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In questo articolo

  • Riepilogo
  • Abstract
  • Introduzione
  • Protocollo
  • Risultati
  • Discussione
  • Divulgazioni
  • Riconoscimenti
  • Materiali
  • Riferimenti
  • Ristampe e Autorizzazioni

Riepilogo

La migrazione collettiva delle cellule nello sviluppo, nella guarigione delle ferite e nella metastasi del cancro è spesso guidata dai gradienti dei fattori di crescita o delle molecole di segnalazione. Descritto qui è un sistema sperimentale che combina la microscopia a trazione con un sistema microfluidico e una dimostrazione di come quantificare la meccanica della migrazione collettiva in gradiente biochimico.

Abstract

Le cellule cambiano i modelli di migrazione in risposta a stimoli chimici, compresi i gradienti degli stimoli. La migrazione cellulare nella direzione di un gradiente chimico, noto come chemiotassi, svolge un ruolo importante nello sviluppo, nella risposta immunitaria, nella guarigione delle ferite e nella metastasi del cancro. Mentre la chemiotassi modula la migrazione di singole cellule e raccolte di cellule in vivo, la ricerca in vitro si concentra sulla chemiotassi una singola cellula, in parte a causa della mancanza di strumenti sperimentali adeguati. Per colmare questa lacuna, descritta qui c'è un sistema sperimentale unico che combina microfluidica e micropatterning per dimostrare gli effetti dei gradienti chimici sulla migrazione collettiva delle cellule. Inoltre, la microscopia a trazione e la microscopia a stress monomerio sono incorporate nel sistema per caratterizzare i cambiamenti nella forza cellulare sul substrato e tra le cellule vicine. Come prova di concetto, la migrazione di isole circolari micromodellate di cellule renali canine Madin-Darby (MDCK) è testata sotto un gradiente di fattore di crescita epatociti (HGF), un fattore di dispersione noto. Si trova che le cellule situate vicino alla maggiore concentrazione di HGF migrano più velocemente di quelle sul lato opposto all'interno di un'isola cellulare. All'interno della stessa isola, la trazione cellulare è simile su entrambi i lati, ma lo stress intercellulare è molto più basso sul lato di una maggiore concentrazione di HGF. Questo nuovo sistema sperimentale può fornire nuove opportunità per studiare la meccanica della migrazione chemiotattica da parte dei collettivi cellulari.

Introduzione

La migrazione cellulare nei sistemi biologici è un fenomeno fondamentale coinvolto nella formazione dei tessuti, nella risposta immunitaria e nella guarigione delle ferite1,2,3. La migrazione cellulare è anche un processo importante in alcune malattie come il cancro4. Le celle spesso migrano come un gruppo piuttosto che singolarmente, che è noto come migrazione collettiva di celle4,5. Affinché le cellule si muovano collettivamente, il rilevamento del microambiente è essenziale6 . Ad esempio, le cellule percepiscono gli stimoli fisici e reagiscono cambiando motilità, le interazioni tra cellule e substrati e interazioni cellula-cellula, con conseguente migrazione direzionale lungo un gradiente chimico7,8, 9,10. Sulla base di questa connessione, sono stati fatti rapidi progressi nelle tecnologie lab-on-a-chip in grado di creare microambienti chimici ben controllati come il gradiente di un chemioattraente11,12,13 . Mentre queste microfluidiche basate su lab-on-a-chip sono state precedentemente utilizzate per studiare la chemiotassi dell'insieme cellulare o degli sferoidi cellulari14,15,16,17, sono stati utilizzati principalmente nel contesto della migrazione a cella singola18,19,20,21. I meccanismi alla base di una risposta collettiva cellulare a un gradiente chimico non sono ancora ben compresi14,22,23,24,25,26 . Così, lo sviluppo di una piattaforma che consenta il controllo spatiotemporale dei fattori solubili e l'osservazione in situ della biofisica delle cellule aiuterà a svelare i meccanismi alla base della migrazione collettiva delle cellule.

Sviluppato e descritto qui è un sistema microfluidico multicanale che consente la generazione di un gradiente di concentrazione di fattori solubili che modula la migrazione di cluster cellulari modellati. In questo studio, il fattore di crescita dell'epatocite (HGF) è scelto per regolare il comportamento migratorio delle cellule del rene canino Madin-Darby (MDCK). HGF è noto per attenuare l'integrità delle cellule cellulari e migliorare la motilità delle cellule27,28. Nel sistema microfluidico, sono incorporate anche la microscopia a trazione a trazione e la microscopia a stress del monostrato, che consente l'analisi della motilità, della forza contrattile e della tensione intercellulare indotta dalle cellule costituenti in risposta a un HGF pendenza. All'interno della stessa isola, le cellule situate vicino alla maggiore concentrazione di HGF migrano più velocemente e mostrano livelli di stress intercellulare inferiori rispetto a quelli sul lato con una minore concentrazione di HGF. I risultati suggeriscono che questo nuovo sistema sperimentale è adatto per esplorare altre questioni in campi che coinvolgono la migrazione cellulare collettiva sotto gradienti chimici di vari fattori solubili.

Protocollo

NOTA: La litografia degli stampi SU-8 per gli stencil (spessore - 250 m) e le parti microcanale (spessore - 150 m), l'incisione in vetro (profondità : 100 m) e la fabbricazione della casta sono state esternalizzate inviando progetti utilizzando software di progettazione assistiti da computer ai produttori.

1. Fabbricazione di stencil polidimethylsixane (PDMS) e microcanale

  1. Progettare il micromodello di stencil e microcanale.
  2. Fabbricare o esternalizzare stampi SU-8 (spessore di 250 m per gli stencil e di 150 m per i microcanali) su wafer di silicio (4" di adiemetro).
  3. Preparare la miscela PDMS mescolando l'elastomero di base e l'agente di polimerità ad un rapporto di 10:1.
    1. Posizionare 15 mL del fetoro di base in un tubo conico da 50 mL e aggiungere 1,5 mL di agente di polimerità. Preparatene due di questi.
    2. Vorticare la miscela PDMS per 5 min. Centrifugare la miscela PDMS a 196 x g per 1 min per rimuovere le bolle.
  4. Per fabbricare lo stencil PDMS, versare 1 mL della miscela PDMS sul wafer, evitando le regioni con motivi SU-8 in modo che il PDMS tocchi il lato dei pilastri SU-8 ma non la parte superiore del modello SU-8.
    1. Posizionare il wafer su una superficie piana per oltre 30 min a temperatura ambiente (RT). Curare il PDMS in forno a secco a 80 gradi centigradi per oltre 2 h.
    2. Togliere con cura il PDMS dallo stampo SU-8 e tagliare la sottile membrana PDMS utilizzando un punzone cavo di 14 mm. Rimuovere la polvere sulla superficie dei pezzi PDMS utilizzando nastro adesivo e autoclave gli stencil PDMS.
  5. Per fabbricare il microcanale PDMS, versare 30 mL di miscela PDMS sullo stampo SU-8.
    1. Degas per 30 min in una camera a vuoto e curare il PDMS in forno a secco a 80 gradi centigradi per oltre 2 h.
    2. Togliere con cura il PDMS dallo stampo SU-8 e tagliare il PDMS a una dimensione di 24 mm x 24 mm. In ogni blocco PDMS, creare una presa e tre prese utilizzando un punzone biopsia di 1 mm.

2. Preparazione del vetro inferiore con gel poliacrilammide (PA)

  1. Produrre o esternalizzare bicchieri rettangolari (24 mm x 24 mm x 1 mm) con un micro-pozzetto rettangolare (6 mm x 12 mm, 100 m di profondità29) tagliando e incidendo bicchieri.
  2. Silanizzare la superficie di un vetro inferiore30.
    1. Preparare una soluzione legare il silano mescolando 200 mL di acqua deionizzata (DIW), 80 -L di acido acetico e 50 l di 3-(trimethoxysilyl) methacryla (TMSPMA) per 1 h.
      AMMONIMento: TMSPMA è un liquido combustibile. Seguire le raccomandazioni contenute nelle schede tecniche sulla sicurezza dei materiali. Utilizzare solo in una cappa di fumi chimici.
    2. Rimuovere la polvere dalla superficie del vetro con nastro adesivo e autoclatura il vetro.
    3. Coprire la superficie incisa del vetro inferiore con 100 l l della soluzione di sbarramento e lasciare il vetro a RT per 1 h.
    4. Sciacquare il vetro con DIW 3x e lasciare asciugare il vetro alla temperatura ambiente dell'aria o soffiando aria.
  3. Preparare una soluzione di gel per il gel PA31.
    1. Preparare una soluzione fresca di 0,5 % (w/v) persulato di ammonio (APS) sciogliendo 5 mg di APS in 1 mL di DIW.
    2. Preparare la soluzione di gel PA composta da 138 luna del 40% di acrilamide, 101 ll del 2% di soluzione bis-acrilamide, 5 L di soluzione di particelle fluorescenti (0,2 m) e 655 L di DIW.
      AIUTO: Le soluzioni di acrilammide e bisacricchimide sono tossiche. Indossare guanti protettivi, indumenti e protezione degli occhi. Proteggere la soluzione di gel PA contenente particelle fluorescenti dalla luce.
      NOTA: Vorticare la soluzione di perline fluorescenti prima del pipettaggio per ottenere un numero uniforme di perline fluorescenti per lotto.
    3. Dopo aver aggiunto 100 l-L della soluzione APS e 1 L L di tetrametiletilelenedia (TEMED), trasferire 10 L di soluzione gel misto sul micro-po rettangolare e posizionare su un coperchio circolare (18 mm).
      NOTA: Per riempire il vetro inferiore con gel PA senza bolle, posizionare una soluzione gel sufficiente sulla scanalatura del vetro inferiore, far scorrere con attenzione il coperchio sulla soluzione gel e rimuovere qualsiasi soluzione di gel in eccesso.
      AVVISO: Il gel viene lentamente curato per circa 40 min. La seguente procedura per centrifugare i gel deve essere eseguita il più presto possibile.
    4. Capovolgere l'assemblaggio di vetro personalizzato, soluzione gel e coverslip, quindi centrifugare per 10 min a 96 x g per portare particelle fluorescenti allo strato superiore di gel PA.
    5. Rimuovere l'assieme dalla centrifuga e posizionarlo sulla superficie piana con il coperchio rivolto verso il basso.
      NOTA: a partire dal passaggio 2.3.6, gestire i campioni in un armadio di biosicurezza.
    6. Dopo 30 min, capovolgere l'assieme e metterlo in una parabola Petri da 35 mm, riempire con 2 mL di DIW e (utilizzando pinze) rimuovere delicatamente il coperchio facendolo scorrere su un lato.
      NOTA: Il gel PA curato può essere conservato in DIW per 1 mese. Tuttavia, una volta che il collagene è rivestito sul gel PA, dovrebbe essere utilizzato in un esperimento entro 1 giorno.
  4. Collagene cappotto sul gel PA.
    1. Sciogliere 1 mg/mL sulfosuccinimidyl 6-(4'-azido-2'-nitrophenylamino) esanoato (sulfo-SANPAH) in tampone CALDO HEPES 50 mM. Eliminare 200 l della soluzione sulla superficie del gel e attivare con la luce UV (365 nm lunghezza d'onda) per 10 min.
      NOTA: Proteggere il sulfo-SANPAH dalla luce.
    2. Sciacquare il gel con 0,1 M [4-(2-idxyethyl)-1-piperazineethanesulnic acid; HEPES] buffer 2x e con PBS 1x.
    3. Rivestire il gel PA con soluzione di collagene (100 g/mL in PBS, collagene coda di ratto tipo I) a 4 gradi durante la notte. Il giorno successivo, lavare con PBS 3x.

3. Micropatterning di isole cellulari

  1. Preparare la soluzione F-127 (Table of Materials) [2% (w/v) in PBS] e immergere lo stencil PDMS autoclaved nella soluzione F-127. Conservarlo in un'incubatrice da 37 gradi centigradi per 1 h.
  2. Preparare la soluzione cellulare (2 x 106 cellule/mL) nei mezzi di coltura cellulare costituiti da: mezzo dell'Aquila modificato di Dulbecco (DMEM) con 10% siero bovino fetale (FBS) e 1% antimicotico antibiotico (AA).
  3. Lavare lo stencil PDMS con PBS 3x e rimuovere il liquido sia dallo stencil PDMS che dal gel PA. Posizionare lo stencil PDMS sul gel PA e aggiungere PBS allo stencil.
  4. Rimuovere le bolle nei fori dello stencil PDMS pipetting delicatamente. Dopo aver rimosso le bolle, rimuovere PBS dalla superficie dello stencil PDMS.
  5. Dopo aver messo 200 l di soluzione cellulare su stencil PDMS, tenere il gel PA in un'incubatrice per 1 h in modo che le cellule si attacchino al gel PA.
  6. Lavare delicatamente la soluzione cellulare con i mezzi di coltura cellulare, rimuovere lo stencil PDMS e aggiungere più supporti di coltura cellulare. Controllare la formazione di isole cellulari al microscopio.

4. Assemblaggio di gel PA con microcanale PDMS

  1. Rimuovere la polvere sul microcanale PDMS utilizzando il nastro adesivo, quindi autoclave.
  2. Trattare la superficie del microcanale PDMS con plasma di ossigeno (80 W, 50 kHz) per 30 s.
  3. Dopo aver rimosso qualsiasi fluido sul vetro inferiore pieno di gel PA, posizionare il microcanale PDMS sopra il vetro inferiore e mettere l'assemblaggio sul supporto di vetro personalizzato.
  4. Riempire il microcanale con il supporto di coltura cellulare.
    AGGIORNAMENTO: Assicurarsi di rimuovere tutte le bolle intrappolate nei canali scaricando delicatamente supporti caldi con una pipetta. Inoltre, durante la rimozione delle bolle, assicurarsi di non staccare le isole cellulari micromodellate.

5. Sistema microfluidico integrato

  1. Collegare i tubi.
    1. Preparare i connettori tagliando la punta degli aghi (18 G) e piegandola di 90 gradi.
    2. Preparare le tubazione per tre prese e una presa.
      1. Per i tubi di inserimento, collegare l'ago tagliato e una linea mini-volume di 30 cm con un stopcock a tre vie. Preparate tre di questi.
      2. Per i tubi di uscita, collegare l'ago tagliato e una linea di mini-volume 75 cm con un stopcock a tre vie. Prepara uno di questi.
      3. Riempire le linee di tubazione con il supporto che è stato preriscaldato per 1 h.
        AUTO: Assicurarsi di rimuovere tutte le bolle intrappolate nelle linee di tubazione scaricando delicatamente supporti caldi con una siringa.
    3. Preparare i serbatoi rimuovendo i tuffr dalle siringhe e collegando le linee di tubazione di inseglio.
    4. Collegare i connettori ad ago di ogni linea di tubazione nelle tre prese e una presa del dispositivo microfluidico.
  2. Riempire i serbatoi con 3 mL di mezzo fresco o mezzo condizionato ciascuno.
    1. Per il test del gradiente, riempire il serbatoio di inserito sinistro con 20 ng/mL HGF nel mezzo di coltura cellulare.
    2. Per la visualizzazione del gradiente di concentrazione, aggiungere un colorante fluorescente di 200 g/mL (rhodamine B-dextran, 70 kDa) al serbatoio di inserimento sinistro.
    3. Collegare la linea di tubazione di uscita a una pompa di siringa.
      NOTA: La modalità operativa della pompa della siringa è "ritiro". La portata viene modificata in base alla capacità della siringa e alla velocità di funzionamento della pompa della siringa.
  3. Posizionare il sistema microfluidico integrato sullo stadio di un microscopio epifluorescente convenzionale.
    AVVISO: Per generare un gradiente delicato di HGF nel canale microfluidico, la portata dovrebbe essere lenta come 0,1 l/min. Questo è sufficientemente sensibile in modo che richieda la stabilizzazione per 2 h, e deve essere presa cura per evitare disturbi fisici durante l'esperimento.

6. Acquisizione di immagini

  1. Scatta immagini ogni 10 min per un massimo di 24 h utilizzando un microscopio automatico ospitato in un'incubatrice. Ad ogni punto, scatta una serie di immagini utilizzando una lente obiettivo 4x in tre diversi canali, tra cui l'immagine di fase per visualizzare la migrazione delle cellule, l'immagine fluorescente verde per visualizzare le perline fluorescenti incorporate nel gel PA e l'immagine fluorescente rossa per visualizzare gradiente di concentrazione di una sostanza chimica.
  2. Dopo aver scattato immagini time-lapse, infondere la soluzione trypsin-EDTA dello 0,25% in microcanali per staccare le cellule dal gel PA. Dopo aver completamente rimosso le cellule dal gel, prendi un'immagine fluorescente verde da utilizzare come immagine di riferimento per la microscopia a trazione.

7. Analisi dei dati

NOTA: è stato sviluppato un codice personalizzato per l'analisi dei dati utilizzando MATLAB e i dettagli sono stati descritti altrove32 ,33,34,35,36.

  1. Per l'analisi dell'immagine di fase, calcolare gli spostamenti in due immagini di fase consecutive utilizzando la velocità dell'immagine delle particelle36.
  2. Per la microscopia a trazione di trasformazione di Fourier, confrontare ogni immagine fluorescente verde con l'immagine di riferimento e calcolare gli spostamenti in ogni immagine utilizzando la velocitàmetria dell'immagine particella36. Dagli spostamenti, recuperare la trazione fatta dalle cellule su gel PA utilizzando la microscopia a trazione di trasformazione Fourier33,34,37.
  3. Dai dati di trazione, calcolare lo stress all'interno del monostrato dell'isola cellulare utilizzando la microscopia a sollecitazione del monostrato basata su metodi elemento finito32,34,38.

Risultati

Per esplorare la migrazione collettiva in un gradiente chimico, un sistema microfluidico è stato integrato con la microscopia a trazione (Figura 1). Per costruire il sistema integrato, il gel di poliacrilammide (PA) è stato gettato su vetro tagliato su misura, e le cellule MDCK sono state semiate all'interno di isole micromodellate fatte da uno stencil PDMS. Per questo esperimento, sono state create dodici isole di celle MDCK (quattro righe per tre colonne, diametro di 700 m). Dopo aver at...

Discussione

La migrazione collettiva delle cellule costitutive è un processo importante durante lo sviluppo e la rigenerazione, e la direzione di migrazione è spesso guidata dal gradiente chimico dei fattori di crescita4,23. Durante la migrazione collettiva, le cellule continuano a interagire con le cellule vicine e i substrati sottostanti. Tali interazioni meccaniche danno origine a fenomeni emergenti come durotaxis42, plithotaxis...

Divulgazioni

Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti.

Riconoscimenti

Questo lavoro è stato sostenuto dalla sovvenzione della National Research Foundation of Korea (NRF) finanziata dal governo coreano (MSIP) (N.. NRF-2017R1E1A1A01075103), Korea University Grant e il programma BK 21 Plus. È stato supportato anche dai National Institutes of Health (U01CA202123, PO1HL120839, T32HL007118, R01EY0196).

Materiali

NameCompanyCatalog NumberComments
0.25% trypsin-EDTA (1X)Gibco25200-056
1 M HEPES buffer solutionGibco15630-056
1 mm Biopsy punchIntegra Miltex33-31AA-P/25
100 mm petri dishesSPL10100100 mm diameter, 15 mm height
14 mm hollow punchILJIN124-0571
18 mm Ø CoverslipMarienfeld-Superior111580Circular 18 mm, thickness No. 1 (0.13 to 0.16 mm)
2% bis-acrylamide solutionBio-Rad1610142Wear protective gloves, clothing, and eye protection.
3-(Trimethoxysilyl)propyl methacrylate (TMSPMA)Sigma-Aldrich440159-500ML
3-way stopcockHyupsungHS-T-61NCAUTION: do not use if previously opened. do not resterlize or resuse
30 cm minimum volume line (for pediatric)HyupsungHS-MV-30CAUTION: do not use if previously opened. do not resterlize or resuse
35 mm cell culture dishCorning430165
40% Acrylamide SolutionBio-Rad1610140Wear protective gloves, clothing, and eye protection.
75 cm minimum volume line (for pediatric)HyupsungHS-MV-75CAUTION: do not use if previously opened. do not resterlize or resuse
acetic acidJ.T. BakerJT9508-03
Ammonium persulfate (APS)Bio-Rad1610700
Antibiotic-AntimycoticGibco15240-062
Bottom glass chipMicroFIT24 x 24 x 1 mm, custom-made, rectangular groove (6 x 12 mm, depth : 100 μm)
Collagen typeI, Rat tailCorning354236
Custom glass holderHan-Gug Mechatronicscustom-made
Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM)WelgeneLM 001-11
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (PBS)BiowestL0615-500w/o Magnesium, Calcium
Fetal bovine serum (FBS)Gibco26140-179
FluoSpheres amine-modified microspheresInvitrogenF87640.2 µm, yellow-green fluorescent(505/515)
Hepatocyte Growth Factor (HGF)Sigma-AldrichH1404-5UGrecombinant, human
JuLI stage live cell imaging systemNanoEnTek InAutomated X-Y-Z stage and fluorsent imaging Incubator-compatible (37 °C and 5% CO2)
Madin-Darby Canine Kidney (MDCK) celltype II
Oxygen plasma systemFemto ScienceCUTE-MPR
Pluronic F-127Sigma-AldrichP2443-250G
Rhodamine B isothiocyanate–dextranSigma-AldrichR9379-100MG70 kDa, used to estimate spatiotemporal distribution of HGF in the microfluidic channel
Steril hypodermic needle 18 GKOVAXTrim the tip of the needle and bend it 90 degrees for connecting in/out ports with volume line
Sticky tape3M/Scotch810D33 m x 19 mm
SU-8 master moldsMicroFIT4” diameter, custom-made
sulfosuccinimidyl 6-(4’-azido-2’-nitrophenylamino)hexanoate (Sulfo-SANPAH)Thermo Scientific22589Store at -20°C. Store protected from moisture and light.
Sylgard 184 Elastomer KitDow CorningPDMS
Syringe pumpChemyx Inc.model fusion 720withdraw fluid
SyringesKOVAX1, 3, 5, 10, or 50 cc for using inlet reservoir or outlet syringe pump
tetramethylethylenediamine (TEMED)Bio-Rad1610800Wear protective gloves, clothing, and eye protection.
Ultraviolet (UV) lampUVP LLC95-0248-02365 nm wavelength

Riferimenti

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