Modificação genética de cianobactérias por conjugação usando o kit de ferramentas de clonagem modular CyanoGate

Resumo

Aqui, apresentamos um protocolo descrevendo como i) montar um vetor auto-replicante usando o kit de ferramentas de clonagem modular CyanoGate, ii) introduzir o vetor em um hospedeiro cianobacteriano por conjugação, e iii) caracterizar cepas transgênicas de cianobactérias usando um leitor de placa ou citometria de fluxo.

Resumo

Cianobactérias são um grupo diversificado de organismos fotosintéticos procarióticos que podem ser geneticamente modificados para a produção renovável de commodities industriais úteis. Os avanços recentes na biologia sintética conduziram ao desenvolvimento de diversos toolkits da clonagem tais como CyanoGate, um sistema modular estandardizado da clonagem para construir vectors plasmid para a transformação subseqüente ou transferência conjugal em cianobacteria. Aqui descrevemos um método detalhado para a montagem de um vetor auto-replicante (por exemplo, carregando uma fita de expressão marcador fluorescente) e transferência conjugal do vetor para as cepas cianobacterianas Synechocystis sp. PCC 6803 ou Synechococcus Elongatus UTEX 2973. Além disso, descrevemos como caracterizar o desempenho de uma parte genética (por exemplo, um promotor) usando um leitor de placa ou citometria de fluxo.

Introdução

Cianobactérias são bactérias autotróficas que podem ser usadas para a biossíntese de uma grande variedade de produtos metabólicos naturais e heterologous de alto valor^{1,2,3,4,5, 6.} Vários obstáculos ainda precisam ser superados para expandir sua viabilidade comercial, mais notavelmente, os rendimentos relativamente pobres em comparação com as bioplataformas heterotróficas (por exemplo, Escherichia coli e levedura)⁷. A recente expansão das ferramentas de engenharia genética disponíveis e a adoção do paradigma da biologia sintética na pesquisa cianobacteriana estão ajudando a superar tais desafios e desenvolver ainda mais as cianobactérias como biofábricas eficientes^{8, 9,10.}

As principais abordagens para a introdução do DNA em cianobactérias são transformação, conjugação e eletroporação. Os vetores transferidos para cianobactérias por transformação ou eletroporação são vetores "suicidas" (ou seja, vetores integrativos que facilitam a recombinação homóloga), enquanto vetores auto-replicantes podem ser transferidos para cianobactérias por transformação, conjugação ou eletroporação. Para o primeiro, um protocolo está disponível para a engenharia de espécies modelo passível de transformação natural¹¹. Mais recentemente, um kit de ferramentas modular de clonagem (MoClo) para cianobactérias chamado CyanoGate foi desenvolvido que emprega um método padronizado de montagem de vetores Golden Gate para engenharia usando transformação natural, eletroporação ou conjugação¹².

Golden Gate-tipo técnicas de montagem tornaram-se cada vez mais popular nos últimos anos, e os padrões de montagem e bibliotecas parte estão agora disponíveis para uma variedade de organismos^{13,14,15,16 17}de^pessoas. Golden Gate usa enzimas de restrição iis tipo (por exemplo, BsaI, BpiI, BsmBI, BtgZI e AarI) e um terno de aceitadores e saliências únicas para facilitar a montagem hierárquica direcional de várias seqüências em uma reação de montagem de "um pote". Enzimas de restrição tipo IIS reconhecem uma seqüência assimétrica única e reduzem uma distância definida de seus locais de reconhecimento para gerar um corte escalonado de "extremidade pegajosa" (tipicamente uma saliência de 4 nucleotídeos [NT]), que pode ser posteriormente explorada para dirigir o DNA ordenado reações de montagem^15,18. Isso facilitou o desenvolvimento de grandes bibliotecas de peças modulares de nível 0 (por exemplo, promotores, quadros de leitura aberta e exterminadores) definidos por uma sintaxe comum, como o padrão PhytoBricks¹⁹. As peças de nível 0 podem então ser prontamente montadas em de expressão de nível 1, seguindo as quais conjuntos de ordem superior mais complexos (por exemplo, construções de expressão multigênica) podem ser construídos em um vetor de aceitação de escolha^12,15. Uma vantagem fundamental das técnicas de montagem do tipo Golden Gate é a sua comodidade à automação em instalações de alta produção, como fundições de DNA^20,21,que podem permitir o teste de projetos experimentais complexos que não pode ser facilmente alcançado por trabalho manual.

CyanoGate baseia-se no sistema moclo planta estabelecido^12,15. Para incorporar uma nova parte no CyanoGate, a sequência de parte deve primeiro ser domesticada, ou seja, sites de reconhecimento "ilegais" para BsaI e BpiI devem ser removidos. No caso de uma codificação de parte para um quadro de leitura aberta (ou seja, uma sequência de codificação, CDS), os sites de reconhecimento podem ser interrompidos gerando mutações sinônimos na sequência (ou seja, alterando um códon para uma alternativa que codifica para o mesmo resíduo de aminoácidos). Isso pode ser alcançado por uma variedade de abordagens, que vão desde a síntese de DNA até estratégias baseadas em amplificação de amplificação de polimerase (PCR), como a montagem^{Gibson 22.} Dependendo da expressão do hospedeiro que está sendo usada, o cuidado deve ser tomado para evitar a introdução de códons raros que poderiam inibir a eficiência da tradução^23. Remover sites de reconhecimento em sequências de promotores e exterminadores é tipicamente um esforço mais arriscado, pois as modificações podem afetar a função e a parte pode não funcionar como esperado. Por exemplo, as alterações aos locais de ligação ao fator de transcrição putativa ou ao site de ligação ribossoma dentro de um promotor podem alterar a força e a capacidade de resposta à indução/repressão. Da mesma forma, as modificações nas principais características estruturais do exterminador do futuro (por exemplo, o caule rico gc, loop e cauda poli-U) podem alterar a eficiência da terminação e afetar a expressão gênica^24,25. Embora vários recursos on-line estejam disponíveis para prever a atividade das sequências de promotores e exterminadores, e informem se uma mutação proposta afetará o desempenho^26,27,essas ferramentas são muitas vezes preditores pobres de desempenho em cianobactérias^28,29,30.. . Como tal, a caracterização in vivo de peças modificadas ainda é recomendada para confirmar a atividade. Para ajudar com a clonagem de seqüências recalcitrantes, CyanoGate inclui uma cópia baixa de clonagem vetor convidado com base no vetor BioBrick pSB4K5^12,16,31. Além disso, um portal "Design and Build" está disponível através da Fundição do Genoma de Edimburgo para ajudar com o design vetorial (dab.genomefoundry.org). Por último, e mais importante, CyanoGate inclui dois projetos de vetor de aceitação nível T (equivalente a vetores de aceitadores de nível 2)¹⁵ para a introdução de DNA em cianobactérias usando vetores de suicídio, ou vetores de alcance de hospedeiro amplo capaz de auto-replicação em várias espécies cianobacterianas^32,33,34.

Aqui vamos nos concentrar em descrever um protocolo para a geração de níveis T auto-replicantes vetores e a modificação genética de Synechocystis PCC 6803 e Synechococcus elongatus utex 2973 (Synechocystis PCC 6803 e S. elongatus UTEX 2973 depois disso) por conjugação (também conhecido como acasalamento triparental). A transferência conjugal de DNA entre células bacterianas é um processo bem descrito e tem sido usado anteriormente para a engenharia de espécies cianobacterianas, em particular aquelas que não são naturalmente competentes, como s. alongatus UTEX 2973^{35, 36,37,38,39,40,41.} Em resumo, as culturas cianobacterianas são incubadas com uma cepa De. coli carregando o vetor a ser transferido (o vetor de "carga") e vetores (seja na mesma cepa de E. coli ou em cepas adicionais) para permitir a conjugação ("mobilizador" e vetores de "ajudantes"). Quatro condições-chave são necessárias para a transferência conjugal ocorrer: 1) o contato direto entre as células envolvidas na transferência de DNA, 2) o vetor de carga deve ser compatível com o sistema de conjugação (ou seja, deve conter uma origem adequada de transferência (oriT), também conhecido como um bom (base de mobilidade) site), 3) uma proteína de corte de DNA (por exemplo, codificada pelo gene da máfia) que corta DNA no oriT para iniciar a transferência de dna para o cianobacterium deve estar presente e expressa de ambos os vetores de carga ou ajudante, e 4) o DNA transferido não deve ser destruído no receptor cyanobacterium (ou seja, deve ser resistente à degradação por, por exemplo, restrição atividade endosnuclease)^35,42. Para que o vetor de carga persista, a origem da replicação deve ser compatível com a ciaanobacterium receptora para permitir a auto-replicação e proliferação em células filhas pós divisão. Para ajudar com as condições 3 e 4, vários vetores auxiliares estão disponíveis através de Addgene e outras fontes comerciais que codificam para a máfia, bem como várias metilases para proteger de endonucleases nativas no host cyanobacterium⁴³. Neste protocolo, a conjugação foi facilitada por uma cepa MC1061 E. coli carregando mobilizadores e vetores auxiliares pRK24 (www.addgeneorg/51950) e pRL528 (www.addgene.org/58495), respectivamente. Deve ser tomado cuidado ao escolher os vetores para serem usados para transferência conjugal. Por exemplo, no kit CyanoGate o vetor de carga auto-replicante pPMQAK1-T codifica uma proteína Mob¹². No entanto, pSEVA421-T não^44,e, como tal, mob deve ser expressa a partir de um vetor ajudante adequado. Os vetores utilizados também devem ser apropriados para o organismo alvo. Por exemplo, a transferência conjugal eficiente em Anabaena sp. PCC 7120 requer um vetor auxiliar que proteja o vetor de mobilização contra a digestão (por exemplo, pRL623, que codifica as três metilases AvaiM, Eco47iiM e Ecot22iM)^{45, 46.}

Neste protocolo, descrevemos ainda mais como caracterizar o desempenho das peças (ou seja, promotores) com um marcador fluorescente usando um leitor de placa ou um citometro de fluxo. Os citometros de fluxo são capazes de medir a fluorescência em uma única base celular para uma grande população. Além disso, os citometros de fluxo permitem aos usuários "portar" os dados adquiridos e remover o ruído de fundo (por exemplo, de material particulado na cultura ou contaminação). Em contraste, os leitores de placas adquirem uma medida agregada de fluorescência de um determinado volume de cultura, normalmente em vários poços de replicar. As principais vantagens dos leitores de placas sobre os citometros incluem o menor custo, maior disponibilidade e, normalmente, nenhum requisito para software especializado para análises de dados a jusante. As principais desvantagens dos leitores de placas são a sensibilidade relativamente menor em comparação com citometros e problemas potenciais com a densidade óptica de culturas medidas. Para análises comparativas, as amostras do leitor de placas devem ser normalizadas para cada poço (por exemplo, para uma medição da densidade cultural, normalmente tomada como a absorção na densidade óptica em 750 nm [OD_750]),o que pode levar a imprecisões para amostras que são também denso e/ou não bem misturado (por exemplo, quando propenso à agregação ou flocculação).

Como uma visão geral, aqui demonstramos em detalhes os princípios de geração de peças de nível 0, seguido s uma montagem hierárquica usando o kit CyanoGate e clonagem em um vetor adequado para transferência conjugal. Em seguida, demonstramos o processo de transferência conjugal, a seleção de cepas transconjugantes axenic expressando um marcador fluorescente e a subsequente aquisição de dados de fluorescência usando um citometro de fluxo ou um leitor de placa.

Protocolo

1. Montagem vetorial usando os kits de ferramentas Plant MoClo e CyanoGate

NOTA: Antes de prosseguir com a montagem vetorial, recomenda-se fortemente que os usuários se familiarizem com as estruturas de nível vetorial dos sistemas Plant e CyanoGate MoClo^12,15.

1. Construção de peças de nível 0
   NOTA: As peças de nível 0 podem ser sintetizadas como vetores completos ou como sequências lineares para montagem com aceitadores de nível 0 (por exemplo, gBlocks, IDT). Alternativamente, as sequências podem ser amplificadas a partir de um modelo de origem (por exemplo, um vetor ou DNA genômico purificado). Aqui, como gerar uma nova parte de Nível 0 a partir de um produto amplificado é descrito. Uma visão geral do processo de montagem do Golden Gate do Nível 0 ao Nível T é mostradaFigura 1.
   1. Projete as cartilha.
      1. Decida qual módulo de nível 0 para montar e identificar os 5' e 3' saliências apropriados (Tabela 1)^12,15. Verifique a sequência de DNA para clonar para a presença de sites de restrição BpiI ou BsaI.
         NOTA: Uma sequência contendo um desses sites deve ser domesticada modificando um ou mais NTs na sequência do site de restrição. Uma estratégia para fazer isso usando a montagem golden gate é delineada na Figura 2.
      2. Para amplificar uma seqüência de DNA, projete um par de primer adequado para a frente e para trás. Para a cartilha para a frente, selecione 18-30 bp complementar ao final 5′ da seqüência de modelo de DNA. Para a cartilha reversa, selecione 18-30 bp reverso complementar ao final de 3′ da seqüência de modelo de DNA.
         NOTA: Primers com temperaturas de rerrocada (T_m)de 58-62 °C normalmente dão os resultados de amplificação mais consistentes(Figura 1A).
      3. Adicione o seguinte ao final 5 ′ da cartilha para a frente: 1) uma seqüência aleatória de 4-6 NTs no final 5 ′ do site BpiI, 2) o site de restrição BpiI (GAAGAC), 3) dois NTs aleatórios, e 4) o excesso 5 ′ selecionados na etapa 1.1.1.1. Adicione o seguinte ao final 5′ da cartilha reversa: 1) uma seqüência aleatória de 4-6 NTs no final 5′ do site BpiI, 2) o site de restrição BpiI (GAAGAC), 3) dois NTs aleatórios, e 4) o excesso de 3′ selecionado na etapa 1.1.1.1.1. Quando finalizado, peça os pares primer.
         NOTA: Veja a Figura 1A para um exemplo de um par primer para a frente e reversa.
   2. Amplificar uma sequência de DNA do DNA genômico.
      1. Extraia DNA genômico como descrito na seção 5. Amplifique os produtos por PCR usando uma polimererase de DNA de alta fidelidade(Tabela de Materiais).
         NOTA: Como exemplo, configure reações de PCR (20 a 50 μL) de acordo com as instruções do fabricante. Use ~ 100 ng de DNA genômico por reação. Use um programa de ciclismo térmico composto por uma etapa inicial de desnaturação de 98 °C para 30 s, seguido por não mais de 25 ciclos de desnaturação a 98 °C para 10 s, primer annealing em 58 °C para 15 s e extensão de produto em 72 °C para 30 s (modificar o último, dependendo do tamanho do produto/tipo de polimererase de DNA utilizado), seguido por uma etapa de extensão final de 72 °C para 2 min.
      2. Se o produto PCR deve ser purificado em gel, execute toda a reação do PCR em um gel agarose, conforme descrito na seção 6. Corte a faixa de interesse fora do gel agarose e purifique-o usando um kit de extração de gel(Mesa de Materiais).
      3. Alternativa ao passo 1.1.2.2, se o produto PCR deve ser usado sem purificação de gel, verifique o tamanho da banda executando um alibamento da amostra de reação pcr (~5 μL) em um gel de agarose. Se o gel mostra apenas a banda apropriada e nenhuma evidência de dimers primer, purificar o produto PCR usando um kit de purificação de DNA(Tabela de Materiais).
      4. DNA purificado de elute em um pequeno volume de água desionizada (por exemplo, 10 μL) para obter uma alta concentração de DNA (>20 ng/μL é tipicamente suficiente).
   3. Monte o produto de DNA amplificado (ou produtos, consultea Figura 2 ) no Nível 0. Prepare uma mistura de reação de 20 μL com bpii (figura 1B)e configure o programa de cicloter térmico, conforme descrito na Tabela 2. Proceda à transformação de E. coli usando 5 μL da mistura montada da reação do nível 0 (como descrito na seção 2).
2. Construção de montagens de nível 1
   1. Decida quais peças de nível 0 para montar(Figura 1C e Tabela 1). Escolha um vetor de aceitação de nível 1 apropriado¹⁵.
      NOTA: Nesta fase, é importante saber qual será o design vetorial final no Nível T, pois isso afetará a escolha do vetor de aceitação de nível 1. Nível 1 posição 1 (Forward) vetor de aceitação (pICH47732) pode ser usado como padrão se o objetivo é ter uma única montagem de nível 1 (por exemplo, uma fita de expressão gênica) no Nível T. No entanto, para que duas ou mais montagens de nível 1 sejam montadas no Nível T, a posição e a direção de cada montagem de nível 1 devem ser consideradas. Até sete montagens de nível 1 podem ser montadas em um vetor de aceitação de nível T usando vetores de aceitadores de nível 1 com posições apropriadas^12.
   2. Monte as peças de nível 0 no Nível 1. Prepare uma mistura de reação de 20 μL com bsai e configurar o programa de ciclor térmico, como descrito na tabela 2. Proceda à transformação de E. coli usando 5 μL da mistura montada da reação do nível 1 (como descrito na seção 2).
3. Construção de montagens de nível T
   1. Decida quais montagens de nível 1 para montar(Figura 1D). Escolha um vetor de aceitação de nível T apropriado.
      NOTA: pUC19A-T (resistência à ampicilina) e pUC19S-T (resistência à espectromicina) são vetores integrativos de alto número de cópia que não são capazes de replicar em cianobactérias e são usados principalmente para integração genômica (ou seja, knock-in ou knock-out de genes) via recombinação homóloga¹². A entrega de vetores integrativos pode prosseguir por transformação natural em espécies cianobacterianas passíveis^11. pPMQAK1-T é uma ampla gama de hospedeiros, vetor replicativo que é entregue por transferência conjugal (seção 3).
   2. Escolha um Link Final apropriado para ligar o final de 3′ da montagem final do Nível 1 à espinha dorsal nível T^15.
      NOTA: O Link Final necessário é o mesmo número que a posição da parte final. Por exemplo, um vetor de nível T com apenas uma parte de nível 1 de posição 1 (para a frente ou para trás) exigirá end-Link 1 (pICH50872) para ligação na espinha dorsal do Nível T.
   3. Monte uma ou mais montagens de nível 1 no Nível T. Prepare uma mistura de reação com o BpiI e o vetor de End-Link necessário e configure o programa de cicloter térmico, conforme descrito na Tabela 2. Proceda à transformação de E. coli usando 5 μL da mistura montada da reação do nível T (como descrito na seção 2).

2. E. coli transformação e purificação vetorial

1. E. coli transformação (dia 1)
   1. Defrost um alibado (~25 μL) de células quimicamente competentes de E. coli (Tabela de Materiais)e delicadamente pipeta em um tubo de 1,5 mL no gelo. Adicione 5 μL da mistura de montagem (Nível 0, 1 ou T) e incubar o tubo no gelo por mais 30-60 min.
   2. Células de choque térmico, incubando o tubo em um banho de água a 42 °C para 30 s, em seguida, coloque o tubo de volta no gelo por 2 min. Adicione a temperatura ambiente (RT) super caldo ideal com repressão catabolite (S.O.C.) médio (250 μL) para o tubo. Incubar o tubo a 37 °C por 1 h a 225 rpm em uma incubadora tremendo.
   3. Placa 40 μL da cultura em uma placa de ágar LB contendo a concentração final apropriada de antibióticos (100 μg/mL para glidrirato de espectroclorde de espectrocloride de fetilina pentahidrato [Nível 0], 100 μg/mL de dissódio de carbenicina [Nível 1], ou 50 μg/mL de sulfato de kanamicina [ Nível T]), 1 mM isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside (IPTG) e 40 μg/mL de 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside (X-Gal) para triagem azul-branco. Incubar a placa durante a noite a 37 °C.
      NOTA: A quantidade de cultura banhada pode ser variada dependendo da eficiência das células competentes de E. coli e da reação de ligadura. Placa de um volume maior se <10 colônias são observadas após a incubação durante a noite.
2. Seleção de colônias brancas e preparação de culturas líquidas (dia 2)
   NOTA: Dependendo da eficiência da reação de montagem e da transformação subsequente, as placas de ágar LB podem não conter colônias, colônias azuis ou colônias brancas (Figura 3). Colônias azuis são indicativos de vetores aceitadores que não tenham sido submetidos a restrição (ou seja, uma cópia funcional do lacZ ainda está presente). Colônias brancas indicam que o de expressão lacZ foi perdido e substituído por uma peça/montagem.
   1. Opcionalmente, validar que as colônias brancas contêm o vetor esperado, realizando PCR como descrito na seção 7.
   2. Escolha colônias brancas únicas (ou colônias verificadas pcr) com uma ponta de 10 μL e transfira para um tubo de centrífuga de 15 mL contendo lb médio (5 mL) e concentrações de antibióticos apropriadas (passo 2.1.3). Incubar os tubos a 37 °C durante a noite às 225 rpm em uma incubadora tremendo.
3. Purificação do vetor de Plasmid (dia 3)
   1. Opcionalmente, prepare um estoque de glicerol da cultura E. coli durante a noite para crioarmazenamento a longo prazo de vetores. Adicione 500 μL de cultura bacteriana a 500 μL de 50% (v/v) glicerol em um tubo apropriado de 1,5 a 2,0 mL para crioarmazenamento a -80 °C. Misture suavemente, invertendo 5-10x. Amostras de congelamento flash em nitrogênio líquido e armazenar em um freezer -80 °C.
   2. Despine culturas em 15 tubos de centrífuga mL a 3.000 x g por 5 a 10 min. Descarte o supernatant sem perturbar a pelota celular. Purificar o vetor usando um kit de purificação plasmídeo(Mesa de Materiais). Vetor purificado elute em 35 μL de água desionizada.
      NOTA: Use volumes mais baixos de elução para aumentar ainda mais a concentração de vetores. O mesmo eluente pode ser colocado através de uma coluna de purificação duas vezes para o aumento dos rendimentos.
   3. Medir a concentração do vetor no eluent usando um espectrômetro(Tabela de Materiais).
      NOTA: Vetores de alto número de cópia em E. coli, como pUC19, normalmente dão rendimentos de 50 a 300 ng/μL. Vetores de baixo número de cópia, como pPMQAK1-T, normalmente dão rendimentos de 15 a 60 ng/μL.
4. Validação de vetor
   NOTA: Os vetores podem ser verificados por digestão de restrição (passo 2.4.1) e/ou sequenciamento (passo 2.4.2).
   1. Restringir 0,5-1 μg de vetor com uma enzima de restrição adequada (s) e verificar os tamanhos esperados da banda, conforme descrito na seção 6 (Figura 4).
      NOTA: Os tamanhos incorretos da faixa indicam tipicamente o conjunto errôneo, caso em que mais colônias brancas podem ser selecionadas ou o conjunto pode ser repetido. BsaI e BpiI podem ser usados para validar o tamanho correto da inserção para as montagens de nível 0 e nível 1, respectivamente. BsaI ou BpiI podem ser usados em conjunto com uma enzima de restrição adicional e compatível que corta dentro da inserção e/ou a espinha dorsal vetorial para produzir um conjunto distinto de bandas bem separadas após a digestão.
   2. Sequenciar o vetor por sequenciamento sanger usando uma cartilha apropriada a montante da região montada usando instalação de sequenciamento comercial(Tabela 3).
      NOTA: Todas as novas peças de Nível 0 devem ser sequenciadas para confirmar a identidade de sequência esperada. A validação de sequênciade de vetores de nível 1 e T normalmente não é necessária se montada a partir de peças de nível 0 previamente sequenciadas.

3. Geração de mutantes por conjugação

NOTA: Aqui, um protocolo para a transferência conjugal de um vetor de carga auto-replicante em Synechocystis PCC 6803 ou S. elongatus UTEX 2973^11,47 é descrito. Este protocolo é aplicável a outras espécies modelo (por exemplo, S. elongatus PCC 7942 e Synechococcus sp. PCC 7002). Todo o trabalho com cianobactérias (e preparações associadas do amortecedor) deve ser feito circunstâncias estéreis em uma capa de fluxo laminar.

1. Crescimento da cultura cianobacteriana (dia 1)
   1. Prepare bg11 médio de acordo com Lea-Smith et al.¹¹, e placas ágar com LB-BG11 e BG11+Kan50 (seção 8).
   2. Crie uma nova cultura de Synechocystis PCC 6803 ou S. elongatus UTEX 2973 inoculando um frasco cônico de 100 mL de bg11 médio fresco (50 mL) com células provenientes de uma placa de agar BG11 axenic. Crescer synechocystis PCC 6803 culturas a 30 °C, 100 μmol fótons m^-2s^-1 a 100 rpm e crescer S. elongatus UTEX 2973 em 40 °C, 300 μmol fótons m^-2s^-1 às 100 rpm. Crescer culturas até OD₇₅₀ = 0,5-1,5 (normalmente 1-2 dias).
      NOTA: S. alongatus UTEX 2973 culturas podem ser cultivadas a 40 °C em altas intensidades de luz (por exemplo, 2000 μmol fótons m^-2s^-1)⁴⁸.
2. Crescimento de cepas de ajuda e carga E. coli (dia 2)
   1. Inoculate LB médio contendo ampicilina (concentração final 100 μg/mL) e chloramphenicol (concentração final 25 μg/mL) com uma cepa MC1061 E. coli contendo vetores pRK24 e pRL528 (ou seja, a cepa de ajudante) e crescer a 37 °C durante a noite às 225 rpm em uma incubadora tremendo. Crescer um volume suficiente de cultura de tensão ajudante, assumindo 1 mL de cultura é necessária por conjugação.
   2. Inocular lb médio (5 mL) contendo antibióticos adequados com a cultura E. coli carregando o vetor de carga (ou seja, um vetor de nível T). Crescer a cultura a 37 °C durante a noite em 225 rpm em uma incubadora tremendo.
3. Transferência conjugal (acasalamento triparental) (dia 3)
   1. Prepare o ajudante e as tensões da carga de E. coli. Centrífuga o ajudante e a carga E. coli culturas durante a noite em 3.000 x g para 10 min à temperatura ambiente. Descarte o supernatant sem perturbar a pelota celular.
   2. Lave a pelota, adicionando fresco LB médio sem antibióticos. Use o mesmo volume que a cultura inicial. Resuspenda a pelota, suavemente tubulação para cima e para baixo. Não vórtice a cultura. Repita este passo 3x para remover antibióticos residuais da cultura durante a noite.
   3. Centrífuga a cultura resuspendida (como na etapa 3.3.1), descartar o supernatant e resuspender pela metade o volume de LB médio do volume de cultura inicial (por exemplo, 2,5 mL se a cultura durante a noite foi de 5 mL). Combine 450 μL da cepa auxiliar com 450 μL da cepa de carga em um tubo de 2 mL e reserve (sair em RT) até o passo 3.3.6.
   4. Prepare a cultura cianobacteriana. Para cada reação de conjugação, use 1 mL de cultura cianobacteriana (OD₇₅₀ = 0,5 a 1,5).
   5. Centrífuga o volume total exigido da cultura cianobacteriana em 1.500 x g por 10 min em RT, em seguida, descartar o supernatant cuidadosamente sem perturbar a pelota celular. Lave a pelota adicionando fresco BG11 médio do mesmo volume inicial. Resuspenda a pelota, atubulaçndo suavemente para cima e para baixo, não vórtice a cultura. Repita este passo 3x e definir a cultura lavada de lado.
   6. Adicione um alibamento da cultura cianobacteriana lavada (900 μL) às cepas combinadas de E. coli (ajudante e carga) (900 μL) em um tubo de 2 mL. Misture as culturas suavemente tubulação para cima e para baixo. Não vórtice. Incubar a mistura em RT por 30 min para Synechocystis PCC 6803 ou 2 h para S. elongatus UTEX 2973.
   7. Centrífuga a mistura em 1.500 x g por 10 min em RT. Remover 1,6 mL do supernatant. Resuspenda a pelota no restante ~200 μL de supernatant. Coloque um filtro de membrana de 0,45 μm em uma placa de ágar LB-BG11 sem antibióticos (seção 8). Espalhe cuidadosamente 200 μL da mistura de cultura E.coli/cyanobacteriana na membrana com um propagador estéril ou uma ponta dobrada estéril e selar a placa com filme de parafina.
   8. Incubar a placa LB-BG11 com a membrana por 24 h. Manter as membranas com culturas Synechocystis PCC 6803 a 30 °C, 100 fótons μmol m^-2s^-1. Manter as membranas com culturas S. alongatus UTEX 2973 a 40 °C em 150 fótons μmol m^-2s^-1.
4. Transferência de membrana
   1. Após 24 h, transfira cuidadosamente a membrana usando fórceps esterilizados por chama para uma placa de ágar BG11 fresca contendo antibióticos apropriados (seção 8) para selecionar para o vetor de carga. Selar a placa com filme de parafina.
   2. Incubar a placa de ágar BG11 condições de crescimento adequadas, como descrito acima para Synechocystis PCC 6803 ou S. elongatus UTEX 2973, até que as colônias apareçam.
      NOTA: Colônias geralmente aparecem após 7 a 14 dias para Synechocystis PCC 6803 e 3-7 dias para S. elongatus UTEX 2973.
5. Seleção de conjugantes
   NOTA: Apenas colônias cianobacterianas que transportam o vetor de carga poderão crescer na membrana(Figura 5).
   1. Usando um laço estéril do calor, selecione pelo menos duas colônias individuais da membrana e raia em uma placa nova da ágar BG11 que contem antibióticos apropriados (figura 5C).
      NOTA: Colônias recém-listradas ainda podem estar contaminadas com E. coli transportada de conjugação (ou seja, se pequenas colônias brancas são evidentes na placa), então duas ou três rodadas adicionais de re-estrias em placas de ágar BG11 frescos normalmente são necessário para obter uma cultura canobacteriana axenic.
   2. Confirme a ausência de contaminação por E. coli inoculando uma sequência de cultura cianobacteriana em um tubo de centrífuga de 15 mL contendo 5 mL de lb médio e incubação em 37 °C durante a noite em 225 rpm em uma incubadora tremendo. Após um período de crescimento suficiente (~7 dias), escolha colônias axenic individuais para setup culturas líquidas para o criostorage a longo prazo ou a experimentação subseqüente.
6. Crioarmazenamento de cepas cianobacterianas
   1. Crescer uma cultura líquida cianobacteriana em BG11 (como descrito na seção 3.1) até OD₇₅₀ = 1,5-3,0. Centrífuga 10 mL de cultura por 10 min a 1.500 x g, remover o supernatant e resuspender as células em 5 mL de fresco BG11 médio.
   2. Adicione 3,5 mL de autoclave esterilizado 50% (v/v) glicerol para uma concentração final de glicerol de ~ 20% (v/v)⁴⁹. Esta abordagem funciona bem para synechocystis PCC 6803. Alternativamente, adicione 5 mL de filtro esterilizado BG11 contendo 16% (v/v) dimetil sulfoxide (DMSO) para uma concentração final dmso de ~ 8% (v/ v)⁵⁰. Esta abordagem é recomendada para a maioria das cepas, incluindo S. elongatus UTEX 2973.
      CUIDADO: O DMSO é tóxico e deve ser tratado com proteção adequada.
   3. Misture suavemente, invertendo 5-10x. Subaliquot ~1 mL de cultura em tubos separados de crioarmazenamento compatível com 1,5 mL de parafuso -tampão (Tabela de Materiais). Coloque tubos em um freezer de -80 °C para crioarmazenamento. Não flash congelar em nitrogênio líquido.
      NOTA: Pelo menos três estoques por cepa são recomendados.
   4. Para a recuperação, retire um tubo do congelador -80 °C e descongele a cultura em um banho de água de 35 °C enquanto mistura suavemente. Adicione a cultura descongelada a 50 mL de bg11 fresco médio e crescer como uma cultura líquida (como descrito na seção 3.1).
      NOTA: Alternativamente, a cultura pode ser listrada e crescida em uma placa fresca da ágar BG11. Culturas transgênicas carregando marcadores de seleção devem ser revividas inicialmente em placas de ágar BG11 sem antibióticos e, em seguida, restreaked em placas de ágar BG11 com antibióticos apropriados.

4. Caracterização promotor

NOTA: Aqui uma abordagem padrão é descrita para analisar a força de uma parte promotor, medindo os níveis de expressão de um marcador fluorescente (eYFP) após um período de crescimento de 72 h usando um leitor de placa ou um citometro de fluxo¹².

1. Crescimento da cultura
   1. Configure culturas de sementes inoculando 10 mL de BG11 médio contendo antibióticos apropriados com uma única colônia da cepa cianobacteriana transgênica carregando o de expressão marcador fluorescente. Prepare também culturas da semente para tensões negativas apropriadas do controle (por exemplo, uma tensão selvagem do tipo e/ou uma tensão transgénica que carreg a mesma espinha dorsal do vetor mas faltando o fluorescente da expressão do marcador).
      NOTA: Pelo menos quatro réplicas biológicas são recomendadas.
   2. Crescer as culturas de sementes por 48 h ou até OD₇₅₀ = 1-1,5 em condições de crescimento adequadas para a cepa da espécie.
   3. Para acompanhar a expressão do promotor ao longo do tempo, primeiro medir o OD₇₅₀ de cada cultura de sementes. Calcule os requisitos de diluição para levar cada cultura a um OD inicial₇₅₀ = 0,2. Configure amostras de cultura experimental diluídas (2 mL de volume total) em uma placa de 24 poços de fundo plano(Tabela de Materiais).
   4. Incubar a placa em uma incubadora de agitação com luzes BRANCAS DO LED(tabela dos materiais)condições apropriadas do crescimento. Medir a densidade de crescimento da cultura (OD₇₅₀₎e maior fluorescência de proteína fluorescente amarela (eYFP) usando um leitor de placa (seção 4.2) ou um citometro de fluxo (seção 4.3).
      NOTA: Synechocystis PCC 6803 e S. elongatus UTEX 2973 culturas podem ser cultivadas como na etapa 3.1.2. É altamente recomendável que a placa seja mantida alta umidade (95%) para evitar a evaporação das amostras de cultura.
2. Leitor de placas
   1. Misture brevemente as culturas na placa de 24 poços (passo 4.1.4) com tubulação suave. Transfira uma sub-amostra de cada cultura para uma placa preta de 96 poços de fundo chato(Mesa de Materiais). Diluir, se necessário (100 μL volume final). Evite a formação de bolhas, pois isso pode interferir com a precisão da medição.
      NOTA: Recomenda-se que todas as medições sejam realizadas em amostras em uma faixa de OD₇₅₀ de 0,2 a 1,0. Como a densidade das culturas nos 24 poços aumentará ao longo do tempo, as seguintes diluições são recomendadas com base nos aumentos esperados nas condições de crescimento padrão: sem diluição em 0 h, 1:4 às 24 h, 1:10 às 48 h e 1:10 às 72 h. Assim, por exemplo, às 24 h de colheita 25 μL de cultura e misture com 75 μL de BG11 médio.
   2. Inclua dois poços em branco na placa de 96 poços (ou seja, 100 μL do meio BG11). Coloque o prato de 96 poços em um leitor de placas(Mesa de Materiais). Agite a placa para 60 s em 500 rpm usando o agitador orbital no leitor da placa para misturar os poços.
      NOTA: As culturas de cianobacteriano podem agregar e/ou flocculate, assim que a boa mistura é crítica antes da leitura para medidas exatas.
   3. Medir o_{D.OD 750} e a fluorescência do eYFP com comprimentos de onda da excitação/emissão em 485 nm/520 nm.
   4. Subtraia a média das medições od₇₅₀ dos dois poços em branco da medição od₇₅₀ de cada amostra bem contendo cultura de cianobactérias.
   5. Normalize os valores de fluorescência de cada amostra de cultura dividindo a medida de fluorescência do eYFP (passo 4,2,3) pelo OD₇₅₀ ajustado da cultura (passo 4.2.4). Em seguida, subtraia o valor médio normalizado da fluorescência do eYFP (fluorescência/OD₇₅₀₎das réplicas biológicas de uma tensão de controle negativa apropriada das tensões transgênicas que carregam o da expressão do eYFP.
      NOTA: As cianobactérias fluorescem naturalmente devido à presença de pigmentos, como clorofila e fiobiliproteínas.
   6. Crescimento da cultura do enredo ao longo do tempo(Figura 6A)e os valores médios normalizados de fluorescência eYFP de cada cultura experimental nos pontos de tempo desejados (por exemplo, 72 h; Figura 6B).
3. Citometro de fluxo
   1. Escolha uma placa compatível para o sistema de manuseio líquido citometro de fluxo. Por exemplo, use uma placa de 96 poços de fundo redondo(Tabela de Materiais)com o citometro de fluxo(Tabela de Materiais)usado neste protocolo.
   2. Misture brevemente as culturas na placa de 24 poços (passo 4.1.4) com tubulação suave. Diluir as culturas para OD₇₅₀ = 0,1-0,2 para evitar bloqueios de bico no sistema de manuseio líquido. Adicione um volume apropriado de amostra de cultura à placa de 96 poços e traga para um volume final de 250 μL com soro fisiológico 1x amorteceu de fosfato esterilizado por filtro (PBS). Inclua um poço em branco para a solução média na placa contendo 60 μL de BG11 e 190 μL de 1x PBS.
      NOTA: Este volume é recomendado no caso de haver uma necessidade de re-executar amostras. Volumes superiores a 250 μL não são recomendados, pois o volume máximo de cada poço é de 300 μL.
   3. Uma vez que o citometro de fluxo está pronto para uso, coloque a placa de 96 poços com amostras de cultura na estação de manuseio líquido. Configure o protocolo de software para o citometro de fluxo para coletar as medições de 10.000 eventos individuais (por exemplo, células). Medir a fluorescência eYFP com comprimentos de onda de excitação/emissão de 488 nm/515-545 nm. Primeiro medir e verificar a leitura do poço em branco(Figura 7A), em seguida, executar as amostras.
   4. Gate a população de células cianobactérias dentro da frente e conjuntos de dados de dispersão lateral, excluindo regiões comuns com a leitura em branco (Figura 7B). Subtraia os valores médios de fluorescência eYFP das réplicas biológicas de uma cepa de controle negativa apropriada das cepas transgênicas que transportam o de expressão eYFP (Figura 7C,D). Traçar a média dos valores medianos de fluorescência por célula para cada cultura experimental nos pontos de tempo desejados (por exemplo, 72 h; Figura 7E).

5. Extração genômica do ADN das cianobactérias

NOTA: O protocolo abaixo utiliza um kit comercial de extração de DNA(Tabela de Materiais).

1. Crescer uma cultura líquida cianobacteriana em BG11 (como descrito na seção 3.1) até OD₇₅₀ = 1,5-3,0. Desça 10 mL de cultura a 3.000 x g por 10 min e descarte o supernatant. Congele a pelota incubando os tubos a -20 °C por 30 min.
2. Adicione 400 μL de lume de lúce (buffer AP1) e 400 μL de solução de ribonuclease (RNase A) e 50% (w/v) de contas de vidro (0,5 mm de diâmetro). Interrompa amostras usando um moinho de contas(Mesa de Materiais)a 30 Hz (ou seja, equivalente a 1.800 oscilações/min) por 6 min.
3. Gire a amostra em 17.000 x g por 5 min e transfira cuidadosamente o supernatant em um tubo novo e descarte a pelota. Prossiga de acordo com as instruções do fabricante(Tabela de Materiais).

6. Eletroforese de gel agarose

1. Lançar um 1% (w/v) gel agarose contendo 0,02% (v/v) brometo de etídio. Carregue amostras e uma referência apropriada da escada do ADN.
2. Executar as amostras por 50 min em 125 V. Verifique se há separação de banda em um transilluminator ultravioleta (UV).
   NOTA: O tempo de execução e a porcentagem de gel agarose pode ser modificado para atender ao tamanho esperado da banda. Por exemplo, um gel agarose de porcentagem maior e maior tempo de execução podem melhorar a resolução da banda e a separação de produtos de DNA <500 bp.

7. Colônia PCR

1. Configure um mix de reação pcr usando um kit padrão(Tabela de Materiais)e uma combinação apropriada de primers (por exemplo, primers que flanqueiam a região de montagem ou são específicos para seqüências dentro da região de montagem(Tabela 3). Pipeta 10 μL em um tubo PCR.
2. Toque delicadamente a parte superior de uma única colônia branca com um toothpick estéril ou uma ponta estéril da pipeta de 10 μL e inocule um tubo do PCR que contem a mistura da reação do PCR. Tome cuidado para marcar a colônia e combinar com o tubo PCR específico. Mexa delicadamente a mistura de reação para garantir que as células de E. coli sejam derramadas na solução.
3. Amplifique os produtos por PCR. Use um programa composto por uma etapa inicial de desnaturação de 95 °C para 60 s, 30 rodadas de 95 °C para 15 s, 58 °C para 15 s (poucos graus abaixo dos valores T_m das cartilhas) , 72 °C para 30 s (30 s/kb de inserção) , seguido por uma etapa de extensão final de 72 °C para 5 min.

8. Preparação de BG11 médio e placas

1. Prepare soluções de estoque de 100x BG11 médio, ferro (citrato férrico de amônio), oligoelementos, fosfato (K₂HPO_4),Na₂CO₃ e TAMPÃO TES de acordo com Lea-Smith et al.¹¹. Fosfato de autoclave e estoques de CO₃ Na_2. Use filtros de 0,2 μm para filtrar esterilizar as soluções de ações TES buffer (pH 8.2) e NaHCO_3.
2. Prepare 1 L de BG11 médio. Misture 10 mL de 100x BG11, 1 mL de oligoelementos e 1 mL de ferro e autoclave a solução com 976 mL de água. Uma vez que a solução tenha esfriado para RT, adicione 1 mL de estoque de fosfato, 1 mL de_estoqueDE 2 CO₃ e 10 mL de NaHCO_3,e ajuste para pH 7.6-7.8 com 1 M HCl.
3. Placas de ágar LB-BG11 (1,5% [w/v])
   1. Combine 700 mL de água desionizada e 15 g de ágar em um frasco de vidro. Em um segundo frasco, adicione 186 mL de água, 10 mL de 100x BG11, 1 mL de oligoelementos e 1 mL de caldo de ferro. Autoclave ambas as soluções.
   2. Uma vez que as soluções esfriaram para cerca de 60 °C, combiná-los e adicionar 1 mL de estoque de fosfato, 1 mL de Na₂CO₃ estoque, 10 mL de NaHCO₃ estoque e 50 mL de LB médio estéril, que deve dar um volume final de 1 L. Cast petri pratos com 25 mL de LB-BG11 agar médio.
4. PLACAS de ágar BG11+Kan50 (1,5% [w/v])
   1. Combine 700 mL de água desionizada e 15 g de ágar em um frasco de vidro. Em um segundo frasco, adicione 3 g de tiosulfato de sódio (Na₂S₂O_3),226 mL de água, 10 mL de 100x BG11 estoque, 1 mL de oligoelementos e 1 mL de ferro. Autoclave ambas as soluções.
   2. Uma vez que as soluções esfriaram para cerca de 60 °C, combiná-las e adicionar 1 mL de estoque de fosfato, 1 mL de estoque de NA₂CO_3, 10 mL de estoque tampão TES e 10 mL de estoque NaHCO_3, o que deve dar um volume final de 1 L. Adicionar sulfato de kanamicina a uma concentração final de 50 μg/mL e molde pratos de Petri com 35 mL do meio.

Resultados

Para demonstrar o fluxo de trabalho de montagem golden gate, uma fita de expressão foi montada no vetor de aceitação de nível 1 (Forward) (pICH47732) contendo as seguintes partes de nível 0: o promotor do operon C-phycocianina P cpc560 (pC0.005), contendo as seguintes partes de nível 0: o promotor do operon C-phycocianina P cpc560 (pC0.005), contendo as seguintes partes de nível 0: o promotor do operon C-phycocianina P cpc560 (pC0.005), contendo as seguintes partes de nível 0: o p...

Discussão

Golden Gate montagem tem várias vantagens em comparação com outros métodos de montagem vetorial, particularmente em termos de escalabilidade^20,21. No entanto, a criação do sistema Golden Gate em um laboratório requer tempo para desenvolver uma familiaridade com as várias partes e bibliotecas vetorial aceitadoras e processos de montagem em geral. O planejamento cuidadoso é muitas vezes necessário para assembléias mais complexas ou ao realizar um grande ...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside (X-Gal)	Thermo Fisher Scientific	R0404	Used in 2.1.3.
Adenosine 5′-triphosphate (ATP) disodium salt	Sigma-Aldrich	A2383	Used in Table 2.
Agar (microbiology tested)	Sigma-Aldrich	A1296-500g	Used in 8.3.
Agarose	Bioline	BIO-41026	Used in 6.
Attune NxT Flow Cytometer	Thermo Fisher Scientific	-	Used in 4.3.1.
Bovine Serum Albumin (BSA)	Sigma-Aldrich	A2153	Used in Table 2.
BpiI (BbsI)	Thermo Fisher Scientific	ER1011	Used in Table 2.
BsaI (Eco31I)	Thermo Fisher Scientific	ER0291	Used in Table 2.
Carbenicillin disodium	VWR International	A1491.0005	Used in 2.1.3.
Corning Costar TC-Treated flat-bottom 24 well plates	Sigma-Aldrich	CLS3527	Used in 4.1.3.
Dimethyl Sulfoxide (DMSO)	Thermo Fisher Scientific	BP231-100	Used in 3.6.2.
DNeasy Plant Mini Kit	Qiagen	69104	DNA extraction kit. Used in 5.
FLUOstar Omega Microplate reader	BMG Labtech	-	Used in 4.2.2.
GeneJET Plasmid Miniprep Kit	Thermo Fisher Scientific	K0503	Plasmid purification kit. Used in step 2.3.2.
Glass beads (0.5 mm diameter)	BioSpec Products	11079105	Used in 5.2.
Glycerol	Thermo Fisher Scientific	10021083	Used in 2.3.1, 3.6.2.
Isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside (IPTG)	Thermo Fisher Scientific	10356553	Used in 2.1.3.
Kanamycin sulphate (Gibco)	Thermo Fisher Scientific	11815-024	Used in 2.1.3.
Membrane filters (0.45 μm)	MF-Millipore	HAWP02500	Used in 3.3.7
Microplates, 96-well, flat-bottom (Chimney Well) µCLEAR	Greiner Bio-One	655096	Used in 4.2.1.
Monarch DNA Gel Extraction Kit	New England Biolabs	T1020S	Used in 1.1.2.2.
Monarch PCR DNA Cleanup Kit	New England Biolabs	T1030	DNA purification kit. Used in 1.1.2.3.
Multitron Pro incubator with LEDs	Infors HT	-	Shaking incubator with white LED lights. Used in 4.1.4.
MyTaq DNA Polymerase	Bioline	BIO-21108	Used in 7.1.
NanoDrop One	Thermo Fisher Scientific	ND-ONE-W	Used in 2.3.3.
One Shot TOP10 chemically competent E. coli	Thermo Fisher Scientific	C404010	Used in 2.1.1.
Phosphate buffer saline (PBS) solution (10X concentrate)	VWR International	K813	Used in 4.3.2.
Q5High-Fidelity DNA Polymerase	New England Biolabs	M0491S	Used in 1.1.2.1.
Quick-Load 1 kb DNA Ladder	New England Biolabs	N0468S	Used in Figure 4.
Screw-cap tubes (1.5 ml)	Starstedt	72.692.210	Used in 3.6.3
Spectinomycin dihydrochloride pentahydrate	VWR International	J61820.06	Used in 2.1.3.
Sterilin Clear Microtiter round-bottom 96-well plates	Thermo Fisher Scientific	612U96	Used in 4.3.1.
T4 DNA ligase	Thermo Fisher Scientific	EL0011	Used in Table 2.
TissueLyser II	Qiagen	85300	Bead mill. Used in 5.2.