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요약

개발에 집단 세포 이동, 상처 치유, 그리고 암 전이 종종 성장 인자 또는 신호 분자의 그라데이션에 의해 유도. 여기에 설명된 견인 현미경과 미세 유체 시스템을 결합한 실험 시스템과 생화학 구이도하에서 집단 이동의 역학을 정량화하는 방법에 대한 데모입니다.

초록

세포는 화학 자극에 반응하여 이동 패턴을 변경, 자극의 그라데이션을 포함. 화학 구배의 방향으로 세포 이동, 화학 요법으로 알려진, 개발에 중요 한 역, 면역 반응, 상처 치유, 그리고 암 전이. 화학요법은 생체 내에서 세포의 집합뿐만 아니라 단일 세포의 이동을 조절하는 동안, 시험관 내 연구는 단일 세포 화학 요법에 초점을 맞추고, 부분적으로 적절한 실험 도구의 부족으로 인해. 이러한 격차를 해소하기 위해 여기서 설명한 것은 미세 유체와 미세 패턴화를 결합하여 집단 세포 이동에 대한 화학 적 그라데이션의 효과를 입증하는 독특한 실험 시스템입니다. 또한 견인 현미경 검사법과 단층 스트레스 현미경 검사가 시스템에 통합되어 기판뿐만 아니라 주변 세포 간의 세포력 의 변화를 특성화합니다. 개념 증명으로서, Madin-Darby 개 신장 (MDCK) 세포의 마이크로 패턴 원형 섬의 이동은 알려진 산란 인자 인자 (HGF)의 구배 하에서 테스트됩니다. HGF의 높은 농도 근처에 위치한 세포는 세포 섬 내의 반대쪽에 있는 세포보다 더 빨리 이동한다는 것을 발견했습니다. 같은 섬 내에서, 셀 룰 러 견인 은 양쪽에 유사, 하지만 세포 간 스트레스는 높은 HGF 농도의 측면에 훨씬 낮은. 이 새로운 실험 시스템은 세포 집단에 의한 화학 전술 이동의 역학을 연구하는 새로운 기회를 제공 할 수 있습니다.

서문

생물학적 시스템에서의 세포 이동은 조직 형성, 면역 반응 및 상처 치유1,2,3에관여하는 근본적인 현상이다. 세포 이동은 또한 암 같은 일부 질병에 중요 한 과정4. 셀은 종종 집단 세포 마이그레이션4,5로알려진 개별이 아닌 그룹으로 마이그레이션됩니다. 세포가 집합적으로 이동하려면 미세 환경의 감지가 필수적입니다6. 예를 들어, 세포는 물리화학적 자극을 인식하고 운동성, 세포-기질 상호 작용 및 세포-세포 상호 작용을 변경하여 반응하여 화학 적 구배를 따라 방향 이동을초래하는 7,8, 9,10. 이러한 연결을 바탕으로, 화학력 체11,12,13의 그라데이션과 같은 잘 제어 된 화학 미세 환경을 만들 수있는 실험실 온 칩 기술에서 급속한 발전이 이루어졌습니다. . 이 실험실에 칩 기지를 둔 미세 유체학은 이전에 세포 앙상블 또는 세포 구형의 화학요법을 공부하기 위하여 이용된 동안14,15,16,17, 단일 셀 마이그레이션18,19,20,21의맥락에서 주로 사용되었습니다. 화학 구배에 대한 세포 집단 반응의 기초가되는 메커니즘은 여전히 잘 이해되지 않습니다14,22,23,24,25,26 . 따라서, 수용성 인자의 침실성 제어뿐만 아니라 세포의 생물 물리학의 실체 관찰을 가능하게하는 플랫폼의 개발은 집단 세포 이동 뒤에 메커니즘을 해명하는 데 도움이 될 것입니다.

여기에서 개발및 기술된 다중 채널화 미세유체 시스템은 패턴세포 클러스터의 이동을 조절하는 수용성 인자의 농도 구배를 생성할 수 있게 해줍니다. 본 연구에서, 간세포 성장 인자(HGF)는 매딘-다비 개 신장(MDCK) 세포의 철새 거동을 조절하기 위해 선택된다. HGF는 세포-세포 무결성을 감쇠시키고세포(27,28)의운동성을 향상시키는 것으로 알려져 있다. 미세 유체 시스템에서, 푸리에 변환 견인 현미경 검사법 및 단층 스트레스 현미경도 통합되어 HGF에 대한 응답으로 구성 세포에 의해 유도 된 운동성, 수축력 및 세포 간 긴장을 분석 할 수 있습니다. 그라데이션. 같은 섬 내에서, HGF의 높은 농도 근처에 위치한 세포는 더 빨리 이동하고 낮은 HGF 농도와 측면에있는 것보다 낮은 세포 간 스트레스 수준을 보여줍니다. 결과는 이 새로운 실험 시스템이 각종 수용성 요인의 화학 구배의 밑에 집단 적인 세포 이동을 관련시키는 필드에 있는 그밖 질문을 탐구하기 위하여 적당하다는 것을 건의합니다.

프로토콜

참고: 스텐실(두께 = 250 μm) 및 마이크로채널 부품(두께 = 150μm), 유리 에칭(깊이 = 100 μm) 및 주조 제작을 위한 SU-8 금형의 리소그래피는 컴퓨터 지원 설계 소프트웨어를 사용하여 제조업체에 설계를 전송하여 아웃소싱되었습니다.

1. 폴리디메틸실록산(PDMS) 스텐실 및 마이크로채널 제조

  1. 스텐실과 마이크로채널의 마이크로패턴을 디자인합니다.
  2. 실리콘 웨이퍼(직경 4")에서 SU-8 금형(스텐실의 경우 ~250μm, 마이크로채널의 경우 ~150μm)을 제작 또는 아웃소싱합니다.
  3. 염기 엘라스토머 및 경화제를 10:1의 비율로 혼합하여 PDMS 혼합물을 준비한다.
    1. 50 mL 원엽 튜브에 염기 엘라스토머 15 mL을 놓고 1.5 mL의 경화제를 추가합니다. 이 중 두 가지를 준비합니다.
    2. PDMS 혼합물을 5분 동안 소용돌이. 196 x g에서 PDMS 혼합물을 1분 동안 1분 동안 원심분리하여 기포를 제거한다.
  4. PDMS 스텐실을 제조하기 위해, PDMS가 SU-8 기둥의 측면을 만지지만 SU-8 패턴의 상단이 아니라는 것을 않도록 SU-8 패턴 영역을 피하면서 웨이퍼에 PDMS 혼합물의 ~1 mL을 붓습니다.
    1. 웨이퍼를 실온(RT)에서 30분 이상 평평한 표면에 놓습니다. 2시간 이상 80°C에서 건조 오븐에서 PDMS를 경화합니다.
    2. SU-8 몰드에서 PDMS를 조심스럽게 벗겨내고 14mm 중공 펀치를 사용하여 얇은 PDMS 멤브레인을 다듬습니다. 끈적끈적한 테이프를 사용하여 PDMS 조각표면의 먼지를 제거하고 PDMS 스텐실을 오토클레이브합니다.
  5. PDMS 마이크로 채널을 제조하려면 SU-8 금형위에 ~30 mL의 PDMS 혼합물을 붓습니다.
    1. 진공 챔버에서 30 분 동안 탈가하고 2 시간 이상 동안 80 °C에서 건조 오븐에서 PDMS를 경화합니다.
    2. SU-8 금형에서 PDMS를 조심스럽게 벗겨내고 PDMS를 24mm x 24mm 크기로 자른다. 각 PDMS 블록에서 1mm 생검 펀치를 사용하여 콘센트 1개와 입구 3개를 만듭니다.

2. 폴리 아크릴 아미드 (PA) 젤 바닥 유리의 제조

  1. 직사각형 마이크로 웰(6mm x 12mm, 깊이 100μm깊이 29)을절단 및 에칭하여 직사각형 슬라이드 안경(24mm x 24mm x 1mm)을 제조 또는 아웃소싱합니다.
  2. 바닥유리(30)의표면을 실라제한다.
    1. 200 mL의 탈이온수(DIW), 80 μL의 아세트산 및 50 μL의 3-(트리메톡시실릴) 프로필 메타크릴레이트(TMSPMA)를 1시간 동안 혼합하여 바인드 실란 용액을 준비한다.
      주의: TMSPMA는 가연성 액체입니다. 재료 안전 데이터 시트의 권장 사항을 따르십시오. 화학 연기 후드에만 사용하십시오.
    2. 끈적끈적한 테이프로 유리 표면에서 먼지를 제거하고 유리를 오토클레이브합니다.
    3. 바인드 시란 용액의 100 μL로 바닥 유리의 에칭 된 표면을 덮고 1 시간 동안 RT에 유리를 둡니다.
    4. DIW 3x로 유리를 헹구고 주변 공기 온도에서 또는 공기를 불어 건조시키십시오.
  3. PA겔(31)을위한 겔 용액을 준비한다.
    1. DIW 1 mL에 5 mg의 APS를 용해시킴으로써 0.5 %(v) 황산 암모늄 (APS)의 신선한 용액을 준비하십시오.
    2. 40% 아크릴아미드 용액 138 μL, 2% 비스 아크릴아미드 용액 101 μL, 형광 입자 용액 5 μL (0.2 μm), 및 655μL의 DIW로 구성된 PA 겔 용액을 준비합니다.
      주의: 아크릴아미드 및 비사크릴아미드 솔루션은 독성이 있습니다. 보호 장갑, 의류 및 눈 보호 착용하십시오. 빛으로부터 형광 입자를 함유한 PA 젤 용액을 보호하십시오.
      참고 : 배피하기 전에 형광 비드 용액을 소용돌이하여 배치 당 균일 한 수의 형광 비드를 얻습니다.
    3. APS 용액 100 μL과 테트라메틸레틸렌디아민 1 μL(TEMED)을 첨가한 후, 혼합 겔 용액을 10 μL을 직사각형 마이크로웰 에 옮기고 원형 커버슬립(18 mm)을 위에 놓습니다.
      참고 : 거품없이 PA 젤로 바닥 유리를 채우려면 바닥 유리의 홈에 충분한 젤 용액을 놓고 커버 슬립을 젤 용액 위에 조심스럽게 밀어 넣고 여분의 젤 용액을 제거하십시오.
      주의: 젤을 약 40분 동안 천천히 경화시. 원심 분리 젤에 대한 다음 절차는 가능한 한 빨리 수행되어야합니다.
    4. 맞춤형 유리, 젤 용액 및 커버슬립의 조립을 뒤집은 다음 96 x g에서 10 분 동안 원심 분리기를 사용하여 PA 젤의 상단 층에 형광 입자를 가져옵니다.
    5. 원심분리기에서 어셈블리를 제거하고 커버슬립이 아래를 향하여 평평한 표면에 놓습니다.
      참고: 2.3.6단계부터 바이오 안전 성 캐비닛에서 샘플을 처리합니다.
    6. 30 분 후, 조립체를 뒤집어 35mm 페트리 접시에 놓고 2 mL의 DIW로 채우고 (집게를 사용하여) 한쪽으로 밀어 커버 슬립을 부드럽게 제거합니다.
      참고 : 경화 PA 젤은 1 개월 동안 DIW에 보관 할 수 있습니다. 그러나, 일단 콜라겐이 PA 젤에 코팅되면, 1 일 이내에 실험에 사용해야합니다.
  4. PA 젤에 콜라겐을 코팅합니다.
    1. 따뜻한 50 mM HEPES 완충액에 1 mg/mL 설포수치니미딜 6-(4'-아지도-2'-니트로페닐아미노) 헥사노에이트(설포-SANPAH)를 녹입니다. 용액의 200 μL을 겔 표면에 떨어뜨리고 UV 광(365 nm 파장)에 의해 10분 동안 활성화합니다.
      참고 : 빛으로부터 설포 - SANPAH를 보호하십시오.
    2. 겔을 0.1M[4-(2-하이드록세틸)-1-피페라진에탄설포닉산으로 헹구고; HEPES] 버퍼 2x 및 PBS 1x.
    3. PA 겔을 콜라겐 용액(PBS에서 100 μg/mL, 래트 테일 콜라겐 유형 I)으로 밤새 4°C에서 코팅합니다. 다음 날, PBS 3x로 씻으소서.

3. 세포 섬의 미세 패턴

  1. F-127(재료표)용액 [PBS에서 2% (w/v)]을 준비하고 오토클레이브 된 PDMS 스텐실을 F-127 용액에 담급니다. 1 시간 동안 37 °C 인큐베이터에 보관하십시오.
  2. 세포 용액 (2 x 106 세포 / mL)을 세포 배양 배지에서 준비 : Dulbecco의 변형 된 독수리 배지 (DMEM)와 10 % 태아 소 혈청 (FBS) 및 1 % 항생제 항 균제 (AA).
  3. PDMS 스텐실을 PBS 3x로 세척하고 PDMS 스텐실과 PA 겔 모두에서 액체를 제거합니다. PDMS 스텐실을 PA 겔위에 놓고 스텐실에 PBS를 추가합니다.
  4. 부드럽게 파이펫팅하여 PDMS 스텐실 구멍의 거품을 제거합니다. 기포를 제거한 후 PDMS 스텐실 표면에서 PBS를 제거합니다.
  5. PDMS 스텐실에 200 μL의 세포 용액을 넣은 후, 세포가 PA 겔에 부착되도록 PA 겔을 1 시간 동안 인큐베이터에 보관하십시오.
  6. 세포 배양 배지로 세포 용액을 부드럽게 씻어 내고 PDMS 스텐실을 제거하고 더 많은 세포 배양 배지를 추가하십시오. 현미경으로 세포 섬의 형성을 확인하십시오.

4. PDMS 마이크로 채널을 가진 PA 젤의 조립

  1. 끈적끈적한 테이프를 사용하여 PDMS 마이크로채널의 먼지를 제거한 다음 오토클레이브를 제거합니다.
  2. PDMS 마이크로채널의 표면을 산소 플라즈마(80W, 50kHz)로 30초 동안 처리합니다.
  3. PA 젤 충전 바닥 유리에 액체를 제거 한 후, 하단 유리의 상단에 PDMS 마이크로 채널을 놓고 사용자 정의 유리 홀더에 어셈블리를 넣어.
  4. 마이크로채널을 세포 배양 배지로 채웁니다.
    주의: 피펫으로 따뜻한 매체를 부드럽게 플러시하여 채널에 갇힌 모든 거품을 제거하십시오. 또한, 거품을 제거하는 동안, 마이크로 패턴 세포 섬을 분리하지 않도록하십시오.

5. 통합 미세 유체 시스템

  1. 튜브를 연결합니다.
    1. 바늘 끝(18G)을 다듬고 90°로 구부려 커넥터를 준비합니다.
    2. 3개의 입구와 1개의 콘센트에 대한 튜브 라인을 준비합니다.
      1. 입구 튜빙의 경우 트리밍 된 바늘과 30cm 미니 볼륨 라인을 3 방향 스톱콕과 연결하십시오. 이 중 세 가지를 준비한다.
      2. 콘센트 튜빙의 경우 트리밍 된 바늘과 75cm 미니 볼륨 라인을 3 방향 스톱콕과 연결하십시오. 이 중 하나를 준비합니다.
      3. 1 시간 동안 예열 된 매체로 튜브 라인을 채웁니다.
        주의: 주사기로 따뜻한 매체를 부드럽게 플러시하여 튜브 라인에 갇힌 모든 거품을 제거하십시오.
    3. 주사기에서 플런더를 제거하고 입구 튜브 라인을 연결하여 저수지를 준비합니다.
    4. 각 튜빙 라인의 바늘 커넥터를 미세 유체 장치의 3개의 입구와 하나의 콘센트에 연결합니다.
  2. 저수지에 신선한 배지 또는 컨디셔닝 된 매체가 각각 3 mL로 채웁니다.
    1. 그라데이션 시험을 위해, 세포 배양 배지에서 좌측 입구 저장소를 20 ng/mL HGF로 채웁니다.
    2. 농도 구배의 시각화를 위해 왼쪽 입구 저장소에 200 μg/mL 형광 염료(로다민 B-dextran, 70 kDa)를 추가합니다.
    3. 출구 튜브 라인을 주사기 펌프에 연결합니다.
      참고 : 주사기 펌프의 작동 모드는 "철수"입니다. 유량은 주사기 펌프의 용량 및 작동 속도에 따라 변경됩니다.
  3. 기존의 에피플루오닉 현미경의 단계에 통합된 미세유체 시스템을 배치합니다.
    주의: 미세 유체 채널에서 HGF의 완만한 구배를 생성하려면 유속이 0.1 μL/min만큼 느려야 합니다. 이것은 2 시간 동안 안정화가 필요하도록 충분히 민감하며 실험 중에 물리적 인 장애를 피하기 위해주의를 기울여야합니다.

6. 이미지 수집

  1. 인큐베이터에 보관된 자동화된 현미경을 사용하여 최대 24시간 동안 10분마다 이미지를 찍습니다. 각 시점에서, 세포 이동을 시각화하는 위상 이미지, PA 젤에 내장 된 형광 구슬을 시각화하는 녹색 형광 이미지, 빨간색 형광 이미지를 시각화하는 등 세 가지 채널에서 4배 대물 렌즈를 사용하여 이미지 세트를 가져 가라. 화학 물질의 농도 구배.
  2. 시간 경과 이미지를 복용 한 후, PA 젤에서 세포를 분리하기 위해 마이크로 채널에 0.25 % 트립신 -EDTA 솔루션을 주입하십시오. 젤에서 세포를 완전히 제거한 후 녹색 형광 이미지를 가져 가서 견인 현미경 검사법 용 참조 이미지로 사용하십시오.

7. 데이터 분석

참고 : 데이터 분석을위한 사용자 정의 코드는 MATLAB을 사용하여 개발되었으며, 세부 사항은 다른 곳에서 설명되어32,33,34,35,36.

  1. 위상 이미지 분석의 경우 입자 이미지 속도측정36을사용하여 두 개의 연속상 이미지에서 변위를 계산합니다.
  2. Fourier 변환 견인 현미경 검사법의 경우 각 녹색 형광 이미지를 참조 이미지와 비교하고 입자 이미지 속도계36을사용하여 각 이미지의 변위를 계산합니다. 변위에서, 푸리에 변환 견인 현미경33,34,37을사용하여 PA 젤에 세포에 의해 만들어진 견인력을 복구합니다.
  3. 견인 데이터에서 유한 요소 방법32,34,38에기초하여 단층 응력 현미경을 사용하여 세포 섬의 단층 내의 응력을 계산합니다.

결과

화학 구배 하에서 집단 이동을 탐구하기 위해 미세 유체 시스템은 견인 현미경 검사법(그림 1)과통합되었습니다. 통합 시스템을 구축하기 위해, 폴리아크릴아미드(PA) 겔을 맞춤형 절단 유리상에 시공하고, MDCK 세포를 PDMS 스텐실로 만든 미세패턴 섬 내에서 시종하였다. 이 실험을 위해, MDCK 세포의 12개의 섬(3개의 열에 의하여 4개의 행, ~700 μm의 직경)이 생성되었다. PA 겔에 부...

토론

구성 세포의 집단 이동은 개발 및 재생 중에 중요한 과정이며, 이동 방향은 종종 성장 인자의 화학구배4,23에의해 유도된다. 집단 마이그레이션 중에 셀은 인접한 셀 및 기본 기판과 계속 상호 작용합니다. 이러한 기계적 상호 작용은듀로탁시스(42,plithotaxis33,및 kenotaxis43)와같은 새로운 현상을 야기한?...

공개

저자는 그들이 경쟁 적인 재정적 이익이 없다고 선언합니다.

감사의 말

이 작품은 한국 정부(MSIP)의 후원을 받은 국립연구재단(NRF)의 지원으로 지원되었다. NRF-2017R1E1A1A01075103), 고려대학교 보조금, BK 21 플러스 프로그램. 그것은 또한 건강의 국가 학회에 의해 지원 되었다 (U01CA202123, PO1HL120839, T32HL00718, R01EY019696).

자료

NameCompanyCatalog NumberComments
0.25% trypsin-EDTA (1X)Gibco25200-056
1 M HEPES buffer solutionGibco15630-056
1 mm Biopsy punchIntegra Miltex33-31AA-P/25
100 mm petri dishesSPL10100100 mm diameter, 15 mm height
14 mm hollow punchILJIN124-0571
18 mm Ø CoverslipMarienfeld-Superior111580Circular 18 mm, thickness No. 1 (0.13 to 0.16 mm)
2% bis-acrylamide solutionBio-Rad1610142Wear protective gloves, clothing, and eye protection.
3-(Trimethoxysilyl)propyl methacrylate (TMSPMA)Sigma-Aldrich440159-500ML
3-way stopcockHyupsungHS-T-61NCAUTION: do not use if previously opened. do not resterlize or resuse
30 cm minimum volume line (for pediatric)HyupsungHS-MV-30CAUTION: do not use if previously opened. do not resterlize or resuse
35 mm cell culture dishCorning430165
40% Acrylamide SolutionBio-Rad1610140Wear protective gloves, clothing, and eye protection.
75 cm minimum volume line (for pediatric)HyupsungHS-MV-75CAUTION: do not use if previously opened. do not resterlize or resuse
acetic acidJ.T. BakerJT9508-03
Ammonium persulfate (APS)Bio-Rad1610700
Antibiotic-AntimycoticGibco15240-062
Bottom glass chipMicroFIT24 x 24 x 1 mm, custom-made, rectangular groove (6 x 12 mm, depth : 100 μm)
Collagen typeI, Rat tailCorning354236
Custom glass holderHan-Gug Mechatronicscustom-made
Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM)WelgeneLM 001-11
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (PBS)BiowestL0615-500w/o Magnesium, Calcium
Fetal bovine serum (FBS)Gibco26140-179
FluoSpheres amine-modified microspheresInvitrogenF87640.2 µm, yellow-green fluorescent(505/515)
Hepatocyte Growth Factor (HGF)Sigma-AldrichH1404-5UGrecombinant, human
JuLI stage live cell imaging systemNanoEnTek InAutomated X-Y-Z stage and fluorsent imaging Incubator-compatible (37 °C and 5% CO2)
Madin-Darby Canine Kidney (MDCK) celltype II
Oxygen plasma systemFemto ScienceCUTE-MPR
Pluronic F-127Sigma-AldrichP2443-250G
Rhodamine B isothiocyanate–dextranSigma-AldrichR9379-100MG70 kDa, used to estimate spatiotemporal distribution of HGF in the microfluidic channel
Steril hypodermic needle 18 GKOVAXTrim the tip of the needle and bend it 90 degrees for connecting in/out ports with volume line
Sticky tape3M/Scotch810D33 m x 19 mm
SU-8 master moldsMicroFIT4” diameter, custom-made
sulfosuccinimidyl 6-(4’-azido-2’-nitrophenylamino)hexanoate (Sulfo-SANPAH)Thermo Scientific22589Store at -20°C. Store protected from moisture and light.
Sylgard 184 Elastomer KitDow CorningPDMS
Syringe pumpChemyx Inc.model fusion 720withdraw fluid
SyringesKOVAX1, 3, 5, 10, or 50 cc for using inlet reservoir or outlet syringe pump
tetramethylethylenediamine (TEMED)Bio-Rad1610800Wear protective gloves, clothing, and eye protection.
Ultraviolet (UV) lampUVP LLC95-0248-02365 nm wavelength

참고문헌

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