Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

هنا ، نقدم بروتوكولا يصف كيفيه القيام بتجميع ناقل النسخ المتماثل ذاتيا باستخدام مجموعه أدوات الاستنساخ النموذجية سيانوكوبالامين ، ii) إدخال المتجه إلى مضيف ترتبط عن طريق الاقتران ، و iii) توصيف سلالات البكتيريا الوراثية المحورة جينيا باستخدام قارئ لوحه أو تدفق الخلوية.

Abstract

البكتيريا الزرقاء هي مجموعه متنوعة من الكائنات الضوئية الاصطناعية النواة التي يمكن تعديلها وراثيا للإنتاج المتجدد للسلع الصناعية المفيدة. وقد أدت التطورات الاخيره في البيولوجيا التركيبية إلى تطوير عده مجموعات من أدوات الاستنساخ مثل السيسونات ، وهو نظام معياري للاستنساخ النمطي لبناء ناقلات البلازميد للتحول اللاحق أو الانتقال الزوجي إلى البكتيريا الزرقاء. هنا نحن الخطوط العريضة طريقه مفصله لتجميع ناقلات ذاتية التكرار (علي سبيل المثال ، تحمل كاسيت التعبير علامة الفلورسنت) ونقل الزوجية من المتجه إلى سلالات ترتبط Synechocystis sp. 6803 أو Synechكوكوس الونجاتوس utex 2973. الاضافه إلى ذلك ، فاننا نقدم وصفا لكيفيه توصيف أداء الجزء الوراثي (علي سبيل المثال ، المروج) باستخدام قارئ اللوحة أو قياس التدفق الخلوي.

Introduction

البكتيريا الزرقاء التغذية هي بكتريا يمكن استخدامها في التخليق الحيوي لمجموعه واسعه من المنتجات الايضيه ذات القيمة العالية الطبيعية وغير المتجانسة1،2،3،4،5، 6- ولا تزال هناك عده عقبات تحتاج إلى التغلب عليها لتوسيع صلاحيتها التجارية ، ولا سيما الغلات الضعيفة نسبيا مقارنه بالمنصات الحيوية غير المتجانسة (مثل القولونية والخميرة)7. ويساعد التوسع الأخير في الاداات الهندسية الوراثية المتاحة واستيعاب نموذج البيولوجيا التركيبية في البحوث الترتبطه علي التغلب علي هذه التحديات وزيادة تطوير البكتيريا الزرقاء كمصانعحيوية فعاله 8، 9و10.

النهج الرئيسية لإدخال الحمض النووي في البكتيريا الزرقاء هي التحول والاقتران والكهربية. والمتجات المنقولة إلى البكتيريا الزرقاء بالتحويل أو بالكهرباء هي ناقلات "انتحاريه" (اي المتجات التكاملية التي تسهل أعاده الدمج الذاتي) ، في حين يمكن نقل ناقلات النسخ المتماثل بنفسها إلى البكتيريا الزرقاء التحويل ، الاقتران أو الكهربية. النسبة للنوع الأول ، هناك بروتوكول متاح للأنواع النموذجية الهندسية القابلة للتحول الطبيعي11. في الاونه الاخيره ، تم تطوير مجموعه أدوات الاستنساخ (MoClo) وحدات لبكتيريا السيانيد يسمي سيانوكوبالامين التي توظف طريقه موحده لتجميع ناقلات البوابة الذهبية للهندسة باستخدام التحويل الطبيعي ، الكهربي أو الاقتران12.

وقد أصبحت تقنيات الجمعية الذهبية من نوع شعبيه متزايدة في السنوات الاخيره ، ومعايير الجمعية والمكتبات جزء متاحه الآن لمجموعه متنوعة من الكائنات الحية13،14،15،16 ،17. البوابة الذهبية يستخدم نوع الانزيمات تقييد IIS (علي سبيل المثال ، BsaI ، BpiI ، BsmBI ، BtgZI و AarI) وبدله من متقبلين وتعليق فريد لتسهيل التجمع الهرمي الاتجاهي لمتواليات متعددة في "وعاء واحد" رد فعل الجمعية. تعرف الانزيمات المقيدة لنوع IIS علي تسلسل غير متماثل فريد وتقطع مسافة محدده من مواقع التعرف عليها لإنشاء قطع متداخلة ، "نهاية لزجه" (عاده ما تكون 4 نوكليوتيد [NT] المتراكمة) ، والتي يمكن استغلالها لاحقا لدفع الحمض النووي المطلوب ردود فعلالجمعية 15,18. وقد سهل هذا تطوير المكتبات الكبيرة من أجزاء المستوي 0 وحدات (علي سبيل المثال ، والمروجين ، وإطارات القراءة المفتوحة والمنهيون) المعرفة من قبل بناء جمله مشتركه ، مثل معيار PhytoBricks19. ويمكن بعد ذلك تجميع أجزاء المستوي 0 بسهوله في أشرطه التعبير المستوي 1 ، وبعد ذلك أكثر تعقيدا التجميعات ترتيب اعلي (علي سبيل المثال ، التعبير المتعدد الجينات يبني) يمكن ان يبني في ناقلات متقبل من الاختيار12،15. ومن المزايا الرئيسية لتقنيات الجمعية الذهبية من نوع البوابة هي قدرتها علي الاتمته في مرافق عاليه الانتاجيه ، مثل الحمض النووي المصهر20،21، والتي يمكن ان تسمح للاختبار التصاميم التجريبية المعقدة التي لا يمكن تحقيقه بسهوله عن طريق العمل اليدوي.

سيانوكوبالامين يبني علي نظام المصنع الثابتة moclo12،15. ولادراج جزء جديد في السيسونات ، يجب أولا ان تكون التسلسلات الجزئية مستانسه ، اي انه يجب أزاله مواقع الاعتراف "غير القانوني" لشركتي BsaI و BpiI. في حاله الترميز جزء لاطار القراءة المفتوحة (اي تسلسل الترميز ، الاقراص المدمجة) ، يمكن ان تتعطل مواقع التعرف عن طريق توليد طفرات مرادفه في التسلسل (اي تغيير كودون إلى بديل ان الرموز لنفس بقايا الأحماض الامينيه). ويمكن تحقيق ذلك من خلال مجموعه متنوعة من النهج ، بدءا من توليف الحمض النووي إلى الاستراتيجيات القائمة علي تضخيم تفاعل البلمره المتسلسل (PCR) مثل جمعيه جيبسون22. اعتمادا علي المضيف التعبير المستخدمة ، ينبغي توخي الحذر لتجنب إدخال المخطوطات النادرة التي يمكن ان تمنع كفاءه الترجمة23. أزاله مواقع التعرف في تسلسل المروج والمنهي عاده مسعى أكثر خطورة ، كما قد تؤثر التعديلات علي الدالة وقد لا يؤدي الجزء كما هو متوقع. علي سبيل المثال ، يمكن ان تغير التغييرات في مواقع ربط عامل النسخ المفترض أو موقع ربط الريبوسوم داخل المروج القوه والاستجابة للتوجيه/القمع. المثل ، فان التعديلات علي الملامح الهيكلية الرئيسية المنهي (علي سبيل المثال ، الجذعية الغنية GC ، حلقه وبولي U الذيل) قد تغير كفاءه إنهاء وتاثير التعبيرالجيني 24 ،25. علي الرغم من ان العديد من الموارد علي الإنترنت متاحه للتنبؤ بنشاط متواليات المروج والمنهي ، وإبلاغ ما إذا كانت الطفرة المقترحة ستؤثر علي الأداء26،27، وهذه الاداات غالبا ما تكون ضعيفه من التنبؤات الأداء في البكتيريا الزرقاء28،29،30.. علي هذا النحو ، في توصيف الجسم المجري للأجزاء المعدلة لا يزال يوصي بتاكيد النشاط. وللمساعدة في استنساخ المتواليات المتمردة ، يتضمن السيسونات نسخه منخفضه من النسخ التي يقبلها الاستنساخ علي أساس ناقل بيوريك pSB4K512،16،31. وعلاوة علي ذلك ، فان بوابه "التصميم والبناء" متاحه من خلال مسبك الجينوم في ادنبره للمساعدة في تصميم ناقلات الامراض (dab.genomefoundry.org). وأخيرا ، والاهم من ذلك ، وتشمل سيانوكوبالامين اثنين من التصميمات ناقلات المستوي T متقبل (ما يعادل المستوي 2 المتجات متقبل)15 لإدخال الحمض النووي في البكتيريا الزرقاء باستخدام ناقلات الانتحار ، أو ناقلات واسعه النطاق المضيف قادره علي النسخ المتماثل الذاتي في عده ترتبط الأنواع32،33،34.

هنا سوف نركز علي وصف بروتوكول لتوليد مستوي T ناقلات النسخ المتماثل الذاتي والتعديل الجيني لل synechالونجاتوس sti الشركة ال6803ه للامراض و Synechكوكوس الونجاتوس Utex 2973 (Synechёts الشركة الخاصة 6803 و s. Utex 2973 الاخره) عن طريق الاقتران (المعروف أيضا باسم التزاوج ثلاثي الوالدين). النقل الزوجي للحمض النووي بين الخلايا البكتيرية هو عمليه موصوفه جيدا وقد استخدمت سابقا للهندسة ترتبط الأنواع ، وخاصه تلك التي ليست مختصة بشكل طبيعي ، مثل s. الونجاتوس utex 297335، 36،37،38،39،40،41. وباختصار ، يتم احتضان الثقافات الترتبطه بسلاله كولاي التي تحمل المتجه الذي سيتم نقله (ناقل "الحمولة") والمتجات (اما في نفس سلاله e. كولاي أو في سلالات اضافيه) لتمكين الاقتران ("المعبئ" ومتجات "المساعد"). مطلوب أربعه شروط رئيسيه لنقل الزوجية ان يحدث: 1) الاتصال المباشر بين الخلايا المتورطة في نقل الحمض النووي ، 2) يجب ان يكون ناقل البضائع متوافقا مع نظام التصريف (اي انه يجب ان يحتوي علي مصدر مناسب للتحويل (Orit) ، المعروف أيضا باسم شجره المواد (أساس التنقل) الموقع) ، 3) الحمض النووي الذي يخدع البروتين (علي سبيل المثال ، المشفرة من قبل الجينات الغوغاء ) التي نيكس الحمض النووي في orit لبدء نقل واحد تقطعت بهم السبل للحمض النووي في السيانيد يجب ان تكون موجودة وأعرب اما من ناقلات البضائع أو المساعدين ، و 4) يجب الا يدمر الحمض النووي المنقول في السيانيد المستلم (اي ، يجب ان يكون مقاوما للتدهور بواسطة ، علي سبيل المثال ، تقييد النشاط الأحادي النواة)35،42. ولكي يستمر ناقل البضائع ، يجب ان يكون منشا النسخ المتماثل متوافقا مع زرقه المتلقي للسماح بالنسخ المتماثل الذاتي والانتشار في القسم الخاص بالخلايا التابعة للابنة. للمساعدة في الظروف 3 و 4 ، تتوفر العديد من ناقلات المساعد من خلال Addgene والمصادر التجارية الأخرى التي ترمز للغوغاء وكذلك العديد من ميثيل أسيس للحماية من الكريات المحلية الاصليه في المضيف سيانوكوبالامين43. في هذا البروتوكول ، تم تسهيل الاقتران بسلاله MC1061 e. القولونية التي تحمل المعبئ وناقلات المساعد pRK24 (www. addgeneorg/51950) و pRL528 (www.addgene.org/58495) ، علي التوالي. يجب توخي الحذر عند اختيار المتجات التي سيتم استخدامها للتحويل الزوجي. علي سبيل المثال ، في عده سيانوكوبالامين الذاتي--النسخ المتماثل ناقلات البضائع pPMQAK1 الترميز للبروتين الغوغاء12. ومع ذلك ، pSEVA421 لا44، وعلي هذا النحو ، يجب ان يتم التعبير عن الغوغاء من ناقل المساعد مناسبه. وينبغي ان تكون المتجات المستخدمة مناسبه أيضا للكائن المستهدف. فعلي سبيل المثال ، يتطلب النقل الزوجي الفعال في شركه انابينا sp. 7120 ناقل المساعد الذي يحمي ناقلات المعبئ ضد الهضم (علي سبيل المثال ، pRL623 ، الذي يشفر لثلاثه ميثيل أسيس Avaim ، Eco47iiM و Ecot22iM)45، 46.

وفي هذا البروتوكول ، نقوم بتوضيح كيفيه توصيف أداء الأجزاء (اي المروجين) بعلامة فلورية باستخدام قارئ اللوحة أو مقياس التدفق الخلوي. تدفق الخلايا الخلوية قادره علي قياس الفلوري علي أساس خليه واحده لعدد كبير من السكان. وعلاوة علي ذلك ، تسمح مقاييس التدفق الخلوي للمستخدمين "ببوابه" البيانات المكتسبة وأزاله الضوضاء الخلفية (علي سبيل المثال ، من الجسيمات في الثقافة أو التلوث). وعلي النقيض من ذلك ، فان قراء اللوحات يكتسبون قياسا مضانا لحجم معين من الثقافة ، وعاده ما يكون ذلك في العديد من الآبار المتماثلة. وتشمل المزايا الرئيسية للقراء لوحه علي أجهزه قياس الكريات الخلوية انخفاض التكلفة ، وتوافر اعلي وعاده لا حاجه لبرامج متخصصة لتحليل البيانات المصب. العيوب الرئيسية للقراء لوحه هي حساسية اقل نسبيا بالمقارنة مع المضخمات الخلوية والقضايا المحتملة مع كثافة بصريه من الثقافات المقاسه. النسبة للتحليلات المقارنة ، يجب ان تكون عينات قارئ اللوحات بشكل تطبيع لكل بئر (علي سبيل المثال ، لقياس كثافة الثقافة ، التي تؤخذ عاده علي انها الامتصاص في الكثافة البصرية عند 750 نانومتر [OD750]) ، والتي يمكن ان تؤدي إلى عدم دقه العينات التي هي أيضا كثيفه و/أو غير مختلطة جيدا (علي سبيل المثال ، عندما تكون عرضه للتجميع أو التلبد).

كلمحه عامه ، وهنا نظهر بالتفصيل مبادئ توليد مستوي 0 أجزاء ، تليها الجمعية الهرمية باستخدام مجموعه سيانوكوبالامين والاستنساخ إلى ناقلات مناسبه لنقل الزوجية. ثم نقوم بإثبات عمليه النقل الزوجية ، واختيار سلالات التحويلات التي تعبر عن علامة فلورية ، والحصول لاحقا علي البيانات الفلورية باستخدام مقياس التدفق الخلوي أو قارئ اللوحة.

Protocol

1. الجمعية ناقلات باستخدام أدوات MoClo النبات والسيانيد

ملاحظه: قبل المضي قدما مع الجمعية ناقلات, فمن المستحسن بشده ان المستخدمين التعرف علي هياكل مستوي المتجات من النبات ونظم mocogate موغلو12,15.

  1. بناء أجزاء من المستوي 0
    ملاحظه: يمكن توليف أجزاء المستوي 0 كمتجات كامله أو كتسلسل خطي للتجميع مع المتقبلين من المستوي 0 (علي سبيل المثال ، gBlocks ، IDT). بدلا من ذلك ، يمكن تضخيم متواليات من قالب مصدر (علي سبيل المثال ، ناقل أو الحمض النووي الوراثي المنقي). هنا ، يتم وصف كيفيه إنشاء جزء جديد من المستوي 0 من منتج مضخم. يتم عرض نظره عامه علي عمليه تجميع البوابة الذهبية من المستوي 0 إلى المستوي T فيالشكل 1.
    1. تصميم الإشعال.
      1. تقرر ما هو مستوي 0 وحده لتجميع وتحديد المناسبة 5 ′ و 3 ′ يتدلى (الجدول 1)12,15. تحقق من تسلسل الحمض النووي لاستنساخ لوجود مواقع تقييد BpiI أو BsaI.
        ملاحظه: يجب ان يكون التسلسل الذي يحتوي علي أحد هذه المواقع المستانسه بواسطة تعديل واحد أو أكثر من نتس في تسلسل موقع تقييد. وترد استراتيجية للقيام بذلك باستخدام جمعيه البوابة الذهبية في الشكل 2.
      2. لتضخيم تسلسل الحمض النووي ، وتصميم المناسب للامام وعكس التمهيدي الزوج. للحصول علي التمهيدي إلى الامام ، حدد 18 − 30 bp مكمله ل 5 ′ نهاية تسلسل قالب الحمض النووي. للحصول علي التمهيدي العكسي ، حدد 18 − 30 bp عكس مكمله لنهاية 3 ′ من تسلسل قالب الحمض النووي.
        ملاحظه: الإشعال مع درجات حرارة الذوبان (Tm) من 58 − 62 درجه مئوية عاده ما تعطي نتائج التضخيم الأكثراتساقا(الشكل 1ا).
      3. أضافه ما يلي إلى نهاية 5 ′ التمهيدي إلى الامام: 1) سلسله عشوائية من 4 − 6 نتس في نهاية 5 ′ من الموقع BpiI ، 2) موقع تقييد BpiI (GAAGAC) ، 3) اثنين من المترددين عشوائية ، و 4) المتراكمة 5 ′ المحددة في الخطوة 1.1.1.1. أضافه ما يلي إلى نهاية 5 ′ التمهيدي العكسي: 1) سلسله عشوائية من 4 − 6 نتس في نهاية 5 ′ من الموقع BpiI ، 2) موقع تقييد BpiI (GAAGAC) ، 3) اثنين من المترددين عشوائية ، و 4) المتراكمة 3 ′ المحددة في الخطوة 1.1.1.1. عند الانتهاء ، اطلب أزواج التمهيدي.
        ملاحظه: راجع الشكل 1a للحصول علي مثال عن زوج التمهيدي الامامي والعكسي.
    2. تضخيم تسلسل الحمض النووي من الحمض النووي الجيني.
      1. استخراج الحمض النووي الجيني كما هو موضح في القسم 5. تضخيم المنتجات من قبل PCR باستخدام البوليميراتالحمض النوويعاليه الدقة (جدول المواد).
        ملاحظه: علي سبيل المثال ، قم باعداد تفاعلات PCR (20 − 50 μL) وفقا لتعليمات الشركة المصنعة. استخدام ~ 100 ng من الحمض النووي الجيني لكل رد فعل. استخدام برنامج الدراجات الحرارية التي تتكون من خطوه التشبع الاوليه من 98 درجه مئوية ل 30 ثانيه ، تليها أكثر من 25 دورات من التشبع في 98 درجه مئوية ل 10 ثانيه ، الصلب التمهيدي في 58 درجه مئوية ل 15 ثانيه وتمديد المنتج في 72 درجه مئوية ل 30 ثانيه (تعديل هذا الأخير اعتمادا علي حجم المنتج/نوع من البلمره الحمض النووي المستخدمة) ، تليها خطوه التمديد النهائي من 72 درجه مئوية لمده 2 دقيقه.
      2. إذا كان المنتج PCR ان يكون هلام تنقيه ، تشغيل رد فعل PCR بأكمله علي هلام اجبرز كما هو موضح في القسم 6. قطع الفرقة من الفائدة من هلام اجنشا وتنقيته باستخدام هلام استخراج عده (جدول المواد).
      3. بديل إلى خطوه 1.1.2.2, ان ال [بكر] منتوج ان يكون استعملت دون هلام تنقيه, تحققت النطاق حجم ب يركض [اليقووت] من ال [بكر] رد فعل عينه (~ 5 [ميكرول]) علي [اغبرز] هلام. إذا كان الهلام يظهر فقط الفرقة المناسبة وأي دليل علي الدمامل التمهيدي ، تنقيه المنتج PCR باستخدام مجموعه تنقيه الحمض النووي (جدول المواد).
      4. Elute تنقيه الحمض النووي في حجم صغير من الماء منزوع الأيونات (علي سبيل المثال ، 10 μL) للحصول علي تركيز الحمض النووي عاليه (> 20 نانوغرام/μL عاده ما تكون كافيه).
    3. تجميع منتج الحمض النووي المضخم (أو المنتجات ، انظر الشكل 2) في المستوي 0. قم باعداد مزيج تفاعل 20 μL مع BpiI (الشكل 1B) واعداد برنامج التدوير الحراري كما هو موضح في الجدول 2. انتقل إلى e. القولونية التحول باستخدام 5 μl من مزيج رد فعل المستوي 0 المجمعة (كما هو موضح في القسم 2).
  2. بناء جمعيات المستوي 1
    1. تحديد المستوي 0 أجزاء لتجميع (الشكل 1C والجدول 1). اختيار المناسبة المستوي 1 متقبل متجه15.
      ملاحظه: في هذه المرحلة من المهم ان نعرف ما تصميم ناقلات النهائي سيكون في المستوي T ، لان هذا سيؤثر علي اختيار ناقلات المستوي 1 متقبل. يمكن استخدام المستوي 1 موضع 1 (إلى الامام) المتجه متقبل (pICH47732) كافتراضي إذا كان الهدف هو الحصول علي تجميع مستوي 1 واحد (علي سبيل المثال ، شريط التعبير الجيني) في المستوي T. ومع ذلك ، إذا كان من المقرر تجميع اثنين أو أكثر من التجميعات من المستوي 1 في المستوي T ، يجب مراعاه الموضع والاتجاه لكل تجميع من المستوي 1. يمكن تجميع ما يصل إلى سبعه تجميعات المستوي 1 في متجه المستوي T متقبل باستخدام متجات متقبل المستوي 1 مع المواضع المناسبة12.
    2. تجميع أجزاء المستوي 0 في المستوي 1. قم باعداد مزيج تفاعل 20 μL مع BsaI واعداد برنامج التدوير الحراري كما هو موضح في الجدول 2. انتقل إلى e. القولونية التحول باستخدام 5 μl من مزيج رد فعل المستوي 1 المجمعة (كما هو موضح في القسم 2).
  3. بناء الجمعيات المستوي T
    1. تحديد التجميعات من المستوي 1 للتجميع (الشكل 1D). اختيار متجه المستوي T متقبل المناسبة.
      ملاحظه: pUC19A (مقاومه الامبيسلين) و pUC19S (المقاومة spectinomycin) هي المتجات التكاملية رقم عاليه النسخ التي ليست قادره علي تكرار في البكتيريا الزرقاء وتستخدم في المقام الأول للتكامل الجيني (اي ، تدق في أو ضرب الخروج من الجينات) عن طريق أعاده الدمج المتماثل12. ويمكن تسليم النواقل التكاملية بالتحول الطبيعي في الأنواع القابلة لترتبط القابلة للتحويل11. pPMQAK1 هو مجموعه واسعه من المضيفين ، ناقلات التكرار التي يتم تسليمها عن طريق نقل الزوجية (القسم 3).
    2. اختيار المناسبة نهاية الارتباط لربط 3 ′ نهاية الجمعية المستوي 1 النهائي إلى العمود الفقري المستوي T15.
      ملاحظه: الارتباط النهائي المطلوب هو نفس الرقم كموضع الجزء الأخير. علي سبيل المثال ، سيتطلب متجه المستوي T بموضع واحد فقط من المستوي 1 (إلى الامام أو الخلف) جزءا من الوصلة النهائية 1 (pICH50872) للربط في العمود الفقري للمستوي T.
    3. تجميع واحد أو أكثر من التجميعات المستوي 1 في المستوي T. اعداد مزيج تفاعل مع BpiI وناقل الارتباط النهائي المطلوب واعداد برنامج التدوير الحراري كما هو موضح في الجدول 2. انتقل إلى e. القولونية التحول باستخدام 5 μl من مزيج رد فعل المستوي T المجمعة (كما هو موضح في القسم 2).

2.e . القولونية التحول وتنقيه ناقلات

  1. E. القولونية التحول (اليوم 1)
    1. أذابه الصقيع (~ 25 μL) من الخلايا e. القولونية المختصة كيميائيا (جدول المواد) وماصه بلطف في أنبوب 1.5 mL علي الجليد. أضافه 5 μL من مزيج التجميع (المستوي 0, 1 أو T) واحتضان الأنبوب علي الجليد لمده 30 − 60 دقيقه أخرى.
    2. خلايا الصدمة الحرارية عن طريق احتضان الأنبوب في حمام مائي في 42 درجه مئوية ل 30 ثانيه ، ثم وضع الأنبوب مره أخرى علي الجليد لمده 2 دقيقه. أضافه درجه حرارة الغرفة (RT) سوبر الأمثل مع القمع هدم (S.O.C.) المتوسطة (250 μL) إلى أنبوب. احتضان الأنبوب في 37 درجه مئوية ل 1 ح في 225 دوره في الدقيقة في حاضنه تهتز.
    3. لوحه 40 μl من الثقافة علي لوحه أجار LB تحتوي علي التركيز النهائي المناسب من المضادات الحيوية (100 ميكروغرام/مل ل السبيكتينوميسين ثنائي هيدروكلوريد خماسي الهيدرات [المستوي 0] ، 100 ميكروغرام/مل من الصوديوم كاربينسيلين [المستوي 1] ، أو 50 ميكروغرام/مل من كبريتات الكاناميسين [ مستوي T]) ، 1 مم ايزوبروبيل-بيتا-د-ثيوغالالاكتويرانيوسايد (IPTG) و 40 ميكروغرام/مل من 5-برومو-4-كلورو-3-indolyl-β-D-جالاكتوبيرانوسيدي (X-غال) للفحص الأزرق والأبيض. احتضان اللوحة بين عشيه وضحيها في 37 درجه مئوية.
      ملاحظه: يمكن ان تختلف كميه الثقافة مطلي اعتمادا علي كفاءه الخلايا e. القولونية المختصة وتفاعل الربط. لوحه حجم أكبر إذا لوحظ < 10 مستعمرات بعد الحضانة بين عشيه وضحيها.
  2. اختيار المستعمرات البيضاء واعداد الثقافات السائلة (اليوم الثاني)
    ملاحظه: اعتمادا علي كفاءه رد فعل الجمعية والتحويل اللاحق ، لوحات أجار LB قد لا تحتوي علي مستعمرات أو مستعمرات زرقاء أو مستعمرات بيضاء (الشكل 3). المستعمرات الزرقاء هي مؤشر لمتجات متقبل التي لم تخضع للقيود (اي ، نسخه وظيفية من Lacz لا تزال موجودة). تشير المستعمرات البيضاء إلى انه قد تم فقدان كاسيت التعبير Lacz واستبداله بجزء/تجميع.
    1. وبشكل اختياري ، تحقق من ان المستعمرات البيضاء تحتوي علي المتجه المتوقع من خلال تنفيذ PCR كما هو موضح في القسم 7.
    2. اختيار مستعمرات بيضاء واحده (أو المستعمرات PCR التحقق) مع 10 μL غيض ونقل إلى 15 مل أنبوب الطرد المركزي التي تحتوي علي LB المتوسطة (5 مل) وتركيزات المضادات الحيوية المناسبة (الخطوة 2-1-3). احتضان الأنابيب في 37 درجه مئوية بين عشيه وضحيها في 225 دوره في الدقيقة في حاضنه تهتز.
  3. تنقيه ناقلات plasmid (اليوم 3)
    1. اختياريا ، واعداد الأسهم الجلسرين من الثقافة e. كولاي بين عشيه وضحيها لمخزن علي المدى الطويل من ناقلات. أضافه 500 μL من الثقافة البكتيرية إلى 500 μL من 50 ٪ (v/v) الجلسرين في أنبوب 1.5 − 2.0 mL المناسبة لمخزن at-80 درجه مئوية. اخلطه برفق من خلال عكس 5 − 10x. فلاش تجميد عينات في النيتروجين السائل وتخزينها في 80 درجه مئوية الفريزر.
    2. تدور الثقافات في 15 مل أنابيب الطرد المركزي في 3,000 x g لمده 5 − 10 دقيقه. تجاهل ماده طافي دون إزعاج الخلية بيليه. تنقيه المتجه باستخدام مجموعه تنقيه البلازميد (جدول المواد). Elute تنقيه ناقلات في 35 μL من الماء منزوع الأيونات.
      ملاحظه: استخدام وحدات تخزين اقل الشطف لزيادة تركيز المتجه. ويمكن وضع نفس الأنف من خلال عمود تنقيه مرتين لزيادة الغلة.
    3. قياس تركيز المتجه في الأنف باستخدام مقياس طيفي (جدول المواد).
      ملاحظه: المتجات العالية النسخ في e. كولاي، مثل pUC19 ، تعطي عاده غله من 50 − 300 نانوغرام/Μl. انخفاض عدد ناقلات النسخ ، مثل pPMQAK1 ، تعطي عاده غله من 15 − 60 نانوغرام/μl.
  4. التحقق من صحة ناقلات
    ملاحظه: يمكن التحقق من المتجات عن طريق الهضم قيد (الخطوة 2-4-1) و/أو التسلسل (الخطوة 2-4).
    1. تقييد 0.5 − 1 ميكروغرام من ناقلات مع انزيم (ق) تقييد المناسبة والتحقق من احجام النطاق المتوقع كما هو موضح في القسم 6 (الشكل 4).
      ملاحظه: احجام النطاق غير صحيحه تشير عاده إلى التجميع الخاطئ ، وفي هذه الحالة يمكن فحص المزيد من المستعمرات البيضاء أو يمكن تكرار التجميع. يمكن استخدام BsaI و BpiI للتحقق من صحة الحجم الصحيح لادراج المستوي 0 وتجميعات المستوي 1 ، علي التوالي. يمكن استخدام BsaI أو BpiI بالتزامن مع انزيم تقييد إضافي ومتوافق والذي يقطع داخل الادراج و/أو العمود الفقري المتجه لإنتاج مجموعه متميزة من النطاقات المفصولة جيدا بعد الهضم.
    2. تسلسل المتجه بواسطة تسلسل Sanger باستخدام التمهيدي المناسب المنبع من المنطقة المجمعة باستخدام مرفق التسلسل التجاري (الجدول 3).
      ملاحظه: يجب ان تكون كافة أجزاء المستوي 0 الجديد متسلسلة لتاكيد هويه التسلسل المتوقع. لا يكون التحقق من صحة التسلسل لمتجات المستوي 1 و T عاده مطلوبا إذا تم تجميعه من أجزاء المستوي 0 المتسلسلة سابقا.

3. توليد المسوخ عن طريق الاقتران

ملاحظه: هنا ، يتم وصف بروتوكول لنقل الزوجية من ناقلات البضائع النسخ المتماثل الذاتي إلى synechالونجاتوس sti الشركة ال6803ه للنقل الخاصة أو s. ال2973 utex11،47 . وينطبق هذا البروتوكول علي الأنواع الأخرى من النماذج (علي سبيل المثال ، s. الونجاتوس 7942 و Synechococcus sp. 7002). وينبغي ان يتم جميع العمل مع البكتيريا الزرقاء (والاستعدادات العازلة المرتبطة بها) في ظل ظروف معقمه في غطاء التيار الرقائقي.

  1. نمو من ال [ترتبط كلتثر] (يوم 1)
    1. اعداد BG11 المتوسطة وفقا ليا سميث وآخرون11، ولوحات أجار مع LB-BG11 و BG11 + Kan50 (القسم 8).
    2. اعداد ثقافة جديده من Synechالونجاتوس sti الوحدة ال6803ه أو s. BG11 utex 2973 عن طريق تلقيح قارورة مخروطيه 100 ml من الطازجة المتوسطة (50 ml) مع الخلايا المصدرة من لوحه أجار BG11 اكسرينك. تنمو الثقافات ال6803ه في 30 درجه مئوية ، 100 ميكرومول الفوتونات م-2s-1 في 100 دوره في الدقيقة وتنمو s. الونجاتوس utex 2973 في 40 درجه مئوية ، 300 ميكرومول الفوتونات م-2s-1 في 100 دوره في الدقيقة. تنمو الثقافات حتى OD750 = 0.5 − 1.5 (عاده 1 − 2 أيام).
      ملاحظه: الونجاتوس utex 2973 الثقافات يمكن زراعتها في 40 درجه مئوية في كثافة الضوء العالي (علي سبيل المثال ، 2000 ميكرومول الفوتونات m-2S-1)48.
  2. نمو المساعد والبضائع e. القولونية سلالات (اليوم 2)
    1. تطعيم LB المتوسطة التي تحتوي علي الامبيسلين (التركيز النهائي 100 ميكروغرام/مل) و الكلورامفينيكول (التركيز النهائي 25 ميكروغرام/مل) مع سلاله MC1061 التي تحتوي علي ناقلات pRK24 و pRL528 ( اي سلاله المساعد) وتنمو في 37 درجه مئوية بين عشيه وضحيها في 225 دوره في الدقيقة في حاضنه الاهتزاز. يكبر حجم كافيه من ثقافة سلاله المساعد ، علي افتراض 1 مل من الثقافة مطلوبه لكل الاقتران.
    2. تطعيم LB المتوسطة (5 مل) التي تحتوي علي المضادات الحيوية المناسبة مع الثقافة e. كولاي تحمل ناقلات البضائع (اي متجه المستوي T). تنمو الثقافة في 37 درجه مئوية بين عشيه وضحيها في 225 دوره في الدقيقة في حاضنه الاهتزاز.
  3. الانتقال الزوجي (التزاوج ثلاثي الوالدين) (اليوم الثالث)
    1. اعداد المساعد القولونية وسلالات البضائع. الطرد المركزي المساعد والبضائع e. كولاي الثقافات بين عشيه وضحيها في 3,000 x g لمده 10 دقيقه في درجه حرارة الغرفة. تجاهل ماده طافي دون إزعاج بيليه الخلية.
    2. غسل بيليه عن طريق أضافه الطازجة LB المتوسطة دون المضادات الحيوية. استخدام نفس وحده التخزين كالثقافة الاوليه. أعاده تعليق بيليه عن طريق الأنابيب بلطف صعودا وهبوطا. لا دوامه الثقافة. كرر هذه الخطوة 3x لأزاله المضادات الحيوية المتبقية من الثقافة بين عشيه وضحيها.
    3. طرد مركزي الثقافة المعاد تعليقها (كما هو الحال في الخطوة 3-3-1) ، وتجاهل ماده طافي وأعاده التعليق في نصف حجم LB متوسطه من حجم الثقافة الاوليه (علي سبيل المثال ، 2.5 ml إذا كانت الثقافة بين عشيه وضحيها 5 مل). الجمع بين 450 μL من سلاله المساعد مع 450 μL من سلاله البضائع في أنبوب 2 مل ووضع جانبا (ترك في RT) حتى 3.3.6 الخطوة.
    4. اعداد الثقافة الترتبطه. لكل رد فعل الاقتران ، استخدم 1 مل من الثقافة الترتبطه (OD750 = 0.5 − 1.5).
    5. الطرد المركزي الحجم الإجمالي المطلوب للثقافة ترتبط في 1,500 x g ل 10 دقيقه في RT ، ثم تجاهل ماده طافي بعناية دون إزعاج بيليه الخلية. يغسل بيليه عن طريق أضافه BG11 الطازجة المتوسطة من نفس الحجم الاولي. أعاده تعليق بيليه عن طريق الأنابيب بلطف صعودا وهبوطا ، لا دوامه الثقافة. كرر هذه الخطوة 3x وتعيين الثقافة غسلها جانبا.
    6. أضافه الترتبط من الثقافة المغسولة (900 μL) إلى مجموعات e. القولونية (المساعد والبضائع) (900 μl) في أنبوب 2 مل. تخلط الثقافات عن طريق الأنابيب بلطف صعودا وهبوطا. لا دوامه. احتضان الخليط في RT لمده 30 دقيقه ل Synechёrs ال6803ه الثانية أو 2 ح ل s. الونجاتوس utex 2973.
    7. الطرد المركزي الخليط في 1,500 x g لمده 10 دقيقه في RT. أزاله 1.6 mL من supernatant. أعاده تعليق بيليه في المتبقية ~ 200 μL من supernatant. وضع فلتر غشاء 0.45 μm علي لوحه أجار رطل BG11 تفتقر إلى المضادات الحيوية (القسم 8). تنتشر بعناية 200 μl من مزيج الثقافة e. القولونية/cyanobacterial علي الغشاء مع رش معقمه أو طرف العقيمة محني وختم لوحه مع الفيلم البارافين.
    8. احتضان لوحه LB-BG11 مع الغشاء ل 24 ح. الحفاظ علي الاغشيه مع الثقافات ال6803ه الصلبة الصلبة في 30 درجه مئوية ، 100 ميكرومول الفوتونات م-2s-1. الحفاظ علي الاغشيه مع s. الونجاتوس utex 2973 الثقافات في 40 درجه مئوية في 150 ميكرومول الفوتونات م-2S-1.
  4. نقل الغشاء
    1. بعد 24 ساعة ، نقل بعناية الغشاء باستخدام ملقط اللهب تعقيمها إلى لوحه أجار BG11 الطازجة التي تحتوي علي المضادات الحيوية المناسبة (القسم 8) لتحديد لناقلات البضائع. ختم لوحه مع الفيلم البارافين.
    2. احتضان لوحه أجار BG11 في ظل ظروف النمو المناسبة ، كما هو موضح أعلاه ل Synechocystis ال6803 الصلبة أو s. الونجاتوس utex 2973 ، حتى تظهر مستعمرات.
      ملاحظه: المستعمرات عاده ما تظهر بعد 7 − 14 يوما ل Synechالونجاتوس sti الشركة العامة ل6803 و 3 − 7 أيام ل s. ال2973 utex.
  5. اختيار الكونجوجانتس
    ملاحظه: المستعمرات ترتبط فقط تحمل ناقلات البضائع سوف تكون قادره علي النمو علي الغشاء (الشكل 5).
    1. باستخدام حلقه معقمه الحرارة ، حدد ما لا يقل عن اثنين من المستعمرات الفردية من الغشاء وخط علي لوحه أجار BG11 جديده تحتوي علي المضادات الحيوية المناسبة (الشكل 5ج).
      ملاحظه: المستعمرات الطازجة قد لا تزال ملوثه مع e. القولونية التي تم ترحيلها من الاقتران (اي إذا كانت المستعمرات البيضاء الصغيرة واضحة علي لوحه) ، لذلك اثنين أو ثلاث جولات اضافيه من أعاده الينثر علي لوحات أجار BG11 الطازجة هي عاده اللازمة للحصول علي ثقافة ترتبط اكسرينوس.
    2. تاكيد غياب e. كولاي التلوث عن طريق تطعيم سلسله من الثقافة الترتبطه في أنبوب الطرد المركزي 15 مل تحتوي علي 5 مل من المتوسطة LB واحتضان في 37 درجه مئوية بين عشيه وضحيها في 225 دوره في الدقيقة في حاضنه تهتز. بعد فتره نمو كافيه (~ 7 أيام) ، واختيار المستعمرات axenنوس الفردية لأقامه الثقافات السائلة لمخزن علي المدى الطويل أو التجارب اللاحقة.
  6. مخزن من سلالات ترتبط
    1. تنمو الثقافة السائلة ترتبط في BG11 (كما هو موضح في القسم 3.1) حتى OD750 = 1.5 − 3.0. الطرد المركزي 10 مل من الثقافة لمده 10 دقيقه في 1,500 x g، أزاله ماده طافي وأعاده تعليق الخلايا في 5 مل من الطازجة BG11 المتوسطة.
    2. أضافه 3.5 mL من الاوتوكلاف تعقيم 50 ٪ (v/v) الجلسرين لتركيز الجلسرين النهائي من ~ 20 ٪ (v/v)49. هذا النهج يعمل بشكل جيد لل Synechocystis الاتصالات ال6803ه. بدلا من ذلك ، أضافه 5 مل من فلتر تعقيم BG11 التي تحتوي علي 16 ٪ (v/v) ثنائي ميثيل سلفوكسيد (dmso) لتركيز dmso النهائي من ~ 8 ٪ (v/v)50. ويوصي بهذا النهج لمعظم السلالات ، بما في ذلك s. الونجاتوس utex 2973.
      تحذير: DMSO سامه وينبغي التعامل معها مع الحماية المناسبة.
    3. اخلطه برفق من خلال عكس 5 − 10x. Subaliquot ~ 1 مل من الثقافة في منفصلة مخزن متوافقة 1.5 mL أنابيب المسمار كاب (جدول المواد). وضع أنابيب في 80 درجه مئوية الفريزر لمخزن. لا فلاش تجميد في النيتروجين السائل.
      ملاحظه: يوصي بثلاثه أسهم علي الأقل لكل سلاله.
    4. للانتعاش ، وأزاله أنبوب من-80 درجه مئوية الفريزر وذوبان الثقافة في 35 درجه مئوية حمام المياه في حين خلط بلطف. أضف الثقافة المذابة إلى 50 مل من الBG11 الطازجة المتوسطة والنمو كثقافة سائله (كما هو موضح في القسم 3.1).
      ملاحظه: بدلا من ذلك ، يمكن ان تكون الثقافة ستريمل ونميت علي لوحه أجار BG11 الطازجة. يجب احياء الثقافات المحورة وراثيا تحمل علامات الاختيار في البداية علي لوحات أجار BG11 دون المضادات الحيوية ومن ثم أعيدت تعبئتها علي لوحات أجار BG11 مع المضادات الحيوية المناسبة.

4-توصيف المروج

ملاحظه: هنا يتم وصف النهج القياسي لتحليل قوه جزء المروج عن طريق قياس مستويات التعبير من علامة الفلورسنت (eYFP) بعد فتره نمو 72 h باستخدام اما قارئ لوحه أو تدفق المضخم12.

  1. النمو الثقافي
    1. اعداد ثقافات البذور عن طريق تطعيم 10 مل من BG11 المتوسطة التي تحتوي علي المضادات الحيوية المناسبة مع مستعمره واحده من سلاله ترتبط المحورة وراثيا تحمل كاسيت التعبير علامة الفلورسنت. أيضا اعداد ثقافات البذور لسلالات التحكم السلبية المناسبة (علي سبيل المثال ، سلاله نوع البرية و/أو سلاله المحورة وراثيا تحمل نفس العمود الفقري ناقلات ولكنها تفتقر إلى كاسيت التعبير علامة الفلورسنت).
      ملاحظه: يوصي بأربع نسخ متماثلة بيولوجية علي الأقل.
    2. تنمو الثقافات البذور ل 48 h أو حتى OD750 = 1 − 1.5 تحت ظروف النمو المناسب لسلاله الأنواع.
    3. لتتبع المروج التعبير مع مرور الوقت ، أولا قياس OD750 من كل ثقافة البذور. حساب متطلبات التخفيف لجلب كل ثقافة إلى بداية OD750 = 0.2. اعداد عينات الثقافة التجريبية المخففة (حجم الإجمالي 2 مل) في لوحه مسطحه القاع 24 بئر (جدول المواد).
    4. احتضان لوحه في حاضنه تهتز مع أضواء LED بيضاء (جدول المواد) في ظل ظروف النمو المناسبة. قياس كثافة النمو الثقافي (OD750) والبروتين الفلوري الأصفر المعزز (eyfp) الفلوري باستخدام اما قارئ لوحه (القسم 4.2) أو مقياس التدفق الخلوي (القسم 4.3).
      ملاحظه: يمكن ان تزرع الثقافات ال6803ه الخاصة بالرقم المحلي العام و s. الونجاتوس utex 2973 كما في الخطوة 3-1-2. ويوصي بشده ان يتم الحفاظ علي لوحه تحت الرطوبة العالية (95 ٪) لتجنب تبخر عينات الثقافة.
  2. قارئ لوحه
    1. امزج الثقافات بإيجاز في اللوحة التي تضم 24 بئرا (الخطوة التالية) باستخدام الماصات اللطيفة. نقل عينه فرعيه من كل ثقافة إلى لوحه سوداء مسطحه القاع 96-بئر (جدول المواد). تمييع إذا لزم الأمر (100 الحجم النهائي μL). تجنب تشكيل فقاعات لان هذا يمكن ان تتداخل مع دقه القياس.
      ملاحظه: من المستحسن ان يتم تنفيذ جميع القياسات علي عينات في نطاق OD750 من 0.2 − 1.0. كما كثافة الثقافات في 24-حسنا سوف تزيد مع مرور الوقت ، ويوصي المخففات التالية استنادا إلى الزيادات المتوقعة في ظروف النمو القياسية: لا التخفيف في 0 ح ، 1:4 في 24 ح ، 1:10 في 48 h و 1:10 في 72 h. هكذا علي سبيل المثال ، في 24 ح الحصاد 25 μL من الثقافة وتخلط مع 75 μL من BG11 المتوسطة.
    2. وتشمل اثنين من الآبار فارغه في لوحه 96-بئر (اي ، 100 μL من BG11 المتوسطة). وضع لوحه 96 البئر في قارئ لوحه (جدول المواد). يهز لوحه ل 60 s في 500 دوره في الدقيقة باستخدام شاكر المدارية في القارئ لوحه لخلط الآبار.
      ملاحظه: يمكن للثقافات ترتبط تجميع و/أو التلبد ، لذا فان الخلط الجيد أمر بالغ الاهميه قبل القراءة لاجراء قياسات دقيقه.
    3. قياس OD750 والفلوري eyfp مع موجات الاثاره/الانبعاثات في 485 nm/520 نانومتر.
    4. طرح متوسط قياسات OD750 لبئرين فارغتين من قياس od750 لكل عينه تحتوي علي ثقافة البكتيريا الزرقاء بشكل جيد.
    5. تطبيع القيم الفلورية لكل عينه الثقافة عن طريق تقسيم القياس الفلورية eYFP (الخطوة 4-2) بواسطة750 OD المعدلة للثقافة (الخطوة 4.2.4). ثم نطرح متوسط قيمه الفلورية العادية (eYFP الفلورية/OD750) من الحيوية التي تحاكي السلالة المناسبة للسيطرة السلبية من السلالات المعدلة وراثيا التي تحمل كاسيت التعبير eyfp.
      ملاحظه: يتالق البكتيريا الزرقاء بشكل طبيعي بسبب وجود اصباغ ، مثل الكلوروفيل والبروتينات الفيكوبيليليه.
    6. مؤامرة النمو الثقافي مع مرور الوقت (الشكل 6A) ومتوسط تطبيع القيم الفلورية لكل ثقافة تجريبية في النقاط الزمنيه المطلوبة (علي سبيل المثال ، 72 h ؛ الشكل 6(ب).
  3. تدفق المضخم الخلوي
    1. اختيار لوحه متوافقة لتدفق نظام مناوله السائل الخلوي. علي سبيل المثال ، استخدم لوحه 96 القاع المستديرة (جدول المواد) مع مقياس التدفق الخلوي (جدول المواد) المستخدم في هذا البروتوكول.
    2. امزج الثقافات بإيجاز في اللوحة التي تضم 24 بئرا (الخطوة التالية) باستخدام الماصات اللطيفة. تمييع الثقافات إلى OD750 = 0.1 − 0.2 لتجنب انسداد فوهه في نظام مناوله السائل. أضافه حجم مناسب من عينه الثقافة إلى لوحه 96-حسنا وجلب إلى الحجم النهائي من 250 μL مع فلتر-تعقيم 1x الفوسفات-مخزنه المالحة (تلفزيوني). وتشمل بئر فارغه للحل المتوسط علي لوحه تحتوي علي 60 μL من BG11 و 190 μL من 1x تلفزيوني.
      ملاحظه: يوصي بوحدة التخزين هذه في حاله وجود حاجه إلى أعاده تشغيل العينات. لا ينصح وحدات التخزين اعلي من 250 μL كحد اقصي لحجم كل بئر هو 300 μL.
    3. وبمجرد ان يكون مقياس التدفق الخلوي جاهزا للاستخدام ، ضع لوحه 96 بشكل جيد مع عينات الثقافة في محطه مناوله السائل. اعداد بروتوكول البرنامج لمقياس التدفق الخلوي لجمع قياسات 10,000 الاحداث الفردية (علي سبيل المثال ، الخلايا). قياس الفلورية eYFP مع الاثاره/الانبعاثات الموجية من 488 nm/515 − 545 نانومتر. التدبير الأول والتحقق من القراءة من بئر فارغه (الشكل 7ا) ، ثم تشغيل العينات.
    4. بوابه السكان من خلايا البكتيريا الزرقاء داخل مجموعات البيانات مبعثر إلى الامام والجانب ، باستثناء المناطق المشتركة مع قراءه فارغه (الشكل 7ب). طرح متوسط القيم الفلورية eYFP من البيولوجية نسخا متماثلة من سلاله التحكم السلبية المناسبة من سلالات المعدلة وراثيا تحمل كاسيت التعبير eYFP (الشكل 7C ، D). رسم متوسط قيم الفلورية المتوسطة لكل خليه لكل ثقافة تجريبية في النقاط الزمنيه المطلوبة (علي سبيل المثال ، 72 h ؛ الشكل 7(ه).

5. استخراج الجينات الجينية من البكتيريا الزرقاء

ملاحظه: يستخدم البروتوكول أدناه مجموعه استخراج الحمض النووي التجارية (جدول المواد).

  1. تنمو الثقافة السائلة ترتبط في BG11 (كما هو موضح في القسم 3.1) حتى OD750 = 1.5 − 3.0. تدور 10 مل من الثقافة في 3,000 x g لمده 10 دقيقه وتجاهل supernatant. تجميد بيليه عن طريق احتضان الأنابيب في-20 درجه مئوية لمده 30 دقيقه.
  2. أضافه 400 μL من المخزن المؤقت تحلل (المخزن المؤقت AP1) و 400 μL من محلول ريبونكليوداز (RNase A) ، و 50 ٪ (w/v) من الخرز الزجاجي (0.5 مم قطر). تعطيل العينات باستخدام مطحنه حبه (جدول المواد) في 30 هرتز (اي ما يعادل 1,800 الذبذبات/دقيقه) لمده 6 دقائق.
  3. تدور العينة في 17,000 x g لمده 5 دقائق ونقل بعناية ماده طافي إلى أنبوب جديد وتجاهل بيليه. المضي قدما وفقا لتعليمات الشركة المصنعة (جدول المواد).

6. اجبرز هلام الكهربائي

  1. يلقي 1 ٪ (ث/الخامس) هلام اجنشا تحتوي علي 0.02 ٪ (v/v) بروميد ايثيديوم. تحميل العينات والمرجعية المناسبة سلم الحمض النووي.
  2. تشغيل عينات ل 50 دقيقه في 125 V. التحقق من فصل الفرقة علي الاشعه فوق البنفسجية (UV) المصباح.
    ملاحظه: يمكن تعديل الوقت قيد التشغيل والنسبة المئوية هلام اجبرز لتتناسب مع حجم الفرقة المتوقعة. فعلي سبيل المثال ، قد يحسن النسبة المئوية الأعلى للهلام ووقت التشغيل الأطول من دقه النطاق وفصل منتجات الحمض النووي < 500 bp.

7. مستعمره PCR

  1. اعداد مزيج تفاعل PCR باستخدام مجموعه قياسيه (جدول المواد) ومزيج مناسب من الإشعال (علي سبيل المثال ، الإشعال التي تحيط بمنطقه التجميع أو التي تخص تسلسلات داخل منطقه التجميع (الجدول 3). ماصه 10 μL في أنبوب PCR.
  2. لمس برفق اعلي مستعمره بيضاء واحده مع مسواك معقمه أو 10 μL طرف ماصه وتطعيم أنبوب PCR التي تحتوي علي مزيج تفاعل PCR. اهتم بوضع علامة علي المستعمرة والمباراة مع أنبوب PCR محدده. يحرك مزيج التفاعل برفق لضمان التخلص من الخلايا القولونية في المحلول.
  3. تضخيم المنتجات من قبل PCR. استخدام برنامج يتكون من خطوه التشبع الاوليه من 95 درجه مئوية ل 60 s ، 30 جولات من 95 درجه مئوية ل 15 ثانيه ، 58 درجه مئوية ل 15 ثانيه (درجات قليله تحت القيم Tm من الإشعال) ، 72 درجه مئوية ل 30 ثانيه (30 s/kb من ادراج) ، تليها خطوه التمديد النهائي من 72 درجه مئوية لمده 5 دقائق.

8. اعداد BG11 المتوسطة ولوحهات

  1. اعداد حلول الأسهم من 100x BG11 المتوسطة ، والحديد (سيترات الأمونيوم حديديك) ، والعناصر النزره ، والفوسفات (K2hpo4) ، Na2CO3 و TES العازلة وفقا ل Lea-سميث وآخرون11. الفوسفات الاوتوكلاف و Na2CO3 الأسهم. استخدام مرشحات 0.2 μm لتصفيه تعقيم المخزن المؤقت TES (pH 8.2) وحلول الأسهم ناهكو3 .
  2. اعداد 1 لتر من BG11 المتوسطة. مزيج 10 مل من 100x BG11 ، 1 مل من العناصر النزره و 1 مل من الأسهم الحديد والاوتوكلاف الحل مع 976 مل من الماء. مره واحده وقد يبرد الحل وصولا إلى RT ، أضافه 1 مل من الأسهم الفوسفات ، 1 مل من Na2CO3 الأسهم و 10 مل من ناهكو3، والتكيف مع درجه الحموضة 7.6 − 7.8 مع 1 م HCl.
  3. BG11 أجار لوحات (1.5 ٪ [w/v])
    1. الجمع بين 700 مل من الماء منزوع الأيونات و 15 غرام من أجار في قارورة زجاجيه. في قارورة الثانية ، أضافه 186 mL من الماء ، 10 مل من 100x BG11 ، 1 مل من العناصر النزره و 1 مل من الحديد المخزون. الاوتوكلاف كلا الحلين.
    2. مره واحده وقد هدات الحلول وصولا إلى حوالي 60 درجه مئوية ، والجمع بينهما وأضافه 1 مل من الأسهم الفوسفات ، 1 مل من Na2CO3 الأسهم ، 10 مل من ناسكو3 الأسهم و 50 مل من المتوسطة العقيمة LB ، والتي ينبغي ان تعطي المجلد النهائي من 1 ل. يلقي بيتري الاطباق مع 25 mL من BG11 أجار المتوسطة.
  4. BG11 + Kan50 أجار لوحات (1.5 ٪ [w/v])
    1. الجمع بين 700 مل من الماء منزوع الأيونات و 15 غرام من أجار في قارورة زجاجيه. في قارورة ثانيه ، أضافه 3 غرام من ثيوكبريتات الصوديوم (Na2S2O3) ، 226 mL من الماء ، 10 مل من الأسهم BG11 100x ، 1 مل من العناصر النزره و 1 مل من الأسهم الحديد. الاوتوكلاف كلا الحلين.
    2. مره واحده وقد تبريد الحلول وصولا إلى حوالي 60 درجه مئوية ، والجمع بينهما وأضافه 1 مل من الأسهم الفوسفات ، 1 مل من Na2CO3 الأسهم ، 10 مل من المخزون الاحتياطي TES ، و 10 مل من الأوراق المالية نامكو3 ، والتي ينبغي ان تعطي المجلد النهائي من 1 ل. أضافه كاناميسين كبريتات إلى التركيز النهائي من 50 ميكروغرام/مل ويلقي اطباق بيتري مع 35 مل من المتوسطة.

النتائج

لإظهار سير عمل تجميع البوابة الذهبية ، تم تجميع كاسيت التعبير في الموضع 1 للمستوي 1 (إلى الامام) المتجه متقبل (pICH47732) الذي يحتوي علي الأجزاء التالية من المستوي 0: المروج لل C-phycocyanin Pcpc560 (pc 0.005) ، تسلسل الترميز eYFP (pC 0.008) والمنهي مزدوجة Trr (pc 0.082)12....

Discussion

البوابة الذهبية الجمعية لديها العديد من المزايا مقارنه مع غيرها من وسائل التجميع ناقلات, لا سيما من حيث قابليه20,21. ومع ذلك ، يتطلب إنشاء نظام البوابة الذهبية في المختبر وقتا لتطوير إلمام بالأجزاء المختلفة والمكتبات المتجهة المتقبلة وعمليات التجميع الشامل?...

Disclosures

وليس لدي المؤلفين ما يفصحون عنه.

Acknowledgements

ويعرب أصحاب البلاغ عن امتنانهم لشبكه التكنولوجيا الحيوية والبيولوجية الصناعية ومركز الابتكار في مجال التكنولوجيا الحيوية الصناعية (IBioIC) للدعم المالي. GARG, AASO و AP الاعتراف بالدعم التمويلي من برنامج الدكتوراه الحالة المالية BBSRC EASTBIO (منحه رقم BB/M010996/1), Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (CONACYT) برنامج الدكتوراه, و IBioIC-BBSRC شراكه التدريب التعاوني (CTP) برنامج الدكتوراه, التوالي. نشكر كونراد موليليفو (جامعه الملكة ماري في لندن) ، وبول اريك جينسن ، وجولي Annemarie يتا زيسلر (جامعه كوبنهاجن) للحصول علي ناقلات البلازميد والمساهمات والمشورة في البروتوكول.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside (X-Gal)Thermo Fisher ScientificR0404Used in 2.1.3.
Adenosine 5′-triphosphate (ATP) disodium saltSigma-AldrichA2383Used in Table 2.
Agar (microbiology tested)Sigma-AldrichA1296-500gUsed in 8.3.
AgaroseBiolineBIO-41026Used in 6.
Attune NxT Flow CytometerThermo Fisher Scientific-Used in 4.3.1.
Bovine Serum Albumin (BSA)Sigma-AldrichA2153Used in Table 2.
BpiI (BbsI)Thermo Fisher ScientificER1011Used in Table 2.
BsaI (Eco31I)Thermo Fisher ScientificER0291Used in Table 2.
Carbenicillin disodiumVWR InternationalA1491.0005Used in 2.1.3.
Corning Costar TC-Treated flat-bottom 24 well platesSigma-AldrichCLS3527Used in 4.1.3.
Dimethyl Sulfoxide (DMSO)Thermo Fisher ScientificBP231-100Used in 3.6.2.
DNeasy Plant Mini KitQiagen69104DNA extraction kit. Used in 5.
FLUOstar Omega Microplate readerBMG Labtech-Used in 4.2.2.
GeneJET Plasmid Miniprep KitThermo Fisher ScientificK0503Plasmid purification kit. Used in step 2.3.2.
Glass beads (0.5 mm diameter)BioSpec Products11079105Used in 5.2.
GlycerolThermo Fisher Scientific10021083Used in 2.3.1, 3.6.2.
Isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside (IPTG)Thermo Fisher Scientific10356553Used in 2.1.3.
Kanamycin sulphate (Gibco)Thermo Fisher Scientific11815-024Used in 2.1.3.
Membrane filters (0.45 μm)MF-MilliporeHAWP02500Used in 3.3.7
Microplates, 96-well, flat-bottom (Chimney Well) µCLEARGreiner Bio-One655096Used in 4.2.1.
Monarch DNA Gel Extraction KitNew England BiolabsT1020SUsed in 1.1.2.2.
Monarch PCR DNA Cleanup KitNew England BiolabsT1030DNA purification kit. Used in 1.1.2.3.
Multitron Pro incubator with LEDsInfors HT-Shaking incubator with white LED lights. Used in 4.1.4.
MyTaq DNA PolymeraseBiolineBIO-21108Used in 7.1.
NanoDrop OneThermo Fisher ScientificND-ONE-WUsed in 2.3.3.
One Shot TOP10 chemically competent E. coliThermo Fisher ScientificC404010Used in 2.1.1.
Phosphate buffer saline (PBS) solution (10X concentrate)VWR InternationalK813Used in 4.3.2.
Q5High-Fidelity DNA PolymeraseNew England BiolabsM0491SUsed in 1.1.2.1.
Quick-Load 1 kb DNA LadderNew England BiolabsN0468SUsed in Figure 4.
Screw-cap tubes (1.5 ml)Starstedt72.692.210Used in 3.6.3
Spectinomycin dihydrochloride pentahydrateVWR InternationalJ61820.06Used in 2.1.3.
Sterilin Clear Microtiter round-bottom 96-well platesThermo Fisher Scientific612U96Used in 4.3.1.
T4 DNA ligaseThermo Fisher ScientificEL0011Used in Table 2.
TissueLyser IIQiagen85300Bead mill. Used in 5.2.

References

  1. Luan, G., Lu, X. Tailoring cyanobacterial cell factory for improved industrial properties. Biotechnology Advances. 36 (2), 430-442 (2018).
  2. Madsen, M. A., Semerdzhiev, S., Amtmann, A., Tonon, T. Engineering mannitol biosynthesis in Escherichia coli and Synechococcus sp. PCC 7002 using a green algal fusion protein. ACS Synthetic Biology. 7 (12), 2833-2840 (2018).
  3. Menin, B., et al. Non-endogenous ketocarotenoid accumulation in engineered Synechocystis sp. PCC 6803. Physiologia Plantarum. 166 (1), 403-412 (2019).
  4. Varman, A. M., Yu, Y., You, L., Tang, Y. J. Photoautotrophic production of D-lactic acid in an engineered cyanobacterium. Microbial Cell Factories. 12 (1), 1-8 (2013).
  5. Vavitsas, K., et al. Responses of Synechocystis sp. PCC 6803 to heterologous biosynthetic pathways. Microbial Cell Factories. 16, 140 (2017).
  6. Yang, G., et al. Photosynthetic production of sunscreen shinorine using an engineered cyanobacterium. ACS Synthetic Biology. 7 (2), 664-671 (2018).
  7. Nielsen, A. Z., et al. Extending the biosynthetic repertoires of cyanobacteria and chloroplasts. Plant Journal. 87 (1), 87-102 (2016).
  8. Nielsen, J., Keasling, J. D. Engineering cellular metabolism. Cell. 164 (6), 1185-1197 (2016).
  9. Stensjö, K., Vavitsas, K., Tyystjärvi, T. Harnessing transcription for bioproduction in cyanobacteria. Physiologia Plantarum. 162 (2), 148-155 (2018).
  10. Santos-Merino, M., Singh, A. K., Ducat, D. C. New applications of synthetic biology tools for cyanobacterial metabolic engineering. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 7, 1-24 (2019).
  11. Lea-Smith, D. J., Vasudevan, R., Howe, C. J. Generation of marked and markerless mutants in model cyanobacterial species. Journal of Visualized Experiments. 111, e54001 (2016).
  12. Vasudevan, R., et al. CyanoGate: A modular cloning suite for engineering cyanobacteria based on the plant MoClo syntax. Plant Physiology. 180 (1), 39-55 (2019).
  13. Andreou, A. I., Nakayama, N. Mobius assembly: A versatile golden-gate framework towards universal DNA assembly. PLoS ONE. 13 (1), 1-18 (2018).
  14. Crozet, P., et al. Birth of a Photosynthetic Chassis: A MoClo toolkit enabling synthetic biology in the microalga Chlamydomonas reinhardtii. ACS Synthetic Biology. 7 (9), 2074-2086 (2018).
  15. Engler, C., et al. A Golden Gate modular cloning toolbox for plants. ACS Synthetic Biology. 3 (11), 839-843 (2014).
  16. Moore, S. J., et al. EcoFlex: A multifunctional MoClo kit for E. coli synthetic biology. ACS Synthetic Biology. 5 (10), 1059-1069 (2016).
  17. Pollak, B., et al. Loop assembly: a simple and open system for recursive fabrication of DNA circuits. New Phytologist. 222 (1), 628-640 (2019).
  18. Werner, S., Engler, C., Weber, E., Gruetzner, R., Marillonnet, S. Fast track assembly of multigene constructs using golden gate cloning and the MoClo system. Bioengineered Bugs. 3 (1), 38-43 (2012).
  19. Patron, N. J., et al. Standards for plant synthetic biology: a common syntax for exchange of DNA parts. New Phytologist. 208 (1), 13-19 (2015).
  20. Chao, R., Mishra, S., Si, T., Zhao, H. Engineering biological systems using automated biofoundries. Metabolic Engineering. 42, 98-108 (2017).
  21. Chambers, S., Kitney, R., Freemont, P. The Foundry: the DNA synthesis and construction Foundry at Imperial College. Biochemical Society Transactions. 44 (3), 687-688 (2016).
  22. Gibson, D. G., et al. Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases. Nature Methods. 6 (5), 343-345 (2009).
  23. Rosano, G. L., Ceccarelli, E. A. Rare codon content affects the solubility of recombinant proteins in a codon bias-adjusted Escherichia coli strain. Microbial Cell Factories. 8, 1-9 (2009).
  24. Cambray, G., et al. Measurement and modeling of intrinsic transcription terminators. Nucleic Acids Research. 41 (9), 5139-5148 (2013).
  25. Chen, Y. J., et al. Characterization of 582 natural and synthetic terminators and quantification of their design constraints. Nature Methods. 10 (7), 659-664 (2013).
  26. Münch, R., et al. Virtual Footprint and PRODORIC: An integrative framework for regulon prediction in prokaryotes. Bioinformatics. 21 (22), 4187-4189 (2005).
  27. Salis, H. M., Mirsky, E. A., Voigt, C. A. Automated design of synthetic ribosome binding sites to control protein expression. Nature Biotechnology. 27 (10), 946-950 (2009).
  28. Englund, E., Liang, F., Lindberg, P. Evaluation of promoters and ribosome binding sites for biotechnological applications in the unicellular cyanobacterium Synechocystis sp. PCC 6803. Scientific Reports. 6, 36640 (2016).
  29. Heidorn, T., et al. Synthetic biology in cyanobacteria engineering and analyzing novel functions. Methods in Enzymology. 497, 539-579 (2011).
  30. Thiel, K., et al. Translation efficiency of heterologous proteins is significantly affected by the genetic context of RBS sequences in engineered cyanobacterium Synechocystis sp. PCC 6803. Microbial Cell Factories. 17, 34 (2018).
  31. Liu, Q., Schumacher, J., Wan, X., Lou, C., Wang, B. Orthogonality and burdens of heterologous and gate gene circuits in E. coli. ACS Synthetic Biology. 7 (2), 553-564 (2018).
  32. Ferreira, E. A., et al. Expanding the toolbox for Synechocystis sp. PCC 6803: Validation of replicative vectors and characterization of a novel set of promoters. Synthetic Biology. (August), 1-39 (2018).
  33. Liang, F., Lindblad, P. Synechocystis PCC 6803 overexpressing RuBisCO grow faster with increased photosynthesis. Metabolic Engineering Communications. 4, 29-36 (2017).
  34. Taton, A., et al. Broad-host-range vector system for synthetic biology and biotechnology in cyanobacteria. Nucleic Acids Research. 42 (17), e136 (2014).
  35. Elhai, J., Wolk, C. P. Conjugal transfer of DNA to cyanobacteria. Methods in Enzymology. 167 (1984), 747-754 (1988).
  36. Gormley, E. P., Davies, J. Transfer of plasmid RSF1010 by conjugation from Escherichia coli to Streptomyces lividans and Mycobacterium smegmatis. Journal of Bacteriology. 173 (21), 6705-6708 (1991).
  37. Huang, H. H., Camsund, D., Lindblad, P., Heidorn, T. Design and characterization of molecular tools for a synthetic biology approach towards developing cyanobacterial biotechnology. Nucleic Acids Research. 38 (8), 2577-2593 (2010).
  38. Huang, H. H., Lindblad, P. Wide-dynamic-range promoters engineered for cyanobacteria. Journal of Biological Engineering. 7, 10 (2013).
  39. Li, S., Sun, T., Xu, C., Chen, L., Zhang, W. Development and optimization of genetic toolboxes for a fast-growing cyanobacterium Synechococcus elongatus UTEX 2973. Metabolic Engineering. 48, 163-174 (2018).
  40. Pansegrau, W., Balzer, D., Kruft, V., Lurz, R., Lanka, E. In vitro assembly of relaxosomes at the transfer origin of plasmid RP4. Proceedings of the National Academy of Sciences, USA. 87 (17), 6555-6559 (1990).
  41. Song, K., Tan, X., Liang, Y., Lu, X. The potential of Synechococcus elongatus UTEX 2973 for sugar feedstock production. Applied Microbiology and Biotechnology. 100 (18), 7865-7875 (2016).
  42. Waters, V. L., Guiney, D. G. Processes at the nick region link conjugation, T-DNA transfer and rolling circle replication. Molecular Microbiology. 9 (6), 1123-1130 (1993).
  43. Elhai, J., Vepritskiy, A., Muro-Pastor, A. M., Flores, E., Wolk, C. P. Reduction of conjugal transfer efficiency by three restriction activities of Anabaena sp. strain PCC 7120. Journal of Bacteriology. 179 (6), 1998-2005 (1997).
  44. Silva-Rocha, R., et al. The Standard European Vector Architecture (SEVA): A coherent platform for the analysis and deployment of complex prokaryotic phenotypes. Nucleic Acids Research. 41 (D1), D666-D675 (2013).
  45. Mandakovic, D., et al. CyDiv, a conserved and novel filamentous cyanobacterial cell division protein involved in septum localization. Frontiers in Microbiology. 7 (FEB), 1-11 (2016).
  46. Masukawa, H., Inoue, K., Sakurai, H., Wolk, C. P., Hausinger, R. P. Site-directed mutagenesis of the Anabaena sp. strain PCC 7120 nitrogenase active site to increase photobiological hydrogen production. Applied and Environmental Microbiology. 76 (20), 6741-6750 (2010).
  47. Yu, J., et al. Synechococcus elongatus UTEX 2973, a fast growing cyanobacterial chassis for biosynthesis using light and CO2. Scientific Reports. 5 (1), 8132 (2015).
  48. Ungerer, J., Wendt, K. E., Hendry, J. I., Maranas, C. D., Pakrasi, H. B. Comparative genomics reveals the molecular determinants of rapid growth of the cyanobacterium Synechococcus elongatus UTEX 2973. Proceedings of the National Academy of Sciences, USA. 115 (50), E11761-E11770 (2018).
  49. Lepesteur, M., Martin, J. M., Fleury, A. A comparative study of different preservation methods for phytoplankton cell analysis by flow cytometry. Marine Ecology Progress Series. 93 (1-2), 55-63 (1993).
  50. Day, J. G. Cryopreservation of cyanobacteria. Cyanobacteria: An Economic perspective. , 319-327 (2014).
  51. Zhou, J., et al. Discovery of a super-strong promoter enables efficient production of heterologous proteins in cyanobacteria. Scientific Reports. 4, 4500 (2014).
  52. Potapov, V., et al. Comprehensive profiling of four base overhang ligation fidelity by T4 DNA ligase and application to DNA assembly. ACS Synthetic Biology. 7 (11), 2665-2674 (2018).
  53. Ravindran, C. R. M., Suguna, S., Shanmugasundaram, S. Electroporation as a tool to transfer the plasmid pRL489 in Oscillatoria MKU 277. Journal of Microbiological Methods. 66, 174-176 (2006).
  54. Stevenson, K., McVey, A. F., Clark, I. B. N., Swain, P. S., Pilizota, T. General calibration of microbial growth in microplate readers. Scientific Reports. 6, 38828 (2016).
  55. Maecker, H. T., Trotter, J. Flow cytometry controls, instrument setup, and the determination of positivity. Cytometry Part A. 69 (9), 1037-1042 (2006).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

152synech sti sp 6803Synech 2973

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved