JoVE Logo
Autoren
Kontakt

Anmelden

Zum Anzeigen dieser Inhalte ist ein JoVE-Abonnement erforderlich. Melden Sie sich an oder starten Sie Ihre kostenlose Testversion.

In diesem Artikel

  • Zusammenfassung
  • Zusammenfassung
  • Einleitung
  • Protokoll
  • Ergebnisse
  • Diskussion
  • Offenlegungen
  • Danksagungen
  • Materialien
  • Referenzen
  • Nachdrucke und Genehmigungen

Zusammenfassung

Kollektive Zellmigration in Entwicklung, Wundheilung und Krebsmetastasierung wird oft von den Gradienten von Wachstumsfaktoren oder Signalmolekülen geleitet. Hier wird ein experimentelles System beschrieben, das Traktionsmikroskopie mit einem mikrofluidischen System kombiniert und demonstriert, wie die Mechanik der kollektiven Migration unter biochemischen Gradienten quantifiziert werden kann.

Zusammenfassung

Zellen verändern Migrationsmuster als Reaktion auf chemische Reize, einschließlich der Gradienten der Reize. Die zelluläre Migration in Richtung eines chemischen Gradienten, bekannt als Chemotaxis, spielt eine wichtige Rolle bei der Entwicklung, der Immunantwort, der Wundheilung und der Krebsmetastasierung. Während Chemotaxis die Migration einzelner Zellen sowie der Sammlungen von Zellen in vivo modulieren, konzentriert sich die In-vitro-Forschung auf einzellige Chemotaxis, teilweise aufgrund des Fehlens der richtigen experimentellen Werkzeuge. Um diese Lücke zu schließen, wird hier ein einzigartiges experimentelles System beschrieben, das Mikrofluidik und Mikromuster kombiniert, um die Auswirkungen chemischer Gradienten auf die kollektive Zellmigration zu demonstrieren. Darüber hinaus werden Traktionsmikroskopie und Monolayer-Stressmikroskopie in das System integriert, um Veränderungen der Zellkraft auf dem Substrat sowie zwischen benachbarten Zellen zu charakterisieren. Als Proof-of-Concept wird die Migration von mikrogemusterten kreisförmigen Inseln von Madin-Darby-Canine-Kidney-Zellen (MDCK) unter einem Gradienten des Hepatozytenwachstumsfaktors (HGF), einem bekannten Streufaktor, getestet. Es wird festgestellt, dass Zellen, die sich in der Nähe der höheren Konzentration von HGF befinden, schneller migrieren als zellennahe Zellen auf der gegenüberliegenden Seite innerhalb einer Zellinsel. Innerhalb der gleichen Insel ist die zelluläre Traktion auf beiden Seiten ähnlich, aber die interzelluläre Belastung ist auf der Seite einer höheren HGF-Konzentration viel geringer. Dieses neuartige experimentelle System kann neue Möglichkeiten bieten, die Mechanik der chemotaktischen Migration durch zelluläre Kollektive zu untersuchen.

Einleitung

Die zelluläre Migration in biologischen Systemen ist ein grundlegendes Phänomen, das an der Gewebebildung, der Immunantwort und der Wundheilung beteiligt ist1,2,3. Zelluläre Migration ist auch ein wichtiger Prozess bei einigen Krankheiten wie Krebs4. Zellen werden oft als Gruppe und nicht als Einzeln migriert, was als kollektive Zellmigration4,5bezeichnet wird. Damit sich Zellen kollektiv bewegen können, ist die Erfassung der Mikroumgebung unerlässlich6. Zum Beispiel nehmen Zellen physikalisch-chemische Reize wahr und reagieren durch Veränderung der Beweglichkeit, Zell-Substrat-Wechselwirkungen und Zell-Zell-Wechselwirkungen, was zu einer Richtungsmigration entlang eines chemischen Gradienten7,8, 9,10. Basierend auf dieser Verbindung wurden schnelle Fortschritte in Lab-on-a-Chip-Technologien gemacht, die gut kontrollierte chemische Mikroumgebungen wie den Gradienten eines Chemoattractanten11,12,13 erzeugen können. . Während diese Lab-on-a-Chip-basierte Mikrofluidik bisher verwendet wurden, um Chemotaxis des Zellensembles oder zelluläre Sphäroide14,15,16,17zu studieren, wurden hauptsächlich im Zusammenhang mit der Einzelzellmigration18,19,20,21verwendet. Mechanismen, die einer zellulären kollektiven Reaktion auf einen chemischen Gradienten zugrunde liegen, sind immer noch nicht gut verstanden14,22,23,24,25,26 . So wird die Entwicklung einer Plattform, die die raumzeitliche Kontrolle von löslichen Faktoren sowie die in-situ-Beobachtung der biophysikalischen Zellen ermöglicht, dazu beitragen, die Mechanismen hinter der kollektiven Zellmigration zu entwirren.

Entwickelt und beschrieben ist hier ein mehrkanaliges mikrofluidisches System, das die Erzeugung eines Konzentrationsgradienten von löslichen Faktoren ermöglicht, der die Migration von gemusterten Zellclustern moduliert. In dieser Studie, Hepatozyten-Wachstumsfaktor (HGF) wird gewählt, um das Migrationsverhalten von Madin-Darby Canine Nieren (MDCK) Zellen zu regulieren. HGF ist dafür bekannt, die Zell-Zell-Integrität zu dämpfen und die Beweglichkeit der Zellen27,28zu verbessern. Im mikrofluidischen System sind fourier transform traktionsmikroskopie und Monolayer-Stressmikroskopie integriert, die eine Analyse der Beweglichkeit, Kontraktilenkraft und interzellulären Spannung ermöglicht, die von konstituierenden Zellen als Reaktion auf ein HGF induziert werden. gefälle. Innerhalb derselben Insel wandern Zellen, die sich in der Nähe der höheren Konzentration von HGF befinden, schneller und weisen niedrigere interzelluläre Belastungen auf als zellenübergreifende Belastungen als zellennahe Mit geringerer HGF-Konzentration. Die Ergebnisse deuten darauf hin, dass dieses neue experimentelle System geeignet ist, andere Fragen in Bereichen zu untersuchen, die eine kollektive zelluläre Migration unter chemischen Gradienten verschiedener löslicher Faktoren beinhalten.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protokoll

ANMERKUNG: Die Lithographie von SU-8-Formen für Schablonen (Dicke = 250 m) und Mikrokanalteile (Dicke = 150 m), Glasätzung (Tiefe = 100 m) und Gussfertigung wurden durch den Versand von Konstruktionen mit computergestützter Konstruktionssoftware an Hersteller ausgelagert.

1. Herstellung von Polydimethylsiloxan (PDMS) Schablone und Mikrokanal

  1. Entwerfen Sie das Mikromuster von Schablone und Mikrokanal.
  2. Herstellung oder Auslagerung von SU-8-Formen (Dicke von 250 m für Schablonen und 150 m für Mikrokanäle) auf Siliziumwafern (4" Durchmesser).
  3. Bereiten Sie die PDMS-Mischung vor, indem Sie das Basiselastomer und das Härtungsmittel im Verhältnis 10:1 mischen.
    1. 15 ml des Basiselastomers in ein 50 ml kegelförmiges Rohr geben und 1,5 ml Härtungsmittel hinzufügen. Bereiten Sie zwei davon vor.
    2. Wirbel die PDMS-Mischung für 5 min. Zentrifugieren Sie die PDMS-Mischung bei 196 x g für 1 min, um Blasen zu entfernen.
  4. Um die PDMS-Schablone herzustellen, gießen Sie 1 ml der PDMS-Mischung auf den Wafer, während SU-8-gemusterte Bereiche vermieden werden, so dass das PDMS die Seite der SU-8-Säulen berührt, aber nicht die Oberseite des SU-8-Musters.
    1. Legen Sie den Wafer auf eine flache Oberfläche über 30 min bei Raumtemperatur (RT). Das PDMS im Trockenofen bei 80 °C über 2 h aushärten.
    2. Ziehen Sie das PDMS vorsichtig von der SU-8-Form ab und trimmen Sie die dünne PDMS-Membran mit einem 14 mm Hohlstanz. Entfernen Sie den Staub auf der Oberfläche der PDMS-Stücke mit Klebeband und autoklavieren Sie die PDMS-Schablonen.
  5. Um PDMS-Mikrokanal herzustellen, gießen Sie 30 ml PDMS-Mischung über die SU-8-Form.
    1. 30 min in einer Vakuumkammer abgasen und das PDMS im Trockenofen bei 80 °C über 2 h aushärten.
    2. Ziehen Sie das PDMS vorsichtig von der SU-8-Form ab und schneiden Sie das PDMS auf eine Größe von 24 mm x 24 mm. Erstellen Sie in jedem PDMS-Block einen Auslass und drei Einlässe mit einem 1 mm Biopsie-Punch.

2. Herstellung von Bodenglas mit Polyacrylamid (PA) Gel

  1. Herstellung oder Auslagerung von rechteckigen Gleitgläsern (24 mm x 24 mm x 1 mm) mit rechteckigem Mikrobrunnen (6 mm x 12 mm, 100 m Tiefe29) durch Schneiden und Ätzen von Gläsern.
  2. Silanize die Oberfläche eines unterenGlases 30.
    1. Bereiten Sie eine Bindungsilanlösung vor, indem Sie 200 ml deionisiertes Wasser (DIW), 80 l Essigsäure und 50 l 3-(Trimethoxysilyl)-Propylmethacrylat (TMSPMA) für 1 h mischen.
      VORSICHT: TMSPMA ist eine brennbare Flüssigkeit. Befolgen Sie die Empfehlungen in den Sicherheitsdatenblättern. Nur in einer chemischen Dunstabzugshaube verwenden.
    2. Entfernen Sie den Staub von der Oberfläche des Glases durch Klebeband und autoklavieren Sie das Glas.
    3. Bedecken Sie die geätzte Oberfläche des Bodenglases mit 100 l der Bindesilanlösung und lassen Sie das Glas bei RT für 1 h.
    4. Spülen Sie das Glas mit DIW 3x und lassen Sie das Glas bei Umgebungslufttemperatur oder durch Blasen von Luft trocknen.
  3. Bereiten Sie eine Gellösung für das PA-Gel31vor.
    1. Bereiten Sie eine frische Lösung von 0,5 % (w/v) Ammoniumpersulfat (APS) vor, indem Sie 5 mg APS in 1 ml DIW auflösen.
    2. Bereiten Sie die PA-Gellösung vor, die aus einer 138-L-Acrylamidlösung, einer 101-L-Lösung mit 2 % Bis-Acrylamid-Lösung, einer fluoreszierenden Partikellösung (0,2 m) und 655 l DIW besteht.
      VORSICHT: Acrylamid- und Bisacrylamidlösungen sind giftig. Tragen Sie Schutzhandschuhe, Kleidung und Augenschutz. Schützen Sie die PA-Gellösung, die fluoreszierende Partikel enthält, vor Licht.
      HINWEIS: Wirbel die fluoreszierende Perlenlösung vor dem Pipetieren, um eine einheitliche Anzahl von fluoreszierenden Perlen pro Charge zu erhalten.
    3. Nach Zugabe von 100 l der APS-Lösung und 1 l Tetramethylethylendiamin (TEMED) 10 l Mischgellösung auf den rechteckigen Mikrobrunnen übertragen und einen kreisförmigen Abdeckschlupf (18 mm) darüber legen.
      HINWEIS: Um das untere Glas ohne Blasen mit PA-Gel zu füllen, legen Sie eine ausreichende Gellösung auf die Nut des Unteren Glases, schieben Sie den Deckelrutsch vorsichtig über die Gellösung und entfernen Sie überschüssige Gellösung.
      VORSICHT: Das Gel wird langsam für ca. 40 min ausgehärtet. Das folgende Verfahren für Zentrifugierende Gele sollte so schnell wie möglich durchgeführt werden.
    4. Drehen Sie die Montage von kundenspezifischem Glas, Gel-Lösung und Deckelschlappe, dann Zentrifuge für 10 min bei 96 x g, um fluoreszierende Partikel auf die oberste Schicht von PA-Gel zu bringen.
    5. Entfernen Sie die Baugruppe aus der Zentrifuge und legen Sie sie auf die flache Oberfläche mit dem Deckelrutsch nach unten.
      HINWEIS: Ab Schritt 2.3.6 werden Proben in einem Biosicherheitsschrank behandelt.
    6. Nach 30 min die Baugruppe umdrehen und in eine 35 mm Petrischale legen, mit 2 ml DIW füllen und (mit Zangen) den Deckelrutsch vorsichtig entfernen, indem man ihn zur Seite schiebt.
      HINWEIS: Gehärtetes PA-Gel kann 1 Monat lang im DIW gelagert werden. Sobald jedoch Kollagen auf dem PA-Gel beschichtet ist, sollte es in einem Experiment innerhalb von 1 Tag verwendet werden.
  4. Mantel Kollagen auf dem PA-Gel.
    1. 1 mg/ml Sulfosuccinimidyl 6-(4'-azido-2'-nitrophenylamino) Hexanoat (Sulfo-SANPAH) in warmen 50 mM HEPES Puffer auflösen. Lassen Sie 200 l der Lösung auf die Geloberfläche fallen und durch UV-Licht (365 nm Wellenlänge) für 10 min aktivieren.
      HINWEIS: Schützen Sie den Sulfo-SANPAH vor Licht.
    2. Spülen Sie das Gel mit 0,1 M [4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazinethanesulfonsäure; HEPES] Puffer 2x und mit PBS 1x.
    3. Beschichten Sie das PA-Gel mit Kollagenlösung (100 g/ml in PBS, Rattenschwanzkollagen Typ I) bei 4 °C über Nacht. Am nächsten Tag mit PBS 3x waschen.

3. Mikromusterung von Zellinseln

  1. Bereiten Sie die F-127 -Tabelle der Materialien) Lösung [2% (w/v) in PBS] vor und tauchen Sie die autoklavierte PDMS-Schablone in die F-127-Lösung ein. Halten Sie es 1 h in einem 37 °C Inkubator auf.
  2. Bereiten Sie Zelllösung (2 x 106 Zelle/ml) in Zellkulturmedien vor, bestehend aus: Dulbeccos modifiziertem Eagle-Medium (DMEM) mit 10% fetalem Rinderserum (FBS) und 1% Antimykotikum (AA).
  3. Waschen Sie die PDMS-Schablone mit PBS 3x und entfernen Sie Flüssigkeit aus der PDMS-Schablone und dem PA-Gel. Legen Sie die PDMS-Schablone auf das PA-Gel und fügen Sie pbS zur Schablone hinzu.
  4. Entfernen Sie Blasen in den Löchern der PDMS-Schablone, indem Sie sanft pipetieren. Entfernen Sie nach dem Entfernen von Blasen PBS von der Oberfläche der PDMS-Schablone.
  5. Nachdem Sie 200 l Zelllösung auf die PDMS-Schablone gelegt haben, bewahren Sie das PA-Gel 1 h lang in einem Inkubator auf, damit sich die Zellen an das PA-Gel anheften.
  6. Waschen Sie die Zelllösung mit Zellkulturmedien vorsichtig ab, entfernen Sie die PDMS-Schablone, und fügen Sie weitere Zellkulturmedien hinzu. Überprüfen Sie die Bildung von Zellinseln unter dem Mikroskop.

4. Montage von PA-Gel mit PDMS-Mikrokanal

  1. Entfernen Sie Staub auf dem PDMS-Mikrokanal mit Klebeband, dann Autoklav.
  2. Behandeln Sie die Oberfläche des PDMS-Mikrokanals mit Sauerstoffplasma (80 W, 50 kHz) für 30 s.
  3. Nach dem Entfernen von Flüssigkeit auf dem PA-Gel-gefüllten Bodenglas, legen Sie den PDMS Mikrokanal auf das Unterglas und legen Sie die Baugruppe auf den benutzerdefinierten Glashalter.
  4. Füllen Sie den Mikrokanal mit zellkulturmedium.
    VORSICHT: Achten Sie darauf, alle Blasen in den Kanälen gefangen zu entfernen, indem Sie sanft warme Medien mit einer Pipette spülen. Achten Sie beim Entfernen von Blasen auch darauf, dass sie keine mikrogemusterten Zellinseln lösen.

5. Integriertes mikrofluidisches System

  1. Schließen Sie die Schläuche an.
    1. Bereiten Sie Die Verbinder vor, indem Sie die Nadelspitze (18 G) beschneiden und um 90° biegen.
    2. Bereiten Sie Schlauchleitungen für drei Einlässe und einen Auslass vor.
      1. Für Einlassschläuche die getrimmte Nadel und eine 30 cm große Mini-Volumenlinie mit einem Drei-Wege-Hahn verbinden. Bereiten Sie drei davon vor.
      2. Für Auslassschläuche die getrimmte Nadel und eine 75 cm große Mini-Volumenlinie mit einem Drei-Wege-Hahn verbinden. Bereiten Sie eine davon vor.
      3. Füllen Sie die Schlauchlinien mit dem Medium, das für 1 h vorgeheizt wurde.
        VORSICHT: Achten Sie darauf, alle Blasen, die in den Schlauchlinien gefangen sind, zu entfernen, indem Sie warme Medien vorsichtig mit einer Spritze spülen.
    3. Bereiten Sie Reservoirs vor, indem Sie Kolben aus Spritzen entfernen und Einlassschläuche anschließen.
    4. Stecken Sie die Nadelanschlüsse jeder Schlauchleitung in die drei Einlässe und einen Auslass des mikrofluidischen Geräts.
  2. Füllen Sie die Reservoirs mit jeweils 3 ml frischem Medium oder konditioniertem Medium.
    1. Füllen Sie für den Gradiententest das linke Einlassreservoir mit 20 ng/mL HGF im Zellkulturmedium.
    2. Zur Visualisierung des Konzentrationsgradienten fügen Sie dem linken Einlassreservoir einen Fluoreszenzfarbstoff (Rhodamine B-Dextran, 70 kDa) hinzu.
    3. Schließen Sie die Auslassschlauchleitung an eine Spritzenpumpe an.
      HINWEIS: Die Betriebsart der Spritzenpumpe ist "Entzug". Die Durchflussmenge wird entsprechend der Kapazität der Spritze und der Betriebsgeschwindigkeit der Spritzenpumpe geändert.
  3. Stellen Sie das integrierte mikrofluidische System auf die Bühne eines herkömmlichen Epifluoreszenzmikroskops.
    VORSICHT: Um einen sanften HGF-Gradienten im mikrofluidischen Kanal zu erzeugen, sollte die Durchflussrate so langsam wie 0,1 l/min sein. Dies ist ausreichend empfindlich, so dass es eine Stabilisierung für 2 h erfordert, und es muss darauf geachtet werden, körperliche Störungen während des Experiments zu vermeiden.

6. Bildaufnahme

  1. Nehmen Sie Bilder alle 10 min für bis zu 24 h mit einem automatisierten Mikroskop in einem Inkubator untergebracht. Nehmen Sie zu jedem Zeitpunkt eine Reihe von Bildern mit einer 4x Objektivlinse in drei verschiedenen Kanälen, einschließlich Phasenbild zur Visualisierung der Zellmigration, grünes Fluoreszenzbild zur Visualisierung von in PA-Gel eingebetteten Fluoreszenzperlen und rotem Fluoreszenzbild, um das Konzentrationsgradienten einer Chemikalie.
  2. Nach der Aufnahme von Zeitrafferbildern, infundieren Sie 0,25% Trypsin-EDTA-Lösung in Mikrokanäle, um Zellen vom PA-Gel zu lösen. Nachdem Sie Zellen vollständig aus dem Gel entfernt haben, nehmen Sie ein grünes fluoreszierendes Bild, das als Referenzbild für die Traktionsmikroskopie verwendet werden soll.

7. Datenanalyse

HINWEIS: Ein benutzerdefinierter Code für die Datenanalyse wurde mit MATLAB entwickelt, und Details wurden an anderer Stelle beschrieben32,33,34,35,36.

  1. Für die Phasenbildanalyse berechnen Sie Verschiebungen in zwei aufeinander folgenden Phasenbildern mit Derpartikelbild-Velocimetrie36.
  2. Vergleichen Sie für Fourier die Traktionsmikroskopie mit dem Referenzbild und berechnen Sie die Verschiebungen in jedem Bild mithilfe der Partikelbild-Velocimetrie36. Von den Verschiebungen, erholen Traktion von Zellen auf PA-Gel mit Fourier transform Traktion skopie33,34,37.
  3. Aus den Traktionsdaten berechnen Sie die Spannung innerhalb der Monoschicht der Zellinsel mittels monoschichter Spannungsmikroskopie auf Basis der Finite-Elemente-Methoden32,34,38.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Ergebnisse

Um die kollektive Migration unter einem chemischen Gradienten zu erforschen, wurde ein mikrofluidisches System mit Traktionsmikroskopie integriert (Abbildung 1). Um das integrierte System zu bauen, wurde Polyacrylamid (PA) Gel auf maßgefertigtes Glas gegossen, und MDCK-Zellen wurden innerhalb von mikrogemusterten Inseln aus einer PDMS-Schablone gesät. Für dieses Experiment wurden zwölf Inseln von MDCK-Zellen (vier Reihen durch drei Spalten, Durchmesser von 700 m) geschaffen. Nach Zellen,...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Diskussion

Die kollektive Migration von Zellbestandteilen ist ein wichtiger Prozess während der Entwicklung und Regeneration, und die Migrationsrichtung wird oft durch den chemischen Gradienten der Wachstumsfaktoren4,23geleitet. Während der kollektiven Migration interagieren Zellen weiterhin mit benachbarten Zellen und zugrunde liegenden Substraten. Solche mechanischen Wechselwirkungen führen zu auftauchenden Phänomenen wie Durotaxis42, plithotax...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Offenlegungen

Die Autoren erklären, dass sie keine konkurrierenden finanziellen Interessen haben.

Danksagungen

Diese Arbeit wurde durch das Stipendium der National Research Foundation of Korea (NRF) unterstützt, das von der koreanischen Regierung (MSIP) (Nr. NRF-2017R1E1A1A01075103), Korea University Grant und das BK 21 Plus Programm. Es wurde auch von den National Institutes of Health (U01CA202123, PO1HL120839, T32HL007118, R01EY019696) unterstützt.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materialien

NameCompanyCatalog NumberComments
0.25% trypsin-EDTA (1X)Gibco25200-056
1 M HEPES buffer solutionGibco15630-056
1 mm Biopsy punchIntegra Miltex33-31AA-P/25
100 mm petri dishesSPL10100100 mm diameter, 15 mm height
14 mm hollow punchILJIN124-0571
18 mm Ø CoverslipMarienfeld-Superior111580Circular 18 mm, thickness No. 1 (0.13 to 0.16 mm)
2% bis-acrylamide solutionBio-Rad1610142Wear protective gloves, clothing, and eye protection.
3-(Trimethoxysilyl)propyl methacrylate (TMSPMA)Sigma-Aldrich440159-500ML
3-way stopcockHyupsungHS-T-61NCAUTION: do not use if previously opened. do not resterlize or resuse
30 cm minimum volume line (for pediatric)HyupsungHS-MV-30CAUTION: do not use if previously opened. do not resterlize or resuse
35 mm cell culture dishCorning430165
40% Acrylamide SolutionBio-Rad1610140Wear protective gloves, clothing, and eye protection.
75 cm minimum volume line (for pediatric)HyupsungHS-MV-75CAUTION: do not use if previously opened. do not resterlize or resuse
acetic acidJ.T. BakerJT9508-03
Ammonium persulfate (APS)Bio-Rad1610700
Antibiotic-AntimycoticGibco15240-062
Bottom glass chipMicroFIT24 x 24 x 1 mm, custom-made, rectangular groove (6 x 12 mm, depth : 100 μm)
Collagen typeI, Rat tailCorning354236
Custom glass holderHan-Gug Mechatronicscustom-made
Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM)WelgeneLM 001-11
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (PBS)BiowestL0615-500w/o Magnesium, Calcium
Fetal bovine serum (FBS)Gibco26140-179
FluoSpheres amine-modified microspheresInvitrogenF87640.2 µm, yellow-green fluorescent(505/515)
Hepatocyte Growth Factor (HGF)Sigma-AldrichH1404-5UGrecombinant, human
JuLI stage live cell imaging systemNanoEnTek InAutomated X-Y-Z stage and fluorsent imaging Incubator-compatible (37 °C and 5% CO2)
Madin-Darby Canine Kidney (MDCK) celltype II
Oxygen plasma systemFemto ScienceCUTE-MPR
Pluronic F-127Sigma-AldrichP2443-250G
Rhodamine B isothiocyanate–dextranSigma-AldrichR9379-100MG70 kDa, used to estimate spatiotemporal distribution of HGF in the microfluidic channel
Steril hypodermic needle 18 GKOVAXTrim the tip of the needle and bend it 90 degrees for connecting in/out ports with volume line
Sticky tape3M/Scotch810D33 m x 19 mm
SU-8 master moldsMicroFIT4” diameter, custom-made
sulfosuccinimidyl 6-(4’-azido-2’-nitrophenylamino)hexanoate (Sulfo-SANPAH)Thermo Scientific22589Store at -20°C. Store protected from moisture and light.
Sylgard 184 Elastomer KitDow CorningPDMS
Syringe pumpChemyx Inc.model fusion 720withdraw fluid
SyringesKOVAX1, 3, 5, 10, or 50 cc for using inlet reservoir or outlet syringe pump
tetramethylethylenediamine (TEMED)Bio-Rad1610800Wear protective gloves, clothing, and eye protection.
Ultraviolet (UV) lampUVP LLC95-0248-02365 nm wavelength

Referenzen

  1. Reig, G., Pulgar, E., Concha, M. L. Cell migration: from tissue culture to embryos. Development. 141 (10), 1999-2013 (2014).
  2. Luster, A. D., Alon, R., von Andrian, U. H. Immune cell migration in inflammation: present and future therapeutic targets. Nature Immunology. 6 (12), 1182-1190 (2005).
  3. Liang, C. C., Park, A. Y., Guan, J. L. In vitro scratch assay: a convenient and inexpensive method for analysis of cell migration in vitro. Nature Protocols. 2 (2), 329-333 (2007).
  4. Friedl, P., Gilmour, D. Collective cell migration in morphogenesis, regeneration and cancer. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 10 (7), 445-457 (2009).
  5. Mayor, R., Etienne-Manneville, S. The front and rear of collective cell migration. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 17 (2), 97-109 (2016).
  6. DuFort, C. C., Paszek, M. J., Weaver, V. M. Balancing forces: architectural control of mechanotransduction. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 12 (5), 308-319 (2011).
  7. Vogel, V. Mechanotransduction involving multimodular proteins: converting force into biochemical signals. Annual Review of Biophysics and Biomolecular Structure. 35, 459-488 (2006).
  8. Roca-Cusachs, P., Sunyer, R., Trepat, X. Mechanical guidance of cell migration: lessons from chemotaxis. Current Opinion in Cell Biology. 25 (5), 543-549 (2013).
  9. Weber, G. F., Bjerke, M. A., DeSimone, D. W. A mechanoresponsive cadherin-keratin complex directs polarized protrusive behavior and collective cell migration. Developmental Cell. 22 (1), 104-115 (2012).
  10. Ingber, D. E. Cellular mechanotransduction: putting all the pieces together again. FASEB Journal. 20 (7), 811-827 (2006).
  11. Ricart, B. G., Yang, M. T., Hunter, C. A., Chen, C. S., Hammer, D. A. Measuring traction forces of motile dendritic cells on micropost arrays. Biophysical Journal. 101 (11), 2620-2628 (2011).
  12. Garcia, S., et al. Generation of stable orthogonal gradients of chemical concentration and substrate stiffness in a microfluidic device. Lab on a Chip. 15 (12), 2606-2614 (2015).
  13. Zhang, Z., et al. Scalable Multiplexed Drug-Combination Screening Platforms Using 3D Microtumor Model for Precision Medicine. Small. 14 (42), 1703617(2018).
  14. Ayuso, J. M., et al. Study of the Chemotactic Response of Multicellular Spheroids in a Microfluidic Device. PLoS ONE. 10 (10), 0139515(2015).
  15. McCutcheon, S., et al. In vitro formation of neuroclusters in microfluidic devices and cell migration as a function of stromal-derived growth factor 1 gradients. Cell Adhesion & Migration. 11 (1), 1-12 (2017).
  16. Ellison, D., et al. Cell-cell communication enhances the capacity of cell ensembles to sense shallow gradients during morphogenesis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (6), 679-688 (2016).
  17. Fujimori, T., Nakajima, A., Shimada, N., Sawai, S. Tissue self-organization based on collective cell migration by contact activation of locomotion and chemotaxis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. , (2019).
  18. Li Jeon, N., et al. Neutrophil chemotaxis in linear and complex gradients of interleukin-8 formed in a microfabricated device. Nature Biotechnology. 20 (8), 826-830 (2002).
  19. Saadi, W., Wang, S. J., Lin, F., Jeon, N. L. A parallel-gradient microfluidic chamber for quantitative analysis of breast cancer cell chemotaxis. Biomedical Microdevices. 8 (2), 109-118 (2006).
  20. Abhyankar, V. V., Lokuta, M. A., Huttenlocher, A., Beebe, D. J. Characterization of a membrane-based gradient generator for use in cell-signaling studies. Lab on a Chip. 6 (3), 389-393 (2006).
  21. Bersini, S., et al. A microfluidic 3D in vitro model for specificity of breast cancer metastasis to bone. Biomaterials. 35 (8), 2454-2461 (2014).
  22. Rorth, P. Whence directionality: guidance mechanisms in solitary and collective cell migration. Developmental Cell. 20 (1), 9-18 (2011).
  23. Rorth, P. Collective guidance of collective cell migration. Trends in Cell Biology. 17 (12), 575-579 (2007).
  24. McCutcheon, S., et al. In vitro formation of neuroclusters in microfluidic devices and cell migration as a function of stromal-derived growth factor 1 gradients. Cell Adhesion & Migration. 11 (1), 1-12 (2017).
  25. Rorth, P. Whence directionality: guidance mechanisms in solitary and collective cell migration. Developmental Cell. 20 (1), 9-18 (2011).
  26. Rorth, P. Collective guidance of collective cell migration. Trends in Cell Biology. 17 (12), 575-579 (2007).
  27. Farrell, J., et al. HGF induces epithelial-to-mesenchymal transition by modulating the mammalian hippo/MST2 and ISG15 pathways. Journal of Proteome Research. 13 (6), 2874-2886 (2014).
  28. Wang, T. W., Zhang, H., Gyetko, M. R., Parent, J. M. Hepatocyte growth factor acts as a mitogen and chemoattractant for postnatal subventricular zone-olfactory bulb neurogenesis. Molecular and Cellular Neuroscience. 48 (1), 38-50 (2011).
  29. Lin, Y. C., et al. Mechanosensing of substrate thickness. Physical Review. E, Statistical, Nonlinear and Soft matter Physics. 82, 4 Pt 1 041918(2010).
  30. Serra-Picamal, X., Conte, V., Sunyer, R., Munoz, J. J., Trepat, X. Mapping forces and kinematics during collective cell migration. Methods in Cell Biology. 125, 309-330 (2015).
  31. Denisin, A. K., Pruitt, B. L. Tuning the Range of Polyacrylamide Gel Stiffness for Mechanobiology Applications. ACS Applied Materials & Interfaces. 8 (34), 21893-21902 (2016).
  32. Jang, H., et al. Traction microscopy with integrated microfluidics: responses of the multi-cellular island to gradients of HGF. Lab on a Chip. 19 (9), 1579-1588 (2019).
  33. Tambe, D. T., et al. Collective cell guidance by cooperative intercellular forces. Nature Materials. 10 (6), 469-475 (2011).
  34. Jang, H., et al. Homogenizing cellular tension by hepatocyte growth factor in expanding epithelial monolayer. Scientific Reports. 8, 45844(2017).
  35. Trepat, X., et al. Physical forces during collective cell migration. Nature Physics. 5 (6), 426(2009).
  36. Tolic-Norrelykke, I. M., Butler, J. P., Chen, J., Wang, N. Spatial and temporal traction response in human airway smooth muscle cells. American Journal of Physiology - Cell Physiology. 283 (4), 1254-1266 (2002).
  37. Butler, J. P., Tolic-Norrelykke, I. M., Fabry, B., Fredberg, J. J. Traction fields, moments, and strain energy that cells exert on their surroundings. American Journal of Physiology - Cell Physiology. 282 (3), 595-605 (2002).
  38. Tambe, D. T., et al. Monolayer stress microscopy: limitations, artifacts, and accuracy of recovered intercellular stresses. PLoS ONE. 8 (2), 55172(2013).
  39. Dembo, M., Wang, Y. L. Stresses at the cell-to-substrate interface during locomotion of fibroblasts. Biophysical Journal. 76 (4), 2307-2316 (1999).
  40. Wang, N., et al. Cell prestress. I. Stiffness and prestress are closely associated in adherent contractile cells. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 282 (3), 606-616 (2002).
  41. Notbohm, J., et al. Cellular Contraction and Polarization Drive Collective Cellular Motion. Biophysical Journal. 110 (12), 2729-2738 (2016).
  42. Sunyer, R., et al. Collective cell durotaxis emerges from long-range intercellular force transmission. Science. 353 (6304), 1157-1161 (2016).
  43. Kim, J. H., et al. Propulsion and navigation within the advancing monolayer sheet. Nature Materials. 12 (9), 856-863 (2013).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Nachdrucke und Genehmigungen

Genehmigung beantragen, um den Text oder die Abbildungen dieses JoVE-Artikels zu verwenden

Genehmigung beantragen

Weitere Artikel entdecken

BioengineeringAusgabe 152MikrofluidikTraktionsmikroskopiekollektive ZellmigrationChemotaxischemischer GradientMikromusterung

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Datenschutz

Nutzungsbedingungen

Richtlinien

Kontakt

BIBLIOTHEKS-EMPFEHLUNG

JoVE-Newsletter

Forschung

Lehre

Autoren

Bibliothekare

ÜBER JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. Alle Rechte vorbehalten