حاضنه لمده 1 ساعة حتى ان الخلايا نعلق علي هلام السلطة الفلسطينية.
  6. اغسل برفق حل الخلية مع وسائط ثقافة الخلية ، وأزاله الاستنسل PDMS ، وأضافه المزيد من وسائل الاعلام الثقافة الخلية. التحقق من تشكيل جزر الخلية تحت المجهر.

4. الجمعية من هلام السلطة الفلسطينية مع القناة الصغرى PDMS

  1. أزاله الغبار علي القناة المجهرية PDMS باستخدام شريط لاصق ، ثم الاوتوكلاف.
  2. علاج سطح القناة المجهرية PDMS مع بلازما الأكسجين (80 W ، 50 kHz) ل 30 ثانيه.
  3. بعد أزاله اي سائل علي الزجاج السفلي من السلطة الفلسطينية المملوءة بالهلام ، ضع القناة الصغيرة PDMS علي الجزء العلوي من الزجاج السفلي ووضع التجميع علي حامل الزجاج المخصص.
  4. أملا القناة الصغيرة بمتوسط ثقافة الخلية.
    تنبيه: تاكد من أزاله جميع الفقاعات المحاصرة في القناات عن طريق تنظيف الوسائط الدافئة برفق باستخدام ماصه. أيضا ، في حين أزاله فقاعات ، تاكد من عدم فصل جزر الخلايا الصغيرة المنقوشة.

5. نظام ميكروفلويدريك المتكاملة

  1. قم بتوصيل الأنابيب.
    1. اعداد الموصلات عن طريق تقليم غيض من الابر (18 G) والانحناء 90 درجه.
    2. اعداد خطوط أنابيب لثلاثه مداخل ومنفذ واحد.
      1. لأنابيب مدخل ، وربط الابره قلص وخط حجم مصغره 30 سم مع stopcock ثلاثي الاتجاات. جهز ثلاثه من هذه
      2. لأنابيب منفذ ، وربط ابره قلص وخط حجم مصغره 75 سم مع stopcock ثلاثي الاتجاات. جهز واحده من هذه
      3. أملا خطوط الأنابيب بالوسيط الذي تم تسخينه لمده 1 ساعة.
        تنبيه: تاكد من أزاله جميع الفقاعات المحاصرة في خطوط الأنابيب عن طريق تنظيف الوسائط الدافئة برفق بحقنه.
    3. اعداد الخزانات عن طريق أزاله الغطاسون من المحاقن وربط خطوط أنابيب مدخل.
    4. قم بتوصيل موصلات الابره لكل خط أنابيب في المداخل الثلاثة ومخرج واحد من جهاز ميكروفلويدريك.
  2. أملا الخزانات بثلاثه مل من المتوسطات الطازجة المتوسطة أو المكيفة.
    1. لاختبار التدرج ، أملا خزان المدخل الأيسر مع 20 نانوغرام/مل HGF في وسط ثقافة الخلية.
    2. لتصور التدرج التركيز ، أضافه 200 ميكروغرام/مل صبغه فلورية (رومدامين ب-ديكسكان ، 70 كده) إلى الخزان مدخل اليسار.
    3. توصيل خط أنابيب مخرج إلى مضخة حقنه.
      ملاحظه: وضع التشغيل من مضخة حقنه هو "الانسحاب". يتم تغيير معدل التدفق وفقا لقدره الحقنه وسرعه التشغيل من مضخة حقنه.
  3. وضع نظام ميكروفلويدريك المتكاملة علي خشبه المسرح من المجهر التقليدية الفلورسنت.
    تحذير: لتوليد التدرج لطيف من hgf في قناه ميكروفلويديك ، يجب ان يكون معدل التدفق بطيئا كما 0.1 μl/min. هذا حساس بما فيه الكفاية بحيث انه يتطلب تثبيت لمده 2 ح ، ويجب توخي الحذر لتجنب الاضطرابات الجسدية اثناء التجربة.

6. اكتساب الصور

  1. التقاط الصور كل 10 دقيقه لمده تصل إلى 24 ساعة باستخدام المجهر الألى الذي يقع في حاضنه. في كل نقطه زمنيه ، واتخاذ مجموعه من الصور باستخدام عدسه الهدف 4x في ثلاث قنوات مختلفه ، بما في ذلك صوره المرحلة لتصور هجره الخلايا ، والصورة الفلورية الخضراء لتصور حبات الفلورسنت جزءا لا يتجزا من هلام السلطة الفلسطينية ، والصورة الفلورية الحمراء لتصور تدرج التركيز لماده كيميائية.
  2. بعد أخذ الصور الفاصلة زمنيا ، لبث 0.25 ٪ تريبسين-أدتا الحل في ميكرواقنيه لفصل الخلايا من هلام السلطة الفلسطينية. بعد أزاله الخلايا تماما من الجل ، خذ صوره فلورية خضراء لاستخدامها كصوره مرجعيه لمجهر الجر.

7-تحليل البيانات

ملاحظه: تم تطوير كود مخصص لتحليل البيانات باستخدام matlab ، وقد تم وصف التفاصيل في مكان آخر32،33،34،35،36.

  1. لتحليل صوره المرحلة ، احسب الإزاحات في صورتين متتاليتين باستخدام صوره الجسيمات قياس سرعه36.
  2. ل Fourier تحويل المجهر الجر ، قارن كل صوره الفلورسنت الخضراء مع الصورة المرجعية وحساب النزوح في كل صوره باستخدام الجسيمات صوره قياس سرعه36. من عمليات النزوح ، واستعاده الجر التي ادلي بها الخلايا علي هلام السلطة الفلسطينية باستخدام fourier تحويل الجر المجهر33،34،37.
  3. من بيانات الجر ، وحساب الإجهاد داخل أحادي الطبقة من جزيرة الخلية باستخدام المجهر الإجهاد أحاديه الطبقة استنادا إلى أساليب العنصر المحدود32،34،38.

النتائج

ولاستكشاف الهجرة الجماعية تحت التدرج الكيميائي ، أدمج نظام ميكروفلويدريك مع المجهر المجهري (الشكل 1). ولبناء النظام المتكامل ، تم صب جل البولياكرياميد (PA) علي الزجاج المخصص القطع ، وتم بذر خلايا MDCK داخل الجزر المجهرية المصنوعة من استنسل PDMS. لهذه التجربة ، تم إنشاء اثني عشر ج...

Discussion

وتعد الهجرة الجماعية للخلايا التاسيسيه عمليه هامه اثناء التطوير والتجديد ، وغالبا ما يسترشد الاتجاه المهاجر بالتدرج الكيميائي لعوامل النمو4و23. اثناء الهجرة الجماعية ، تستمر الخلايا في التفاعل مع الخلايا المجاورة والركائز الاساسيه. هذه التفاعلات الميكان?...

Disclosures

ويعلن صاحبا البلاغ انهما لا يملكان مصالح مالية متنافسة.

Acknowledgements

وكان هذا العمل مدعوما بمنحه مؤسسه البحوث الوطنية الكورية التي تمولها الحكومة الكورية (رقم الرعاية الاوليه-2017R1E1A1A01075103) ، منحه جامعه كوريا ، وبرنامج BK 21 Plus. وقد دعمته أيضا المعاهد الوطنية للصحة (U01CA202123, PO1HL120839, T32HL007118, R01EY019696).

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
0.25% trypsin-EDTA (1X)Gibco25200-056
1 M HEPES buffer solutionGibco15630-056
1 mm Biopsy punchIntegra Miltex33-31AA-P/25
100 mm petri dishesSPL10100100 mm diameter, 15 mm height
14 mm hollow punchILJIN124-0571
18 mm Ø CoverslipMarienfeld-Superior111580Circular 18 mm, thickness No. 1 (0.13 to 0.16 mm)
2% bis-acrylamide solutionBio-Rad1610142Wear protective gloves, clothing, and eye protection.
3-(Trimethoxysilyl)propyl methacrylate (TMSPMA)Sigma-Aldrich440159-500ML
3-way stopcockHyupsungHS-T-61NCAUTION: do not use if previously opened. do not resterlize or resuse
30 cm minimum volume line (for pediatric)HyupsungHS-MV-30CAUTION: do not use if previously opened. do not resterlize or resuse
35 mm cell culture dishCorning430165
40% Acrylamide SolutionBio-Rad1610140Wear protective gloves, clothing, and eye protection.
75 cm minimum volume line (for pediatric)HyupsungHS-MV-75CAUTION: do not use if previously opened. do not resterlize or resuse
acetic acidJ.T. BakerJT9508-03
Ammonium persulfate (APS)Bio-Rad1610700
Antibiotic-AntimycoticGibco15240-062
Bottom glass chipMicroFIT24 x 24 x 1 mm, custom-made, rectangular groove (6 x 12 mm, depth : 100 μm)
Collagen typeI, Rat tailCorning354236
Custom glass holderHan-Gug Mechatronicscustom-made
Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM)WelgeneLM 001-11
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (PBS)BiowestL0615-500w/o Magnesium, Calcium
Fetal bovine serum (FBS)Gibco26140-179
FluoSpheres amine-modified microspheresInvitrogenF87640.2 µm, yellow-green fluorescent(505/515)
Hepatocyte Growth Factor (HGF)Sigma-AldrichH1404-5UGrecombinant, human
JuLI stage live cell imaging systemNanoEnTek InAutomated X-Y-Z stage and fluorsent imaging Incubator-compatible (37 °C and 5% CO2)
Madin-Darby Canine Kidney (MDCK) celltype II
Oxygen plasma systemFemto ScienceCUTE-MPR
Pluronic F-127Sigma-AldrichP2443-250G
Rhodamine B isothiocyanate–dextranSigma-AldrichR9379-100MG70 kDa, used to estimate spatiotemporal distribution of HGF in the microfluidic channel
Steril hypodermic needle 18 GKOVAXTrim the tip of the needle and bend it 90 degrees for connecting in/out ports with volume line
Sticky tape3M/Scotch810D33 m x 19 mm
SU-8 master moldsMicroFIT4” diameter, custom-made
sulfosuccinimidyl 6-(4’-azido-2’-nitrophenylamino)hexanoate (Sulfo-SANPAH)Thermo Scientific22589Store at -20°C. Store protected from moisture and light.
Sylgard 184 Elastomer KitDow CorningPDMS
Syringe pumpChemyx Inc.model fusion 720withdraw fluid
SyringesKOVAX1, 3, 5, 10, or 50 cc for using inlet reservoir or outlet syringe pump
tetramethylethylenediamine (TEMED)Bio-Rad1610800Wear protective gloves, clothing, and eye protection.
Ultraviolet (UV) lampUVP LLC95-0248-02365 nm wavelength

References

  1. Reig, G., Pulgar, E., Concha, M. L. Cell migration: from tissue culture to embryos. Development. 141 (10), 1999-2013 (2014).
  2. Luster, A. D., Alon, R., von Andrian, U. H. Immune cell migration in inflammation: present and future therapeutic targets. Nature Immunology. 6 (12), 1182-1190 (2005).
  3. Liang, C. C., Park, A. Y., Guan, J. L. In vitro scratch assay: a convenient and inexpensive method for analysis of cell migration in vitro. Nature Protocols. 2 (2), 329-333 (2007).
  4. Friedl, P., Gilmour, D. Collective cell migration in morphogenesis, regeneration and cancer. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 10 (7), 445-457 (2009).
  5. Mayor, R., Etienne-Manneville, S. The front and rear of collective cell migration. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 17 (2), 97-109 (2016).
  6. DuFort, C. C., Paszek, M. J., Weaver, V. M. Balancing forces: architectural control of mechanotransduction. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 12 (5), 308-319 (2011).
  7. Vogel, V. Mechanotransduction involving multimodular proteins: converting force into biochemical signals. Annual Review of Biophysics and Biomolecular Structure. 35, 459-488 (2006).
  8. Roca-Cusachs, P., Sunyer, R., Trepat, X. Mechanical guidance of cell migration: lessons from chemotaxis. Current Opinion in Cell Biology. 25 (5), 543-549 (2013).
  9. Weber, G. F., Bjerke, M. A., DeSimone, D. W. A mechanoresponsive cadherin-keratin complex directs polarized protrusive behavior and collective cell migration. Developmental Cell. 22 (1), 104-115 (2012).
  10. Ingber, D. E. Cellular mechanotransduction: putting all the pieces together again. FASEB Journal. 20 (7), 811-827 (2006).
  11. Ricart, B. G., Yang, M. T., Hunter, C. A., Chen, C. S., Hammer, D. A. Measuring traction forces of motile dendritic cells on micropost arrays. Biophysical Journal. 101 (11), 2620-2628 (2011).
  12. Garcia, S., et al. Generation of stable orthogonal gradients of chemical concentration and substrate stiffness in a microfluidic device. Lab on a Chip. 15 (12), 2606-2614 (2015).
  13. Zhang, Z., et al. Scalable Multiplexed Drug-Combination Screening Platforms Using 3D Microtumor Model for Precision Medicine. Small. 14 (42), 1703617 (2018).
  14. Ayuso, J. M., et al. Study of the Chemotactic Response of Multicellular Spheroids in a Microfluidic Device. PLoS ONE. 10 (10), 0139515 (2015).
  15. McCutcheon, S., et al. In vitro formation of neuroclusters in microfluidic devices and cell migration as a function of stromal-derived growth factor 1 gradients. Cell Adhesion & Migration. 11 (1), 1-12 (2017).
  16. Ellison, D., et al. Cell-cell communication enhances the capacity of cell ensembles to sense shallow gradients during morphogenesis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (6), 679-688 (2016).
  17. Fujimori, T., Nakajima, A., Shimada, N., Sawai, S. Tissue self-organization based on collective cell migration by contact activation of locomotion and chemotaxis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. , (2019).
  18. Li Jeon, N., et al. Neutrophil chemotaxis in linear and complex gradients of interleukin-8 formed in a microfabricated device. Nature Biotechnology. 20 (8), 826-830 (2002).
  19. Saadi, W., Wang, S. J., Lin, F., Jeon, N. L. A parallel-gradient microfluidic chamber for quantitative analysis of breast cancer cell chemotaxis. Biomedical Microdevices. 8 (2), 109-118 (2006).
  20. Abhyankar, V. V., Lokuta, M. A., Huttenlocher, A., Beebe, D. J. Characterization of a membrane-based gradient generator for use in cell-signaling studies. Lab on a Chip. 6 (3), 389-393 (2006).
  21. Bersini, S., et al. A microfluidic 3D in vitro model for specificity of breast cancer metastasis to bone. Biomaterials. 35 (8), 2454-2461 (2014).
  22. Rorth, P. Whence directionality: guidance mechanisms in solitary and collective cell migration. Developmental Cell. 20 (1), 9-18 (2011).
  23. Rorth, P. Collective guidance of collective cell migration. Trends in Cell Biology. 17 (12), 575-579 (2007).
  24. McCutcheon, S., et al. In vitro formation of neuroclusters in microfluidic devices and cell migration as a function of stromal-derived growth factor 1 gradients. Cell Adhesion & Migration. 11 (1), 1-12 (2017).
  25. Rorth, P. Whence directionality: guidance mechanisms in solitary and collective cell migration. Developmental Cell. 20 (1), 9-18 (2011).
  26. Rorth, P. Collective guidance of collective cell migration. Trends in Cell Biology. 17 (12), 575-579 (2007).
  27. Farrell, J., et al. HGF induces epithelial-to-mesenchymal transition by modulating the mammalian hippo/MST2 and ISG15 pathways. Journal of Proteome Research. 13 (6), 2874-2886 (2014).
  28. Wang, T. W., Zhang, H., Gyetko, M. R., Parent, J. M. Hepatocyte growth factor acts as a mitogen and chemoattractant for postnatal subventricular zone-olfactory bulb neurogenesis. Molecular and Cellular Neuroscience. 48 (1), 38-50 (2011).
  29. Lin, Y. C., et al. Mechanosensing of substrate thickness. Physical Review. E, Statistical, Nonlinear and Soft matter Physics. 82, 041918 (2010).
  30. Serra-Picamal, X., Conte, V., Sunyer, R., Munoz, J. J., Trepat, X. Mapping forces and kinematics during collective cell migration. Methods in Cell Biology. 125, 309-330 (2015).
  31. Denisin, A. K., Pruitt, B. L. Tuning the Range of Polyacrylamide Gel Stiffness for Mechanobiology Applications. ACS Applied Materials & Interfaces. 8 (34), 21893-21902 (2016).
  32. Jang, H., et al. Traction microscopy with integrated microfluidics: responses of the multi-cellular island to gradients of HGF. Lab on a Chip. 19 (9), 1579-1588 (2019).
  33. Tambe, D. T., et al. Collective cell guidance by cooperative intercellular forces. Nature Materials. 10 (6), 469-475 (2011).
  34. Jang, H., et al. Homogenizing cellular tension by hepatocyte growth factor in expanding epithelial monolayer. Scientific Reports. 8, 45844 (2017).
  35. Trepat, X., et al. Physical forces during collective cell migration. Nature Physics. 5 (6), 426 (2009).
  36. Tolic-Norrelykke, I. M., Butler, J. P., Chen, J., Wang, N. Spatial and temporal traction response in human airway smooth muscle cells. American Journal of Physiology - Cell Physiology. 283 (4), 1254-1266 (2002).
  37. Butler, J. P., Tolic-Norrelykke, I. M., Fabry, B., Fredberg, J. J. Traction fields, moments, and strain energy that cells exert on their surroundings. American Journal of Physiology - Cell Physiology. 282 (3), 595-605 (2002).
  38. Tambe, D. T., et al. Monolayer stress microscopy: limitations, artifacts, and accuracy of recovered intercellular stresses. PLoS ONE. 8 (2), 55172 (2013).
  39. Dembo, M., Wang, Y. L. Stresses at the cell-to-substrate interface during locomotion of fibroblasts. Biophysical Journal. 76 (4), 2307-2316 (1999).
  40. Wang, N., et al. Cell prestress. I. Stiffness and prestress are closely associated in adherent contractile cells. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 282 (3), 606-616 (2002).
  41. Notbohm, J., et al. Cellular Contraction and Polarization Drive Collective Cellular Motion. Biophysical Journal. 110 (12), 2729-2738 (2016).
  42. Sunyer, R., et al. Collective cell durotaxis emerges from long-range intercellular force transmission. Science. 353 (6304), 1157-1161 (2016).
  43. Kim, J. H., et al. Propulsion and navigation within the advancing monolayer sheet. Nature Materials. 12 (9), 856-863 (2013).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

152 chemotaxis

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved