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Resumen

Aquí, presentamos un protocolo que describe cómo i) ensamblar un vector autorreplicante usando el kit de herramientas de clonación modular CyanoGate, ii) introducir el vector en un host cianobacteriano por conjugación, y iii) caracterizar las cepas de cianobacterias transgénicas usando un lector de placas o citometría de flujo.

Resumen

Las cianobacterias son un grupo diverso de organismos fotosintéticos procariotas que pueden ser modificados genéticamente para la producción renovable de productos industriales útiles. Los recientes avances en biología sintética han llevado al desarrollo de varios kits de herramientas de clonación como CyanoGate, un sistema de clonación modular estandarizado para la construcción de vectores de plásmidos para su posterior transformación o transferencia conyugal a cianobacterias. Aquí delineamos un método detallado para ensamblar un vector autorreplicante (por ejemplo, llevar un casete de expresión de marcador fluorescente) y la transferencia conyugal del vector en las cepas cianobacterianas Synechocystis sp. PCC 6803 o Synechococcus elongatus UTEX 2973. Además, describimos cómo caracterizar el rendimiento de una pieza genética (por ejemplo, un promotor) utilizando un lector de placas o citometría de flujo.

Introducción

Las cianobacterias son bacterias autotróficas que se pueden utilizar para la biosíntesis de una amplia variedad de productos metabólicos naturales y heterológicos de alto valor1,2,3,4,5, 6. Todavía es necesario superar varios obstáculos para ampliar su viabilidad comercial, sobre todo, los rendimientos relativamente pobres en comparación con las bioplataformas heterotróficas (por ejemplo, Escherichia coli y levadura)7. La reciente expansión de las herramientas de ingeniería genética disponibles y la asunción del paradigma de la biología sintética en la investigación cianobacteriana está ayudando a superar tales desafíos y a desarrollar más cianobacterias como biofábricas eficientes8, 9,10.

Los principales enfoques para introducir el ADN en las cianobacterias son la transformación, la conjugación y la electroporación. Los vectores transferidos a las cianobacterias por transformación o electroporación son vectores "suicidas" (es decir, vectores integradores que facilitan la recombinación homóloga), mientras que los vectores autorreplicantes pueden transferirse a cianobacterias por transformación, conjugación o electroporación. Para el primero, un protocolo está disponible para las especies de modelos de ingeniería susceptibles a la transformación natural11. Más recientemente, se ha desarrollado un kit de herramientas de clonación modular (MoClo) para cianobacterias llamado CyanoGate que emplea un método de ensamblaje vectorial Golden Gate estandarizado para la ingeniería utilizando la transformación natural, electroporación o conjugación12.

Las técnicas de montaje tipo Golden Gate se han vuelto cada vez más populares en los últimos años, y los estándares de montaje y las bibliotecas de piezas están ahora disponibles para una variedad de organismos13,14,15,16 ,17. Golden Gate utiliza enzimas de restricción IIS de tipo (por ejemplo, BsaI, BpiI, BsmBI, BtgZI y AarI) y un traje de aceptadores y voladizos únicos para facilitar el montaje jerárquico direccional de múltiples secuencias en una reacción de montaje "una olla". Las enzimas de restricción de tipo IIS reconocen una secuencia asimétrica única y cortan una distancia definida de sus sitios de reconocimiento para generar un corte escalonado y "final pegajoso" (normalmente un voladizo de 4 nucleótidos [NT]), que puede ser explotado posteriormente para impulsar el ADN ordenado reacciones de montaje15,18. Esto ha facilitado el desarrollo de grandes bibliotecas de piezas modulares de nivel 0 (por ejemplo, promotores, marcos de lectura abiertos y terminadores) definidas por una sintaxis común, como el estándar PhytoBricks19. Las piezas de nivel 0 se pueden ensamblar fácilmente en casetes de expresión de nivel 1, tras lo cual se pueden construir ensamblajes de orden superior más complejos (por ejemplo, construcciones de expresión multigénea) en un vector aceptador de elección12,15. Una ventaja clave de las técnicas de montaje tipo Golden Gate es su capacidad para la automatización en instalaciones de alto rendimiento, como las fundiciones de ADN20,21, que pueden permitir la prueba de diseños experimentales complejos que fácilmente mediante el trabajo manual.

CyanoGate se basa en el sistema establecido Plant MoClo12,15. Para incorporar una nueva pieza en CyanoGate, la secuencia de la pieza debe ser domesticada primero, es decir, los sitios de reconocimiento "ilegales" para BSaI y BpiI deben ser eliminados. En el caso de una codificación de pieza para un marco de lectura abierto (es decir, una secuencia de codificación, CDS), los sitios de reconocimiento pueden verse interrumpidos mediante la generación de mutaciones sinónimos en la secuencia (es decir, cambiar un codón a una alternativa que codifica para el mismo residuo de aminoácidos). Esto se puede lograr mediante una variedad de enfoques, que van desde la síntesis de ADN hasta estrategias basadas en la amplificación de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) como el ensamblaje de Gibson22. Dependiendo de la expresión que se utilice el host, se debe tener cuidado de evitar la introducción de codones raros que podrían inhibir la eficiencia de la traducción23. La eliminación de sitios de reconocimiento en secuencias de promotor y terminador suele ser un esfuerzo más arriesgado, ya que las modificaciones pueden afectar a la función y la parte podría no funcionar como se esperaba. Por ejemplo, los cambios en los sitios de unión del factor de transcripción putativa o en el sitio de unión ribosoma dentro de un promotor podrían alterar la fuerza y la capacidad de respuesta a la inducción/represión. Del mismo modo, las modificaciones a las características estructurales clave del terminador (por ejemplo, el tallo rico en GC, el bucle y la cola poli-U) pueden cambiar la eficiencia de terminación y afectar la expresión génica24,25. Aunque hay varios recursos en línea disponibles para predecir la actividad de las secuencias de promotor es y terminador, e informar si una mutación propuesta afectará el rendimiento26,27, estas herramientas son a menudo malos predictores de rendimiento en cianobacterias28,29,30.. Como tal, todavía se recomienda la caracterización in vivo de las piezas modificadas para confirmar la actividad. Para ayudar con la clonación de secuencias recalcitrantes, CyanoGate incluye un vector de aceptación de clonación de copia baja basado en el vector bioBrick pSB4K512,16,31. Además, un portal "Diseño y construcción" está disponible a través de la Fundición del Genoma de Edimburgo para ayudar con el diseño de vectores (dab.genomefoundry.org). Por último, y lo más importante, CyanoGate incluye dos diseños vectoriales de aceptación de nivel T (equivalentes a vectores de aceptación de nivel 2)15 para introducir ADN en cianobacterias utilizando vectores suicidas, o vectores de amplio alcance de host capaces de autorreplicación en varias especies cianobacterianas32,33,34.

Aquí nos centraremos en describir un protocolo para generar vectores autorreplicantes de nivel T y la modificación genética de Synechocystis PCC 6803 y Synechococcus elongatus UTEX 2973 (Synechocystis PCC 6803 y S. elongatus UTEX 2973 en adelante) por conjugación (también conocida como apareamiento triparental). La transferencia conyugal del ADN entre células bacterianas es un proceso bien descrito y se ha utilizado previamente para la ingeniería de especies cianobacterianas, en particular aquellas que no son naturalmente competentes, como S. elongatus UTEX 297335, 36,37,38,39,40,41. En resumen, los cultivos cianobacterianos se incuban con una cepa de E. coli que transporta el vector a transferir (el vector "carga") y vectores (ya sea en la misma cepa de E. coli o en cepas adicionales) para permitir la conjugación ("movilizador" y vectores "ayudantes"). Se requieren cuatro condiciones clave para que se produzca la transferencia conyugal: 1) contacto directo entre las células implicadas en la transferencia de ADN, 2) el vector de carga debe ser compatible con el sistema de conjugación (es decir, debe contener un origen adecuado de transferencia (oriT), también conocido como un sitio bom (base de movilidad),), 3) una proteína de negación del ADN (por ejemplo, codificada por el gen de la mafia) que nicks DNA en el oriT para iniciar la transferencia de una sola cadena del ADN en la cianobacterium debe estar presente y expresado de la carga o de los vectores auxiliares, y 4) el ADN transferido no debe destruirse en el ciabacterium receptor (es decir, debe ser resistente a la degradación, por ejemplo, la actividad de endonucleasa de restricción)35,42. Para que el vector de carga persista, el origen de la replicación debe ser compatible con el cianobacterium receptor para permitir la autorreplicación y la proliferación en células hijas después de la división. Para ayudar con las condiciones 3 y 4, varios vectores auxiliares están disponibles a través de Addgene y otras fuentes comerciales que codifican para la mafia, así como varias metilosas para proteger de endonucleasas nativas en el host cianobacterium43. En este protocolo, la conjugación fue facilitada por una cepa MC1061 E. coli que transportaba movilizadores y vectores auxiliares pRK24 (www.addgeneorg/51950) y pRL528 (www.addgene.org/58495), respectivamente. Se debe tener cuidado al elegir los vectores que se utilizarán para la transferencia conyugal. Por ejemplo, en el kit CyanoGate el vector de carga autorreplicante pPMQAK1-T codifica para una proteína Mob12. Sin embargo, pSEVA421-T no44, y como tal, la mafia debe expresarse desde un vector auxiliar adecuado. Los vectores utilizados también deben ser apropiados para el organismo objetivo. Por ejemplo, la transferencia conyugal eficiente en Anabaena sp. PCC 7120 requiere un vector auxiliar que proteja el vector movilizador contra la digestión (por ejemplo, pRL623, que codifica para las tres metiluas AvaiM, Eco47iiM y Ecot22iM)45, 46.

En este protocolo se describe además cómo caracterizar el rendimiento de las piezas (es decir, promotores) con un marcador fluorescente utilizando un lector de placas o un citómetro de flujo. Los citómetros de flujo son capaces de medir la fluorescencia en una sola célula para una población grande. Además, los citometros de flujo permiten a los usuarios "gatear" los datos adquiridos y eliminar el ruido de fondo (por ejemplo, de partículas en el cultivo o la contaminación). Por el contrario, los lectores de placas adquieren una medición de fluorescencia agregada de un volumen determinado de cultivo, normalmente en varios pozos de réplica. Las principales ventajas de los lectores de placas sobre los citometros incluyen el menor costo, mayor disponibilidad y, por lo general, ningún requisito de software especializado para análisis de datos aguas abajo. Los principales inconvenientes de los lectores de placas son la sensibilidad relativamente menor en comparación con los citometros y los posibles problemas con la densidad óptica de los cultivos medidos. Para los análisis comparativos, las muestras del lector de placas deben normalizarse para cada pocal (por ejemplo, para una medición de la densidad de cultivo, que normalmente se toma como absorbancia en la densidad óptica a 750 nm [OD750]), lo que puede dar lugar a imprecisiones para las muestras que son demasiado densa y/o no bien mezclada (por ejemplo, cuando es propensa a la agregación o a la floculación).

Como resumen, aquí demostramos en detalle los principios de generación de piezas de nivel 0, seguidos por el ensamblaje jerárquico utilizando el kit CyanoGate y la clonación en un vector adecuado para la transferencia conyugal. A continuación, demostramos el proceso de transferencia conyugal, la selección de cepas transconjugantes axenicas que expresan un marcador fluorescente y la posterior adquisición de datos de fluorescencia utilizando un citómetro de flujo o un lector de placas.

Protocolo

1. Ensamblaje vectorial utilizando los kits de herramientas Plant MoClo y CyanoGate

NOTA: Antes de proceder con el montaje vectorial, se recomienda encarecidamente que los usuarios se familiaricen con las estructuras de nivel vectorial de los sistemas Plant y CyanoGate MoClo12,15.

  1. Construcción de piezas de nivel 0
    NOTA: Las piezas de nivel 0 se pueden sintetizar como vectores completos o como secuencias lineales para el ensamblaje con aceptadores de nivel 0 (por ejemplo, gBlocks, IDT). Alternativamente, las secuencias se pueden amplificar a partir de una plantilla de origen (por ejemplo, un VECTOR o ADN genómico purificado). Aquí, se describe cómo generar una nueva parte de nivel 0 a partir de un producto amplificado. Se muestra una visión general del proceso de ensamblaje de Golden Gate desde el nivel 0 hasta el nivel TFigura 1.
    1. Diseña las imprimaciones.
      1. Decida qué módulo de Nivel 0 ensamblar e identificar los voladizos apropiados de 5o y 3o(Tabla 1)12,15. Compruebe la secuencia de ADN para clonar para detectar la presencia de sitios de restricción bipI o BsaI.
        NOTA: Una secuencia que contiene uno de estos sitios debe domesticarse modificando uno o más NT en la secuencia del sitio de restricción. En la Figura 2se describe una estrategia para hacer esto mediante el ensamblaje de Golden Gate.
      2. Para amplificar una secuencia de ADN, diseñe un par de imprimación hacia adelante y hacia atrás apropiado. Para la imprimación delantera, seleccione 18 a 30 bp complementario al extremo de 5o de la secuencia de la plantilla de ADN. Para la imprimación inversa, seleccione 18 x 30 bp de conexión inversa complementaria al extremo de 3o de la secuencia de la plantilla de ADN.
        NOTA: Los imprimadores con temperaturas de fusión (Tm) de 58 a 62 oC suelen dar los resultados de amplificación más consistentes(Figura 1A).
      3. Agregue lo siguiente al extremo de 5o de la imprimación delantera: 1) una cadena aleatoria de 4 x 6 NTs en el extremo de 5o del sitio bpiI, 2) el sitio de restricción de BpiI (GAAGAC), 3) dos NTs aleatorios y 4) el voladizo de 5o seleccionado en el paso 1.1.1.1. Agregue lo siguiente al extremo de 5o de la imprimación inversa: 1) una cadena aleatoria de 4 x 6 NTs en el extremo de 5o del sitio bpiI, 2) el sitio de restricción de BpiI (GAAGAC), 3) dos NTs aleatorios y 4) el voladizo de 3o seleccionado en el paso 1.1.1.1. Cuando esté terminado, pida los pares de imprimación.
        NOTA: Consulte la Figura 1A para ver un ejemplo de un par de imprimación hacia delante y hacia atrás.
    2. Amplificar una secuencia de ADN a partir de ADN genómico.
      1. Extraiga el ADN genómico como se describe en la sección 5. Amplificar los productos por PCR utilizando una polimerasa de ADN de alta fidelidad(Tabla de Materiales).
        NOTA: Como ejemplo, configure las reacciones de PCR (20 a 50 l) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Utilice 100 ng de ADN genómico por reacción. Utilizar un programa de ciclo térmico que consista en un paso inicial de desnaturalización de 98oC para 30s, seguido de no más de 25 ciclos de desnaturalización a 98oC durante 10 s, recocido de imprimación a 58oC para 15s y extensión del producto a 72oC para 30 s (modificar este último en función de la tamaño del producto/tipo de ADN polimerasa utilizado), seguido de un paso de extensión final de 72 oC durante 2 min.
      2. Si el producto PCR va a ser purificado en gel, ejecute toda la reacción de PCR en un gel de agarosa como se describe en la sección 6. Cortar la banda de interés del gel de agarosa y purificarlo usando un kit de extracción de gel(Tabla de Materiales).
      3. Alternativa al paso 1.1.2.2, si el producto PCR se va a utilizar sin purificación de gel, verifique el tamaño de la banda ejecutando una alícuota de la muestra de reacción de PCR (-5 l) en un gel de agarosa. Si el gel muestra sólo la banda apropiada y ninguna evidencia de dimers de imprimación, purificar el producto PCR utilizando un kit de purificación de ADN(Tabla de materiales).
      4. Eluir el ADN purificado en un pequeño volumen de agua desionizada (p. ej., 10 l) para obtener una alta concentración de ADN (>20 ng / L es típicamente suficiente).
    3. Ensamble el producto de ADN amplificado (o productos, consulte la Figura 2)en el nivel 0. Prepare una mezcla de reacción de 20 l con BpiI(figura 1B)y configure el programa de ciclor térmico como se describe en la Tabla 2. Proceda a la transformación de E. coli utilizando 5 l de la mezcla de reacción de nivel 0 montada (como se describe en la sección 2).
  2. Construcción de montajes de Nivel 1
    1. Decida qué piezas de nivel 0 ensamblar(Figura 1C y Tabla 1). Elija un vector de aceptación de nivel 1 apropiado15.
      NOTA: En esta etapa es importante saber cuál será el diseño vectorial final en el nivel T, ya que esto afectará a la elección del vector aceptador de nivel 1. El vector de aceptación de nivel 1 (adelante) (pICH47732) se puede utilizar como valor predeterminado si el objetivo es tener un único conjunto de nivel 1 (por ejemplo, un casete de expresión génica) en el nivel T. Sin embargo, si se van a ensamblar dos o más ensamblajes de nivel 1 en el nivel T, se debe tener en cuenta la posición y la dirección de cada ensamblaje de nivel 1. Se pueden ensamblar hasta siete conjuntos de nivel 1 en un vector de aceptación de nivel T utilizando vectores de aceptación de nivel 1 con las posiciones adecuadas12.
    2. Ensamble las piezas de nivel 0 en el nivel 1. Preparar una mezcla de reacción de 20 l con BsaI y configurar el programa de ciclor térmico como se describe en la Tabla 2. Proceda a la transformación de E. coli utilizando 5 l de la mezcla de reacción de nivel 1 montada (como se describe en la sección 2).
  3. Construcción de conjuntos de Nivel T
    1. Decida qué ensamblados de nivel 1 ensamblar(Figura 1D). Elija un vector de aceptación de nivel T adecuado.
      NOTA: pUC19A-T (resistencia a la ampicilina) y pUC19S-T (resistencia a la espectinomicina) son vectores integradores de alto número de copia que no son capaces de replicarse en cianobacterias y se utilizan principalmente para la integración genómica (es decir, knock-in o knock-out de genes) a través de genes) a través de genes) a través de recombinación homóloga12. La entrega de vectores integrativos puede proceder por transformación natural en la especie cianobacteriana amenable11. pPMQAK1-T es un amplio rango de host, vector replicativo que se entrega mediante transferencia conyugal (sección 3).
    2. Elija un enlace final adecuado para ligar el extremo de 3o del ensamblaje final de nivel 1 a la columna vertebral de nivel T15.
      NOTA: El enlace final requerido es el mismo número que la posición de la pieza final. Por ejemplo, un vector de nivel T con una sola posición de nivel 1 (hacia adelante o hacia atrás) parte requerirá End-Link 1 (pICH50872) para la ligadura en la columna vertebral de nivel T.
    3. Montar uno o más conjuntos de nivel 1 en el nivel T. Preparar una mezcla de reacción con BpiI y el vector End-Link requerido y configurar el programa de ciclor térmico como se describe en la Tabla 2. Proceda a la transformación de E. coli utilizando 5 l de la mezcla de reacción de nivel T montada (como se describe en la sección 2).

2. Transformación de E. coli y purificación vectorial

  1. Transformación de E. coli (día 1)
    1. Descongelar una alícuota (25 l) de células de E. coli químicamente competentes(Tabla de materiales)y pipetear suavemente en un tubo de 1,5 ml sobre hielo. Añadir 5 s de la mezcla de montaje (Nivel 0, 1 o T) e incubar el tubo sobre hielo durante otros 30 x 60 min.
    2. Células de choque térmico incubando el tubo en un baño de agua a 42 oC durante 30 s, luego coloque el tubo de nuevo en hielo durante 2 minutos. Añadir caldo súper óptimo a temperatura ambiente (RT) con represión catabolizada (S.O.C.) medio (250 sL) al tubo. Incubar el tubo a 37oC durante 1 h a 225 rpm en una incubadora de agitación.
    3. Placa 40 l del cultivo en una placa de agar LB que contenga la concentración final adecuada de antibióticos (100 g/ml para dihidrocloruro de espectromicina pentahidrato [Nivel 0], 100 g/ml de carbenicilina disódico [Nivel 1], o 50 g/ml de sulfato de kanacina pentacina [ Nivel T]), 1 mM isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside (IPTG) y 40 g/ml de 5-bromo-4-cloro-3-indolyl--D-galactopyranoside (X-Gal) para cribado azul-blanco. Incubar la placa durante la noche a 37oC.
      NOTA: La cantidad de cultivo chapado puede variar dependiendo de la eficiencia de las células competentes de E. coli y la reacción de ligadura. Placa un volumen mayor si se observan colonias <10 después de la incubación durante la noche.
  2. Selección de colonias blancas y preparación de cultivos líquidos (día 2)
    NOTA: Dependiendo de las eficiencias de la reacción de montaje y posterior transformación, las placas de agar LB pueden no contener colonias, colonias azules o colonias blancas(Figura 3). Las colonias azules son indicativas de vectores acceptores que no han sufrido restricciones (es decir, todavía hay una copia funcional de lacZ). Las colonias blancas indican que el casete de expresión lacZ se ha perdido y reemplazado por una pieza/ensamblaje.
    1. Opcionalmente, valide que las colonias blancas contienen el vector esperado realizando la PCR como se describe en la sección 7.
    2. Escoja colonias blancas únicas (o colonias verificadas por PCR) con una punta de 10 l y transfiera a un tubo centrífugo de 15 ml que contenga un medio de LB (5 ml) y concentraciones de antibióticos adecuadas (paso 2.1.3). Incubar los tubos a 37oC durante la noche a 225 rpm en una incubadora de agitación.
  3. Purificación vectorial plásmido (día 3)
    1. Opcionalmente, prepare un stock de glicerol del cultivo nocturno de E. coli para el crioalmacenamiento a largo plazo de vectores. Añadir 500 ml de cultivo bacteriano a 500 ml de glicerol al 50% (v/v) en un tubo apropiado de 1,5 x 2,0 ml para crioalmacenamiento a -80 oC. Mezcle suavemente invirtiendo 5 x 10x. Muestras de congelación de flash en nitrógeno líquido y almacenar en un congelador de -80 oC.
    2. Espíre cultivos en tubos centrífugos de 15 ml a 3.000 x g durante 5 x 10 minutos. Deseche el sobrenadante sin molestar el pellet celular. Purificar el vector utilizando un kit de purificación de plásmido (Tabla de Materiales). Eluda el vector purificado en 35 ml de agua desionizada.
      NOTA: Utilice volúmenes de elución más bajos para aumentar aún más la concentración vectorial. El mismo eluyente se puede poner a través de una columna de purificación dos veces para aumentar los rendimientos.
    3. Mida la concentración del vector en el eluyán utilizando un espectrofotómetro (Tabla de materiales).
      NOTA: Los vectores de alto número de copia en E. coli, como pUC19, suelen dar rendimientos de 50 a 300 ng/L. Los vectores de número de copia bajo, como pPMQAK1-T, suelen dar rendimientos de 15 a 60 ng/L.
  4. Validación de vectores
    NOTA: Los vectores pueden ser verificados por la digestión de la restricción (paso 2.4.1) y/o la secuenciación (paso 2.4.2).
    1. Restringir 0,5 x 1 g de vector con una enzima(s) de restricción apropiada y verificar los tamaños de banda esperados como se describe en la sección 6 (Figura 4).
      NOTA: Los tamaños de banda incorrectos suelen indicar un ensamblaje erróneo, en cuyo caso se pueden examinar más colonias blancas o repetir el ensamblaje. BsaI y BpiI se pueden utilizar para validar el tamaño correcto de la plaquita para los ensamblajes de nivel 0 y nivel 1, respectivamente. BSaI o BpiI se puede utilizar junto con una enzima de restricción adicional y compatible que corta dentro de la plaquita y/o la columna vertebral vectorial para producir un conjunto distinto de bandas bien separadas después de la digestión.
    2. Secuenciar el vector mediante la secuenciación de Sanger utilizando una imprimación apropiada aguas arriba de la región ensamblada utilizando la instalación de secuenciación comercial (Tabla 3).
      NOTA: Todas las nuevas partes de nivel 0 deben secuenciarse para confirmar la identidad de secuencia esperada. La validación de secuencia de vectores de nivel 1 y T no suele ser necesaria si se ensambla a partir de piezas de nivel 0 secuenciadas anteriormente.

3. Generación de mutantes por conjugación

NOTA: Aquí, se describe un protocolo para la transferencia conyugal de un vector de carga autorreplicante a Synechocystis PCC 6803 o S. elongatus UTEX 297311,47. Este protocolo es aplicable a otras especies modelo (por ejemplo, S. elongatus PCC 7942 y Synechococcus sp. PCC 7002). Todo el trabajo con cianobacterias (y preparaciones tampón asociadas) debe realizarse en condiciones estériles en una campana de flujo laminar.

  1. Crecimiento del cultivo cianobacteriano (día 1)
    1. Prepare el medio BG11 según Lea-Smith et al.11, y las placas de agar con LB-BG11 y BG11+Kan50 (sección 8).
    2. Establecer un nuevo cultivo de Synechocystis PCC 6803 o S. elongatus UTEX 2973 inoculando un matraz cónico de 100 ml de medio BG11 fresco (50 ml) con células procedentes de una placa de agar axenic BG11. Cultivar cultivos de Synechocystis PCC 6803 a 30 oC, 100 m-2s-1 a 100 rpm y crecer S. elongatus UTEX 2973 a 40 oC, 300 oMmol de fotones m-2s-1 a 100 rpm. Cultivar cultivos hasta laD.O. 750 a 0,5 x 1,5 (normalmente de 1 a 2 días).
      NOTA: Los cultivos de S. elongatus UTEX 2973 se pueden cultivar a 40oC en altas intensidades de luz (p. ej., fotones de 2000 mol m-2s-1)48.
  2. Crecimiento de cepas de ayuda y carga E. coli (día 2)
    1. Inocular el medio LB que contiene ampicilina (concentración final 100 g/ml) y cloranfenicol (concentración final 25 g/ml) con una cepa MC1061 E. coli que contiene vectores pRK24 y pRL528 (es decir, la cepa auxiliar) y crecen a 37 oC durante la noche a 225 rpm en una incubadora temblorosa. Crecer un volumen suficiente de cultivo de cepa auxiliar, suponiendo que se requiere 1 ml de cultivo por conjugación.
    2. Inocular el medio LB (5 ml) que contiene antibióticos apropiados con el cultivo de E. coli que transporta el vector de carga (es decir, un vector de nivel T). Cultivar el cultivo a 37 oC durante la noche a 225 rpm en una incubadora de agitación.
  3. Transferencia conyugal (apareamiento triparental) (día 3)
    1. Preparar el ayudante de E. coli y las cepas de carga. Centrifugar el ayudante y la carga E. coli cultivos nocturnos a 3.000 x g durante 10 min a temperatura ambiente. Deseche el sobrenadante sin molestar el pellet celular.
    2. Lave el pellet añadiendo un medio fresco de LB sin antibióticos. Utilice el mismo volumen que la referencia cultural inicial. Resuspende el pellet pipeteando suavemente hacia arriba y hacia abajo. No vórtice la cultura. Repita este paso 3x para eliminar los antibióticos residuales del cultivo nocturno.
    3. Centrifugar el cultivo resuspendido (como en el paso 3.3.1), desechar el sobrenadante y resuspender a la mitad el volumen del medio LB del volumen de cultivo inicial (por ejemplo, 2,5 ml si el cultivo nocturno era de 5 ml). Combinar 450 l de la cepa auxiliar con 450 l de la tensión de carga en un tubo de 2 ml y reservar (dejar en RT) hasta el paso 3.3.6.
    4. Preparar el cultivo cianobacteriano. Para cada reacción de conjugación, utilice 1 ml de cultivo cianobacteriano (OD750 x 0,5 x 1,5).
    5. Centrifugar el volumen total requerido de cultivo cianobacteriano a 1.500 x g durante 10 minutos en RT, luego deseche el sobrenadante cuidadosamente sin perturbar el pellet celular. Lave el pellet añadiendo un medio BG11 fresco del mismo volumen inicial. Resuspender el pellet pipeteando suavemente hacia arriba y hacia abajo, no vórtice la cultura. Repita este paso 3x y deje a un lado el cultivo lavado.
    6. Añadir una alícuota de cultivo cianobacteria lavado (900 l) a las cepas combinadas de E. coli (ayudante y carga) (900 l) en un tubo de 2 ml. Mezcle los cultivos pipeteando suavemente hacia arriba y hacia abajo. No vórtice. Incubar la mezcla a RT durante 30 min para Synechocystis PCC 6803 o 2 h para S. elongatus UTEX 2973.
    7. Centrifugar la mezcla a 1.500 x g durante 10 min a RT. Retire 1,6 ml del sobrenadante. Resuspenda el gránulo en el resto de 200 s de sobrenadante. Coloque un filtro de membrana de 0,45 m en una placa de agar LB-BG11 que carezca de antibióticos (sección 8). Esparza cuidadosamente 200 l de la mezcla de cultivo de E. coli/cianobacterial en la membrana con un esparcidor estéril o una punta estéril doblada y sella la placa con película de parafina.
    8. Incubar la placa LB-BG11 con la membrana durante 24 h. Mantener las membranas con cultivos Synechocystis PCC 6803 a 30 oC, 100 fotons de mol m-2s-1. Mantener las membranas con cultivos S. elongatus UTEX 2973 a 40oC en fotones de 150 omol m-2s-1.
  4. Transferencia de membrana
    1. Después de 24 h, transfiera cuidadosamente la membrana utilizando fórceps esterilizados por llama a una nueva placa de agar BG11 que contenga antibióticos apropiados (sección 8) para seleccionar el vector de carga. Selle el plato con película de parafina.
    2. Incubar la placa de agar BG11 en condiciones de crecimiento adecuadas, como se describió anteriormente para Synechocystis PCC 6803 o S. elongatus UTEX 2973, hasta que aparezcan las colonias.
      NOTA: Las colonias suelen aparecer después de 7 a 14 días para Synechocystis PCC 6803 y 3 a 7 días para S. elongatus UTEX 2973.
  5. Selección de conjugantes
    NOTA: Sólo las colonias cianobacterianas que transporten el vector de carga podrán crecer en la membrana(Figura 5).
    1. Usando un lazo estéril térmico, seleccione al menos dos colonias individuales de la membrana y la raya en una nueva placa de agar BG11 que contenga antibióticos apropiados(Figura 5C).
      NOTA: Las colonias recién rayadas todavía pueden estar contaminadas con E. coli transportada por conjugación (es decir, si las pequeñas colonias blancas son evidentes en el plato), por lo que dos o tres rondas adicionales de re-streaking en placas de agar BG11 frescas son típicamente para obtener un cultivo cianobacteriaico axenés.
    2. Confirmar la ausencia de contaminación por E. coli inoculando una raya de cultivo cianobacteriano en un tubo centrífugo de 15 ml que contiene 5 ml de medio de LB e incubando a 37 oC durante la noche a 225 rpm en una incubadora de temblores. Después de un período de crecimiento suficiente (7 días), elija colonias axenicas individuales para establecer cultivos líquidos para crioalmacenamiento a largo plazo o experimentación posterior.
  6. Crioalmacenamiento de cepas cianobacterianas
    1. Cultivar un cultivo líquido cianobacteriano en BG11 (como se describe en la sección 3.1) hasta laD.O. 750 a 1,5 x 3,0. Centrífuga 10 ml de cultivo durante 10 min a 1.500 x g,retire el sobrenadante y vuelva a suspender las células en 5 ml de medio BG11 fresco.
    2. Añadir 3,5 ml de autoclave esterilizado 50% (v/v) glicerol para una concentración final de glicerol de 20% (v/v)49. Este enfoque funciona bien para Synechocystis PCC 6803. Alternativamente, añada 5 ml de filtro esterilizado BG11 que contenga 16% (v/v) dimetilsulfóxido (DMSO) para una concentración final de DMSO de 8% (v/v)50. Este enfoque se recomienda para la mayoría de las cepas, incluyendo S. elongatus UTEX 2973.
      ADVERTENCIA: DMSO es tóxico y debe manipularse con la protección adecuada.
    3. Mezcle suavemente invirtiendo 5 x 10x. Subaliquot 1 ml de cultivo en tubos de tapa de tornillo de 1,5 ml compatibles con crioalmacenamiento separados (Tabla de materiales). Coloque los tubos en un congelador de -80 oC para crioalmacenamiento. No congele con flash en nitrógeno líquido.
      NOTA: Se recomiendan al menos tres existencias por deformación unitaria.
    4. Para la recuperación, retire un tubo del congelador de -80 oC y descongele el cultivo en un baño de agua de 35 oC mientras se mezcla suavemente. Añadir el cultivo deswed a 50 mL de medio BG11 fresco y crecer como un cultivo líquido (como se describe en la sección 3.1).
      NOTA: Alternativamente, la cultura se puede rayar y cultivar en una placa de agar BG11 fresca. Los cultivos transgénicos que llevan marcadores de selección deben revivirse inicialmente en placas de agar BG11 sin antibióticos y luego volver a esgrafiar las placas de agar BG11 con antibióticos apropiados.

4. Caracterización del promotor

NOTA: Aquí se describe un enfoque estándar para analizar la fuerza de una parte promotora midiendo los niveles de expresión de un marcador fluorescente (eYFP) después de un período de crecimiento de 72 h utilizando un lector de placas o un citómetro de flujo12.

  1. Crecimiento de la cultura
    1. Establecer cultivos de semillas inoculando 10 ml de medio BG11 que contiene antibióticos apropiados con una sola colonia de la cepa cianobacteriana transgénica que lleva el casete de expresión del marcador fluorescente. También preparar cultivos de semillas para cepas de control negativas apropiadas (por ejemplo, una cepa de tipo salvaje y/o una cepa transgénica que lleve la misma columna vertebral vectorial pero que carezca del casete de expresión del marcador fluorescente).
      NOTA: Se recomiendan al menos cuatro réplicas biológicas.
    2. Cultivar los cultivos de semillas durante 48 h o hasta laD.O. 750 a 1,5 en condiciones de crecimiento adecuadas para la cepa de la especie.
    3. Para realizar un seguimiento de la expresión del promotor a lo largo del tiempo, mida primero el OD750 de cada cultivo de semillas. Calcule los requisitos de dilución para llevar cada cultivo a un OD a partir de750 o 0,2 a partir de la salida de aire a partir de la fecha. Configurar muestras de cultivo experimental diluidas (2 ml de volumen total) en una placa de fondo plano de 24 pocillos(Tabla de materiales).
    4. Incubar la placa en una incubadora de agitación con luces LED blancas(Tabla de Materiales)en condiciones de crecimiento adecuadas. Mida la densidad de crecimiento del cultivo (OD750)y la fluorescencia mejorada de la proteína fluorescente amarilla (eYFP) utilizando un lector de placas (sección 4.2) o un citómetro de flujo (sección 4.3).
      NOTA: Las culturas Synechocystis PCC 6803 y S. elongatus UTEX 2973 se pueden cultivar como en el paso 3.1.2. Se recomienda encarecidamente que la placa se mantenga bajo una alta humedad (95%) para evitar la evaporación de las muestras de cultivo.
  2. Lector de placas
    1. Mezclar brevemente los cultivos en la placa de 24 pocillos (paso 4.1.4) con pipeteo suave. Transfiera una submuestra de cada cultivo a una placa negra de fondo plano de 96pocillos (Tabla de materiales). Diluir si es necesario (volumen final de 100 l). Evite la formación de burbujas, ya que esto puede interferir con la precisión de la medición.
      NOTA: Se recomienda que todas las mediciones se realicen en muestras en un rango de750 OD de 0,2 a 1,0. Como la densidad de los cultivos en el pozo 24 aumentará con el tiempo, se recomiendan las siguientes diluciones sobre la base de los aumentos esperados en las condiciones de crecimiento estándar: sin dilución a 0 h, 1:4 a 24 h, 1:10 a 48 h y 1:10 a 72 h. Así, por ejemplo, a 24 h cosecha 25 éL de cultivo y mezclar con 75 éL de medio BG11.
    2. Incluya dos pozos en blanco en la placa de 96 pocillos (es decir, 100 ml de medio BG11). Coloque la placa de 96 pocillos en un lector de placas(Tabla de materiales). Agitar la placa durante 60 s a 500 rpm utilizando el agitador orbital en el lector de placas para mezclar los pozos.
      NOTA: Los cultivos cianobacterianos pueden agregar y/o flocular, por lo que una buena mezcla es fundamental antes de leer para mediciones precisas.
    3. Mida la fluorescencia OD750 y eYFP con longitudes de onda de excitación/emisión a 485 nm/520 nm.
    4. Restar el promedio de las mediciones OD750 de los dos pozos en blanco de la medición OD750 de cada pozo de muestra que contiene el cultivo de cianobacterias.
    5. Normalice los valores de fluorescencia de cada muestra de cultivo dividiendo la medición de fluorescencia eYFP (paso 4.2.3) por la DoS750 ajustada del cultivo (paso 4.2.4). A continuación, reste el valor medio normalizado de fluorescencia eYFP (fluorescencia eYFP/OD750) de las réplicas biológicas de una cepa de control negativa adecuada de las cepas transgénicas que llevan el casete de expresión eYFP.
      NOTA: Las cianobacterias son naturalmente fluoradas debido a la presencia de pigmentos, como clorofila y ficobiliproteínas.
    6. Crecimiento del cultivo de la parcela a lo largo del tiempo(Figura 6A)y los valores medios normalizados de fluorescencia eYFP de cada cultivo experimental en los momentos deseados (por ejemplo, 72 h; Figura 6B).
  3. Caquímetro de flujo
    1. Elija una placa compatible para el sistema de manipulación de líquidos del catómetro de flujo. Por ejemplo, utilice una placa de 96 pocillos de fondo redondo(Tabla de materiales)con el catómetro de flujo(Tabla de materiales)utilizado en este protocolo.
    2. Mezclar brevemente los cultivos en la placa de 24 pocillos (paso 4.1.4) con pipeteo suave. Diluir los cultivos aOD 750 a 0,1 x 0,2 para evitar bloqueos de boquillas en el sistema de manipulación de líquidos. Agregue un volumen adecuado de la muestra de cultivo a la placa de 96 pocillos y lleve a un volumen final de 250 l con solución salina con búfer de fosfato (PBS) esterilizada por filtro 1x con fosfato. Incluya un pozo en blanco para la solución media en la placa que contenga 60 ml de BG11 y 190 l de 1x PBS.
      NOTA: Este volumen se recomienda en caso de que sea necesario volver a ejecutar muestras. No se recomiendan volúmenes superiores a 250 l, ya que el volumen máximo de cada pozo es de 300 ml.
    3. Una vez que el catómetro de flujo esté listo para su uso, coloque la placa de 96 pocillos con muestras de cultivo en la estación de manipulación de líquidos. Configure el protocolo de software para que el catómetro de flujo recopile las mediciones de 10.000 eventos individuales (por ejemplo, celdas). Mida la fluorescencia eYFP con longitudes de onda de excitación/emisión de 488 nm/515-545 nm. Primero mida y compruebe la lectura del pozo en blanco(Figura 7A) y, a continuación, ejecute las muestras.
    4. Atraviesa la población de células de cianobacterias dentro de los conjuntos de datos de dispersión hacia adelante y lateral, excluyendo las regiones comunes con la lectura en blanco(Figura 7B). Restar los valores medios de fluorescencia eYFP de las réplicas biológicas de una cepa de control negativa adecuada de las cepas transgénicas que llevan el casete de expresión eYFP(Figura 7C,D). Trazar el promedio de los valores medios de fluorescencia por célula para cada cultivo experimental en los puntos de tiempo deseados (por ejemplo, 72 h; Figura 7E).

5. Extracción de ADN genómico de cianobacterias

NOTA: El siguiente protocolo utiliza un kit de extracción de ADN comercial(Tabla de materiales).

  1. Cultivar un cultivo líquido cianobacteriano en BG11 (como se describe en la sección 3.1) hasta laD.O. 750 a 1,5 x 3,0. Gire hacia abajo 10 mL de cultivo a 3.000 x g durante 10 min y deseche el sobrenadante. Congele el pellet incubando los tubos a -20 oC durante 30 min.
  2. Añadir 400 l de tampón de lisis (buffer AP1) y 400 l de solución ribonucleasa (RNase A), y 50% (p/v) de perlas de vidrio (0,5 mm de diámetro). Interrumpa las muestras utilizando un molino de perlas(Tabla de materiales)a 30 Hz (es decir, equivalente a 1.800 oscilaciones/min) durante 6 min.
  3. Gire la muestra a 17.000 x g durante 5 min y transfiera cuidadosamente el sobrenadante a un tubo nuevo y deseche el pellet. Proceda de acuerdo con las instrucciones del fabricante(Tabla de materiales).

6. Electroforesis de gel de agarosa

  1. Lanzar un gel de agarosa del 1% (p/v) que contenga un bromuro de etidio al 0,02% (v/v). Cargue muestras y una referencia de escalera de ADN apropiada.
  2. Ejecute las muestras durante 50 minutos a 125 V. Compruebe la separación de la banda en un transiluminador ultravioleta (UV).
    NOTA: El tiempo de funcionamiento y el porcentaje de gel de agarosa se pueden modificar para adaptarse al tamaño de banda esperado. Por ejemplo, un mayor porcentaje de gel de agarosa y un tiempo de funcionamiento más largo pueden mejorar la resolución de la banda y la separación de los productos de ADN <500 bp.

7. PCR de colonia

  1. Configure una mezcla de reacción PCR utilizando un kit estándar(Tabla de materiales) y una combinación adecuada de imprimaciones (por ejemplo, imprimaciones que flanqueen la región de ensamblaje o sean específicas de secuencias dentro de la región de ensamblaje (Tabla 3). Pipetear 10 l en un tubo PCR.
  2. Toque suavemente la parte superior de una colonia blanca con un palillo estéril o una punta de pipeta de 10 ml e inocular un tubo PCR que contenga una mezcla de reacción de PCR. Tenga cuidado de marcar la colonia y coincidir con el tubo PCR específico. Revuelva suavemente la mezcla de reacción para asegurarse de que las células de E. coli se arrojen en la solución.
  3. Amplificar los productos por PCR. Utilice un programa que consista en un paso inicial de desnaturalización de 95 oC para 60 s, 30 rondas de 95 oC para 15 s, 58 oC para 15 s (pocos grados por debajo de los valoresT m de las imprimaciones), 72 oC para 30 s (30 s/kb de inserción) , seguido de un paso de extensión final de 72 oC durante 5 min.

8. Preparación de medios BG11 y placas

  1. Preparar soluciones de stock de 100x BG11 medio, hierro (citrato férrico de amonio), oligoelementos, fosfato (K2HPO4), Na2CO3 y tampón TES según Lea-Smith et al.11. Autoclave fosfato y Na2CO3 stocks. Utilice filtros de 0,2 m para filtrar la esterilización del búfer TES (pH 8.2) y las soluciones de stock de NaHCO3.
  2. Preparar 1 L de medio BG11. Mezclar 10 ml de 100x BG11, 1 mL de oligoelementos y 1 ml de stock de hierro y autoclave la solución con 976 ml de agua. Una vez que la solución se haya enfriado a RT, añadir 1 ml de stock de fosfato, 1 ml de stock de Na2CO3 y 10 ml de NaHCO3,y ajustar a pH 7,6 x 7,8 con 1 M HCl.
  3. Placas de agar LB-BG11 (1,5% [p/v])
    1. Combinar 700 ml de agua desionizada y 15 g de agar en un matraz de vidrio. En un segundo matraz, añadir 186 ml de agua, 10 ml de 100x BG11, 1 ml de oligoelementos y 1 ml de material de hierro. Autoclave ambas soluciones.
    2. Una vez que las soluciones se hayan enfriado a alrededor de 60 oC, combínalas y añade 1 ml de stock de fosfato, 1 ml de stock de Na2CO3, 10 ml de stock naHCO 3 y 50 ml de medio estéril LB, que debe dar un volumen final de 1 L. Debutar platos Petri con 25 55 mL de stock NaHCO3 y 50 ml de medio estéril LB, que debe dar un volumen final de 1 L. Cast Petri platos con 25 55 mL de medio de agar LB-BG11.
  4. Placas de agar BG11+Kan50 (1,5% [w/v])
    1. Combinar 700 ml de agua desionizada y 15 g de agar en un matraz de vidrio. En un segundo matraz, añadir 3 g de tiosulfato sódico (Na2S2O3), 226 ml de agua, 10 ml de 100x BG11, 1 ml de oligoelementos y 1 ml de material de hierro. Autoclave ambas soluciones.
    2. Una vez que las soluciones se hayan enfriado a alrededor de 60 oC, combínelas y añada 1 ml de stock de fosfato, 1 ml de stock de Na2CO3, 10 ml de stock tampón TES y 10 ml de stock de NaHCO3, que debe dar un volumen final de 1 L. Añadir sulfato de kanamicina a una concentración final de 50 g/ml y moldear platos de Petri con 35 ml de medio.

Resultados

Para demostrar el flujo de trabajo del ensamblaje de Golden Gate, se ensambló un casete de expresión en el vector de aceptación de nivel 1 posición 1 (adelante) (pICH47732) que contiene las siguientes partes de nivel 0: el promotor de la operon C-ficasetina Pcpc560 (pC0.005), la secuencia de codificación para eYFP (pC0.008) y el doble terminador TrrnB (pC0.082)12. Tras la transformación de la reacción de montaje, se id...

Discusión

El ensamblaje de Golden Gate tiene varias ventajas en comparación con otros métodos de ensamblaje vectorial, particularmente en términos de escalabilidad20,21. Sin embargo, la configuración del sistema Golden Gate en un laboratorio requiere tiempo para desarrollar una familiaridad con las diversas partes y bibliotecas vectoriales de aceptación y procesos generales de montaje. A menudo se necesita una planificación cuidadosa para ensamblajes más complejos o...

Divulgaciones

Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

Los autores agradecen el apoyo financiero a la Red PHYCONET Biotechnology and Biological Sciences Research Council (BBSRC) en Biotecnología Industrial y Bioenergía (NIBB) y al Centro de Innovación en Biotecnología Industrial (IBioIC) por su apoyo financiero. GARG, AASO y AP reconocen el apoyo financiero del programa de doctorado BBSRC EASTBIO CASE (número de subvención BB/M010996/1), el programa de doctorado del Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (CONACYT) y el programa de doctorado de la Asociación de Formación Colaborativa IBioIC-BBSRC (CTP), Respectivamente. Agradecemos a Conrad Mullineaux (Universidad Reina María de Londres), y poul Eric Jensen y Julie Annemarie Zita Zedler (Universidad de Copenhague) por las contribuciones y consejos de vectores y protocolos de plásmidos.

Materiales

NameCompanyCatalog NumberComments
5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside (X-Gal)Thermo Fisher ScientificR0404Used in 2.1.3.
Adenosine 5′-triphosphate (ATP) disodium saltSigma-AldrichA2383Used in Table 2.
Agar (microbiology tested)Sigma-AldrichA1296-500gUsed in 8.3.
AgaroseBiolineBIO-41026Used in 6.
Attune NxT Flow CytometerThermo Fisher Scientific-Used in 4.3.1.
Bovine Serum Albumin (BSA)Sigma-AldrichA2153Used in Table 2.
BpiI (BbsI)Thermo Fisher ScientificER1011Used in Table 2.
BsaI (Eco31I)Thermo Fisher ScientificER0291Used in Table 2.
Carbenicillin disodiumVWR InternationalA1491.0005Used in 2.1.3.
Corning Costar TC-Treated flat-bottom 24 well platesSigma-AldrichCLS3527Used in 4.1.3.
Dimethyl Sulfoxide (DMSO)Thermo Fisher ScientificBP231-100Used in 3.6.2.
DNeasy Plant Mini KitQiagen69104DNA extraction kit. Used in 5.
FLUOstar Omega Microplate readerBMG Labtech-Used in 4.2.2.
GeneJET Plasmid Miniprep KitThermo Fisher ScientificK0503Plasmid purification kit. Used in step 2.3.2.
Glass beads (0.5 mm diameter)BioSpec Products11079105Used in 5.2.
GlycerolThermo Fisher Scientific10021083Used in 2.3.1, 3.6.2.
Isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside (IPTG)Thermo Fisher Scientific10356553Used in 2.1.3.
Kanamycin sulphate (Gibco)Thermo Fisher Scientific11815-024Used in 2.1.3.
Membrane filters (0.45 μm)MF-MilliporeHAWP02500Used in 3.3.7
Microplates, 96-well, flat-bottom (Chimney Well) µCLEARGreiner Bio-One655096Used in 4.2.1.
Monarch DNA Gel Extraction KitNew England BiolabsT1020SUsed in 1.1.2.2.
Monarch PCR DNA Cleanup KitNew England BiolabsT1030DNA purification kit. Used in 1.1.2.3.
Multitron Pro incubator with LEDsInfors HT-Shaking incubator with white LED lights. Used in 4.1.4.
MyTaq DNA PolymeraseBiolineBIO-21108Used in 7.1.
NanoDrop OneThermo Fisher ScientificND-ONE-WUsed in 2.3.3.
One Shot TOP10 chemically competent E. coliThermo Fisher ScientificC404010Used in 2.1.1.
Phosphate buffer saline (PBS) solution (10X concentrate)VWR InternationalK813Used in 4.3.2.
Q5High-Fidelity DNA PolymeraseNew England BiolabsM0491SUsed in 1.1.2.1.
Quick-Load 1 kb DNA LadderNew England BiolabsN0468SUsed in Figure 4.
Screw-cap tubes (1.5 ml)Starstedt72.692.210Used in 3.6.3
Spectinomycin dihydrochloride pentahydrateVWR InternationalJ61820.06Used in 2.1.3.
Sterilin Clear Microtiter round-bottom 96-well platesThermo Fisher Scientific612U96Used in 4.3.1.
T4 DNA ligaseThermo Fisher ScientificEL0011Used in Table 2.
TissueLyser IIQiagen85300Bead mill. Used in 5.2.

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