使用CyanoGate模块化克隆工具包进行共生对蓝藻的遗传改造

摘要

在这里，我们提出一个协议，描述如何使用CyanoGate模块化克隆工具包组装自我复制载体，ii） 通过结合将载体引入蓝藻宿主，iii） 使用板读取器或流式细胞仪。

摘要

蓝藻是一组不同的原核光合生物，可以进行基因改造，用于可再生生产有用的工业商品。合成生物学的最新进展导致开发若干克隆工具包，如CyanoGate，这是一个标准化的模块化克隆系统，用于建立质粒载体，以便随后转化或结合转移到蓝藻中。在这里，我们概述了组装自我复制载体（例如，携带荧光标记表达盒）和结合转移载体到蓝藻菌株Synechocystis sp. PCC 6803 或Synechococcus 的详细方法埃隆塔图斯UTEX 2973.此外，我们概述了如何使用板读器或流动细胞仪来描述遗传部件（例如启动器）的性能。

引言

蓝藻是自养菌，可用于各种天然和异物高价值代谢^{产物1、2、3、4、5}的生物^{合成。 6}.要扩大商业可行性，仍需要克服几个障碍，最显著的是，与异养生物平台（如大肠杆菌和酵母）相比，产量^{相对较低7。}最近现有基因工程工具的扩展和合成生物学范式在蓝藻研究中的采用，正在帮助克服这些挑战，并进一步将蓝藻发展为高效的生物^{工厂89，10}.

将DNA引入蓝藻的主要方法是转化、结合和电穿孔。通过转化或电穿孔转移到蓝藻的载体是"自杀"载体（即促进同源重组的综合载体），而自我复制的载体可以通过转化、联结或电穿孔。对于前者，一个协议可用于工程模型物种，适合自然^转化11。最近，一种名为CyanoGate的蓝藻模块化克隆（MoClo）工具包已经开发出来，采用标准化的金门矢量组装方法，采用自然转化、电穿孔或^{结合12进行}工程。

金门式装配技术近年来日益普及，装配标准和零件库现已可供各种生物^{使用，包括13、14、15、16 ， 17}.金门使用IIS型限制酶（例如，BsaI、BpiI、BsmBI、BtgZI和AarI）和一套接受酶和独特的悬垂，以方便在"一锅"组装反应中对多个序列进行定向分层组装。IIS 型限制酶可识别独特的不对称序列，并切断其识别位点的固定距离，以生成交错的"粘性端"切口（通常为 4 核苷酸 [NT] 悬垂），随后可利用该切口驱动有序 DNA组装^{反应15，18}。这促进了由通用语法（如 PhytoBricks 标准¹⁹）定义的模块化 0 级部件（例如启动器、打开的读取框架和终结器）的大型库的开发。然后，0 级部件可以容易地组装成 1 级表达式盒，然后更复杂的高阶组件（例如，多基因表达式构造）可以构建在选择^12、15的接受器向量中。金门式装配技术的一个关键优势是，在高通量设施（如DNA铸造^{厂20、21）}实现自动化，可以测试复杂的实验设计，不能轻易通过人工。

CyanoGate建立在已建立的工厂MoClo^{系统12，15。}要将新部件合并到 CyanoGate 中，必须首先将零件序列进行驯化，即必须删除 BsaI 和 BpiI 的"非法"识别站点。对于开放读取帧的零件编码（即编码序列 CDS），识别站点可以通过在序列中生成同义词突变（即将协子更改为编码相同氨基酸残渣的替代方法）来中断识别位点。这可以通过多种方法实现，从DNA合成到聚合酶链式反应（PCR）扩增为基础的策略，如吉布森^组装22。根据所使用的表达式主机，应注意避免引入可能抑制翻译效率的稀有科^顿23。在启动器和终结器序列中移除识别站点通常是一项风险更大的工作，因为修改可能会影响功能，并且部件可能无法按预期执行。例如，对假定转录因子结合位点或启动剂内的核糖体结合位点的变化可能会改变对诱导/抑制的强度和响应能力。同样，对关键终结器结构特征（例如，GC富干、环和多U尾）的修改可能会改变终止效率和效应基因^{表达24，25}。尽管可以使用多个在线资源来预测启动子和终止器序列的活动，并告知建议的突变是否会影响性能^26和27，但这些工具通常不能预测在蓝藻28，29，30。因此，仍建议在体内对改性部件进行表征，以确认活性。为了协助克隆顽固的序列，CyanoGate包括基于BioBrick载体pSB4K5^12，16，31的低拷贝克隆接受载体。此外，爱丁堡基因组铸造厂还提供"设计和构建"门户，以帮助进行载体设计（dab.genomefoundry.org）。最后，也是最重要的，CyanoGate 包括两个 T 级接受载体设计（相当于 2 级接受^{载体）15，}用于使用自杀载体将 DNA 引入蓝藻，或能够自我复制的广泛宿主范围载体在几个蓝藻菌种32，33，34。

在这里，我们将重点描述用于生成 T 级自我复制载体的协议，以及Synechocystis PCC 6803 和Synechocous UTEX 2973（Synechocystis PCC 6803 和 S. elongatus）的遗传修饰UTEX 2973 以后通过结合（也称为三亲交配）。细菌细胞之间的DNA的共生转移是一个描述良好的过程，以前曾用于工程蓝藻物种，特别是那些不能自然胜任的物种，如S.长龙UTEX 2973^{35， 36，37，38，39，40，41}.简而言之，用携带要转移的载体的大肠杆菌菌株（"货物"载体）和载体（在同一大肠杆菌菌株或附加菌株中）孵育，以促成结合（"动员器"和"帮助器"向量）。进行夫妻转移需要四个关键条件:1）参与DNA转移的细胞之间的直接接触，2）货物载体必须与结合系统兼容（即，它必须包含适当的转移来源（oriT），也称为bom（流动性基础）位点，3） DNA刻痕蛋白（例如，由生物基因编码），在oriT处刻痕 DNA 以启动 DNA 到青霉菌的单链转移，必须存在并表达从货物或帮手载体，和4）转移的DNA不得破坏在受体氰化细胞（即，必须抵抗降解，例如，限制内细胞内膜酶活性）^35，42。使货物载体得以持续，复制的来源必须与受体青霉菌兼容，以便自我复制和扩散到子细胞后分裂。为了帮助条件3和4，几个帮助载体可以通过Addgene和其他商业来源，编码生物以及几个甲基酶，以保护从原生内分酶在宿主氰化^酶43。在本协议中，分别由MC1061大肠杆菌菌株携带动员器和辅助载体pRK24（www.addgeneorg/51950）和pRL528（www.addgene.org/58495）促进结合。在选择用于夫妻转移的载体时，必须小心谨慎。例如，在 CyanoGate 套件中，自复制货物矢量 pPMQAK1-T 编码为 Mob 蛋白¹²。然而，pSEVA421-T^不44，因此，生物必须从合适的帮助向量表达。使用的载体也应适合目标生物体。例如，在Anabaena sp. PCC 7120中，有效的夫妻转移需要一个帮助器载体，以保护动员器载体免受消化（例如，pRL623，它编码为三种甲基酶AvaiM，Eco47iiM和Ecot2iM）^{45， 46}.

在本协议中，我们进一步概述了如何使用板读取器或流式细胞仪使用荧光标记来描述部件（即启动子）的性能。流量细胞计能够测量荧光在单个细胞的基础上为大量。此外，流量细胞计允许用户"门"获取的数据并消除背景噪音（例如，从培养物或污染中的颗粒物中）。相反，板读取器获取给定培养量的聚合荧光测量，通常在几个复制孔中。与细胞仪不同，板式读片器的主要优势包括成本更低、可用性更高，并且通常不需要用于下游数据分析的专业软件。板读机的主要缺点是与细胞仪相比灵敏度相对较低，并且与测量培养物的光学密度存在潜在问题。对于比较分析，必须对每口孔的板读取器样本进行标准化（例如，对培养密度进行测量，通常以 750 nm [OD₇₅₀] 时的光密度为吸光度），这可能导致样品的精度也致密和/或未很好地混合（例如，当容易聚集或絮凝时）。

作为概述，这里我们详细介绍了生成 0 级零件的原则，然后使用 CyanoGate 套件进行分层组装，并将克隆到适合夫妻转移的载体中。然后，我们演示了夫妻转移过程，选择表达荧光标记的轴跨结子菌株，以及随后使用流式细胞仪或板读取器获取荧光数据。

研究方案

1. 使用植物莫克洛和 CyanoGate 工具包的矢量组件

注:在继续矢量组装之前，强烈建议用户熟悉植物和CyanoGate MoClo系统的矢量级^{结构12、15。}

1. 0 级部件的构造
   注: 0 级部件可以合成为完整的矢量或线性序列，用于使用 0 级接受器（例如，gBlocks、IDT）进行装配。或者，序列可以从源模板（例如，载体或纯化基因组DNA）放大。这里，如何从放大的产品生成一个新的0级部件。金门装配过程从 0 级到 T 级的概述如所示图 1.
   1. 设计引体。
      1. 决定要组装的 0 级模块，并确定适当的 5° 和 3+ 悬伸 （表 1）^12，15。检查DNA序列以克隆是否存在BpiI或BsaI限制位点。
         注: 包含这些站点之一的序列必须通过修改限制站点序列中的一个或多个 NT 进行驯化。图2概述了使用金门装配来执行此操作的策略。
      2. 要扩增DNA序列，应设计适当的正向和反向引结对。对于正向引基，选择 18⁄30 bp 补充 DNA 模板序列的 5° 末端。对于反向引基，选择 18⁄30 bp 反向补充 DNA 模板序列的 3° 端。
         注:熔融温度（T_m） 为 58~62 °C 的底漆通常提供最一致的放大结果（图 1A）。
      3. 将以下内容添加到前引基的 5° 端:1） BpiI 站点 5° 端的 4⁄6 NT 随机字符串，2） BpiI 限制站点 （GAAGAC），3） 两个随机 NT，4） 步骤 1.1.1.1 中选择的 5° 悬垂。在反向引基器的 5° 端添加以下内容:1） BpiI 站点 5° 端的 4⁄6 NT 随机字符串，2） BpiI 限制站点 （GAAGAC），3） 两个随机 NT，4） 步骤 1.1.1.1 中选择的 3° 悬垂。完成后，订购底漆对。
         注:有关正向和反向底漆对的示例，请参阅图 1A。
   2. 从基因组DNA中扩增DNA序列。
      1. 提取基因组DNA，如第5节所述。使用高保真DNA聚合酶（材料表）通过PCR放大产品。
         注:例如，根据制造商的说明设置PCR反应（20±50μL）。每次反应使用+100 ng的基因组DNA。使用热循环程序，包括初始变性步骤 98 °C 的 30 s，然后不超过 25 个周期的变性在 98°C 下 10 s，引热退火在 58°C 的引火退火 15 s 和产品在 72°C 扩展 30 s（根据使用的DNA聚合酶的产品/类型的大小），然后是72°C的最终延伸步骤2分钟。
      2. 如果要对 PCR 产品进行凝胶纯化，则如第 6 节所述，在胶凝剂上运行整个 PCR 反应。将感兴趣的带从胶胶中切出，并使用凝胶提取试剂盒（材料表）进行纯化。
      3. 步骤 1.1.2.2 的替代方案，如果要在没有凝胶纯化的情况下使用 PCR 产品，请通过在胶凝剂凝胶上运行 PCR 反应样品 （±5 μL） 的等分来验证带大小。如果凝胶只显示适当的带状物，并且没有引物二聚物的证据，请使用DNA纯化试剂盒（材料表）纯化PCR产品。
      4. 在少量去离子水（例如，10 μL）中纯化了脱脂DNA，以获得高DNA浓度（>20纳克/μL通常就足够了）。
   3. 组装0级放大的DNA产物（或产物，见图2）。使用 BpiI（图 1B）制备 20 μL 反应混合物，并设置热循环器程序，如表 2所述。使用组装的0级反应混合物的5 μL进行大肠杆菌转化（如第 2 节所述）。
2. 建造 1 级组件
   1. 决定要组装的 0 级部件（图 1C和表 1）。选择适当的 1 级接受器向量¹⁵。
      注: 在此阶段，了解 T 级的最终矢量设计非常重要，因为这将影响 1 级接受方矢量的选择。如果目标是在 T 级中具有单个 1 级程序集（例如，基因表达盒），则可以将级别 1 位置 1（正向）接受器载体 （pICH47732） 用作默认值。但是，如果要在 T 级中组装两个或多个 1 级装配体，则必须考虑每个级别 1 装配体的位置和方向。通过使用具有适当位置¹²的 1 级接受器矢量，最多可在 T 级接受器矢量中组装多达 7 个 1 级程序集。
   2. 在 1 级组装 0 级部件。与 BsaI 制备 20 μL 反应混合物，并设置热循环器程序，如表 2所述。使用组装的 1 级反应混合物的 5 μL 进行大肠杆菌转化（如第 2 节所述）。
3. T 级组件的构造
   1. 决定要组装的级别 1 装配体 （图 1D）。选择适当的 T 级接受器矢量。
      注:pUC19A-T（阿霉素耐药性）和pUC19S-T（表皮霉素耐药性）是高拷贝数整合载体，无法在蓝藻中复制，主要用于基因组整合（即基因的敲击或敲除）同源重组¹².综合病媒的交付可以通过自然转化在可接受的蓝藻^物种11。pPMQAK1-T 是一个广泛的主机范围，通过夫妻转移提供的复制载体（第 3 节）。
   2. 选择适当的端链接，将最终 1 级程序集的 3° 端端端端端端端端端端端至 T 级骨干网¹⁵。
      注: 所需的结束链接与最终零件的位置相同。例如，只有一个级别 1 位置 1（正向或反向）零件的 T 级矢量将需要端链接 1 （pICH50872） 进行连接到 T 级主干中。
   3. 在 T 级组装一个或多个 1 级组件。准备与 BpiI 和所需的端链接矢量进行反应组合，并设置热循环器程序，如表 2中所述。使用组装的T级反应混合物的5 μL进行大肠杆菌转化（如第2节所述）。

2.大肠杆菌转化和载体纯化

1. 大肠杆菌转化（第1天）
   1. 将具有化学能力的大肠杆菌细胞（材料表）的等分（±25 μL）除霜，并轻轻将液器放入冰上1.5 mL管中。加入 5 μL 的装配混合物（0、1 或 T 级），并在冰上孵育管 30-60 分钟。
   2. 热休克细胞在42°C的水浴中孵育管30秒，然后将管放回冰上2分钟。在摇动的培养箱中，在37°C下孵育管1小时，转速为225rpm。
   3. 将培养物的40μL板板放在含有适当最终浓度的抗生素（100微克/升L用于规格霉素二氯化物五氯化物[0级]、100μg/mL的甲苯二钠[1级]，或50微克/mL的卡那霉素硫酸盐 |T级），1 mM等丙基-β-D-硫丙酮（IPTG）和40微克/mL的5-溴-4-氯-3-indolyl-β-D-角蛋白（X-Gal），用于蓝白色筛查。在37°C下孵育板过夜。
      注:根据大肠杆菌能称量细胞的效率和结扎反应，培养层的含量可以有所不同。如果发现过夜孵育后，将菌落扩大，则板的体积较大。
2. 选择白色菌落和液体培养物的制备（第2天）
   注:根据装配反应和后续转化的效率，LB琼脂板可能不包含菌落、蓝色菌落或白色菌落（图3）。蓝色菌落表示未经过限制的接受载体（即，lacZ的功能副本仍然存在）。白色菌落表示lacZ表达盒已丢失，并替换为零件/组件。
   1. 或者，通过执行第 7 节所述的 PCR，验证白色菌落是否包含预期的向量。
   2. 用10μL尖端选择单白色菌落（或PCR验证菌落），并转移到含有LB培养基（5 mL）和适当抗生素浓度的15 mL离心管（步骤2.1.3）。在摇动的培养箱中，在37°C下以225rpm在225rpm下孵育管子。
3. 质粒载体纯化（第3天）
   1. 或者，准备一夜之间大肠杆菌培养物的甘油库存，用于病媒的长期冷冻储存。在适当的1.5~2.0 mL管中加入500μL的50%（v/v）甘油，在-80°C下冷冻储存。通过反转 5×10x 轻轻混合。在液氮中冷冻样品，并储存在-80°C冷冻箱中。
   2. 在3000 x g下在15 mL离心管中旋转培养物5~10分钟。在不影响细胞颗粒的情况下丢弃上清液。使用质粒纯化试剂盒（材料表）净化病媒。在35 μL的去离子水中的洗脱纯化载体。
      注:使用较低的洗脱体积可进一步增加矢量浓度。同样的增流剂可以通过净化柱两次，提高产量。
   3. 使用分光光度计（材料表）测量乳胶中矢量的浓度。
      注:大肠杆菌（如pUC19）中的高拷贝数载体通常提供50~300纳克/μL的产量。
4. 矢量验证
   注:矢量可以通过限制消化（步骤 2.4.1）和/或排序（步骤 2.4.2）进行验证。
   1. 使用适当的限制性酶限制0.5±1 μg的载体，并验证第6节（图4）中描述的预期带大小。
      注: 不正确的波段大小通常表示装配错误，在这种情况下，可以屏蔽更多的白色菌落或重复组装。BsaI 和 BpiI 可用于分别验证级别 0 和级别 1 组件的刀片的正确大小。BsaI 或 BpiI 可与一种额外的相容性限制性酶结合使用，这种酶在插入件和/或载体主干内切割，在消化后产生一组独特的分离带。
   2. 使用商业测序工具对聚集区域上游的载体进行Sanger测序（表3）。
      注: 应对所有新的级别 0 部件进行排序，以确认预期的序列标识。如果从以前排序的 0 级零件组装，则通常不需要对级别 1 和 T 矢量进行序列验证。

3. 通过偶联生成突变体

注:这里描述了一个将自我复制的货物载体转移到Synechocystis PCC 6803或S.长龙UTEX 2973^11，47的夫妻协议。该协议适用于其他型号（例如，S. 埃隆图斯PCC 7942 和Synechococcus sp. PCC 7002）。所有与蓝藻（和相关缓冲制剂）的工作都应在层流罩的无菌条件下进行。

1. 蓝藻培养的生长（第1天）
   1. 根据Lea-Smith^等人11号准备BG11介质，并准备带LB-BG11和BG11+Kan50的琼脂板（第8节）。
   2. 通过用来自轴质 BG11 琼脂板的细胞为新鲜 BG11 介质 （50 mL） 的 100 mL 锥形烧瓶接种，建立新鲜培养的Synechocystis PCC 6803 或S. 长龙 UTEX 2973。在 30°C 下生长Synechocystis PCC 6803 培养物，100 μmol 光子 m^-2s^-1在 100 rpm 时生长，在 40°C 时生长S. 长光柱UTEX 2973，在 100 rpm 时生长 300 μmol 光子^m-2s^-1。在 OD₇₅₀ = 0.5±1.5（通常为 1⁄2 天）之前，种植培养物。
      注: S. 长光UTEX 2973培养物可在40°C高光强度下生长（例如，2000 μmol光子m-2^s-1）48。
2. 帮手和货物大肠杆菌菌株的生长（第2天）
   1. 用含有载体pRK24和pRL528（即帮助剂菌株）的MC1061大肠杆菌菌株接种含有氨基青霉素（最终浓度100微克/mL）和氯霉素（最终浓度25微克/mL），并在225rpm时在37°C生长在摇动的孵化器中。成长足够的帮助应变培养量，假设每个结合需要 1 mL 培养。
   2. 用携带货物载体的大肠杆菌培养基（即T级载体）接种含有适当抗生素的LB培养基（5 mL）。在摇动的培养箱中，在225rpm的转速下，在37°C过夜。
3. 夫妻转移（三亲交配）（第3天）
   1. 准备大肠杆菌和货物菌株。在室温下，将帮助器和货物大肠杆菌过夜培养在3，000 x g下10分钟。在不干扰细胞颗粒的情况下丢弃上清液。
   2. 在不添加不含抗生素的新鲜LB培养基液洗涤颗粒。使用与初始区域性相同的卷。通过轻轻上下移液来重新悬浮颗粒。不要涡旋文化。重复此步骤 3 倍，从隔夜培养中去除残留抗生素。
   3. 离心重新悬浮的培养物（如步骤 3.3.1），丢弃上清液，并在初始培养体积的 LB 介质体积的一半中重新悬浮（例如，如果隔夜培养物为 5 mL，则为 2.5 mL）。将 450 μL 的助剂应变与 450 μL 的货物应变组合在 2 mL 管中，并留出（在 RT 处离开），直到步骤 3.3.6。
   4. 准备蓝藻培养物。对于每种结合反应，使用1 mL的蓝藻培养物（OD₇₅₀ = 0.5±1.5）。
   5. 在RT处将所需的蓝藻培养总量在1，500 x g下，10分钟，然后小心丢弃上清液，而不会干扰细胞颗粒。通过添加相同初始体积的新鲜 BG11 介质来清洗颗粒。通过轻轻上下移液来重新悬浮颗粒，不要涡旋培养。重复此步骤 3x 并将洗涤区域性放在一边。
   6. 在 2 mL 管中加入组合的大肠杆菌菌株（帮助器和货物）（900 μL）中，添加洗涤的蓝藻培养物 （900 μL） 的等分。通过轻轻上下移液混合培养物。不要涡旋。在 RT 孵育混合物 30 分钟，用于Synechocystis PCC 6803 或 2 h，用于S. 长龙UTEX 2973。
   7. 在RT.去除1.6 mL的上清液时，在1，500 x g下将混合物离心10分钟。在剩余的±200 μL上清液中重新悬浮颗粒。将一个0.45 μm膜过滤器放在没有抗生素的LB-BG11琼脂板上（第8节）。用无菌扩张器或无菌的弯曲尖端在膜上小心地涂布200 μL的大肠杆菌/蓝藻培养物混合物，用石蜡薄膜密封板。
   8. 用膜孵育LB-BG11板24小时。在30°C、100μmol光^子m-2s-1下，用Synechocystis PCC 6803培养膜维持膜。在150μmol光^子m-2s-1中，将具有S.超锥体UTEX 2973培养物的膜保持在40°C。
4. 膜转移
   1. 24小时后，小心地使用火焰灭菌钳将膜转移到含有适当抗生素的新鲜BG11琼脂板（第8节），为货物载体选择。用石蜡薄膜密封板。
   2. 在适当的生长条件下孵育BG11琼脂板，如上文所述，用于Synechocystis PCC 6803或S.长拉图斯UTEX 2973，直到菌落出现。
      注: 菌落通常出现后 7-14 天为Synechocystis PCC 6803 和 3-7 天为S. 长龙UTEX 2973。
5. 偶联物的选择
   注:只有携带货物载体的蓝藻菌群才能在膜上生长（图5）。
   1. 使用热无菌循环，从膜中选择至少两个单独的菌落，并条纹到含有适当抗生素的新BG11琼脂板上（图5C）。
      注:新鲜条纹的菌落可能仍然受到从偶联体携带的大肠杆菌的污染（即，如果小白菌落在盘子上明显），因此，两到三轮再刺入新鲜的BG11琼脂板通常是需要获得一个轴蓝藻培养。
   2. 通过在含有5 mL LB介质的15 mL离心管中接种一带蓝藻培养物，并在37°C下在摇动的培养箱中225rpm孵育过夜，确认没有大肠杆菌污染。经过足够的生长期（约7天），选择单个斧菌菌菌群，建立液体培养物，用于长期冷冻或后续实验。
6. 氰化菌株的冷冻储存
   1. 在 BG11 中生长蓝藻液体培养物（如第 3.1 节所述），直到 OD₇₅₀ = 1.5±3.0。在1，500 x g下将10mL的培养物离心10分钟，去除上清液，在5mL的新鲜BG11培养基中重新悬浮细胞。
   2. 加入3.5 mL的高压灭菌消毒50%（v/v）甘油，最终甘油浓度为±20%（v/v）⁴⁹。这种方法适用于合成囊素PCC 6803。或者，添加5 mL的过滤灭菌BG11，含有16%（v/v）二甲基亚硫酸盐（DMSO），最终DMSO浓度为+8%（v/v）⁵⁰。对于大多数菌株，包括S. 长点UTEX 2973，建议使用此方法。
      注意:DMSO 是有毒的，应采取适当的保护。
   3. 通过反转 5×10x 轻轻混合。Subaliquote ±1 mL 的培养物放入单独的冷冻存储兼容 1.5 mL 螺钉盖管 （材料表）。将管子放入-80°C冷冻室，用于冷冻储存。请勿在液氮中闪烁冻结。
      注意:建议每株至少三个股票。
   4. 为进行恢复，从 -80°C 冷冻箱中取出一根管子，在 35°C 水浴中解冻培养液，同时轻轻混合。将解冻培养基添加到 50 mL 的新鲜 BG11 介质中，并成长为液体培养基（如第 3.1 节所述）。
      注:或者，文化可以在新鲜的BG11琼脂板上条纹和生长。携带选择标记的转基因培养物必须首先在没有抗生素的BG11琼脂板上恢复，然后用适当的抗生素重新培育到BG11琼脂板上。

4. 发起人特征

注:这里描述了一种标准方法，通过使用板读取器或流式细胞仪¹²测量荧光标记 （eYFP） 在 72 小时生长期之后的表达水平，从而分析启动子部件的强度。

1. 文化成长
   1. 通过接种含有适当抗生素的10 mL BG11培养物，用带有荧光标记表达盒的转基因蓝藻菌株单一菌群来建立种子培养。还要为适当的阴性对照菌株（例如，野生型菌株和/或携带相同载体主干但缺乏荧光标记表达盒的转基因菌株）准备种子培养物。
      注:建议至少进行四次生物复制。
   2. 在适合物种菌株的生长条件下，将种子培养物生长 48 小时或直到 OD₇₅₀ = 1⁄1.5。
   3. 要跟踪一段时间内的启动子表达式，首先测量每个种子区域性的 OD_750。计算稀释要求，使每种培养件的起始 OD₇₅₀ = 0.2。在平底24孔板（材料表）中设置稀释的实验培养样品（2 mL总体积）。
   4. 在适当的生长条件下，用白色LED灯（材料表）在摇动的培养箱中孵育板。使用板读取器（第 4.2 节）或流式细胞计（第 4.3 节）测量培养生长密度 （OD_750）和增强型黄色荧光蛋白 （eYFP） 荧光。
      注: Synechocystis PCC 6803 和S. 长龙UTEX 2973 培养物可以像步骤 3.1.2 中一样生长。强烈建议在高湿度下保持板材 （95%）以避免培养样品蒸发。
2. 板式读取器
   1. 将 24 孔板中的培养物（步骤 4.1.4）与柔和的移液短暂混合。将每种培养物的子样本转移到黑色平底 96 孔板（材料表）。如有必要，稀释（100 μL 最终体积）。避免气泡的形成，因为这可能干扰测量精度。
      注: 建议在 OD₇₅₀范围内 0.2±1.0 范围内对样品执行所有测量。由于 24 井中的培养物密度会随时间而增加，因此建议根据标准生长条件的预期增加进行以下稀释:0 小时时无稀释，24 小时时无稀释，48 h 时为 1:10，72 小时为 1:10。例如，在24小时收获25μL的培养基，并与75μL的BG11介质混合。
   2. 在 96 孔板中包括两口空白孔（即 BG11 介质的 100 μL）。将 96 孔板放入板式读卡器（材料表）。使用板读取器中的轨道摇床在 500 rpm 下摇动板 60 s 以混合孔。
      注: 蓝藻培养物可以聚合和/或絮凝，因此在读取之前进行良好的混合至关重要，以便进行精确测量。
   3. 在 485 nm/520 nm 处测量具有激发/发射波长的 OD₇₅₀和 eYFP 荧光。
   4. 从含有蓝藻培养的每个样品井的 OD₇₅₀测量中减去两个空白井的 OD₇₅₀测量值的平均值。
   5. 通过将 eYFP 荧光测量值（步骤 4.2.3）除以培养基的调整后的 OD_750（步骤 4.2.4），使每个培养基样品的荧光值标准化。然后，从携带eYFP表达盒的转基因菌株中减去适当负控制菌株的生物复制值（eYFP荧光/OD_750）的平均归化eYFP荧光值。
      注:由于色素的存在，如叶绿素和植物蛋白，蓝藻自然会荧光。
   6. 绘制随时间增长（图6A）和每个实验培养体在所需时间点的平均标准化 eYFP 荧光值（例如，72 h;图 6B.
3. 流量细胞仪
   1. 为流式细胞仪液体处理系统选择兼容的板。例如，使用本协议中使用的流式细胞仪（材料表）的圆底96孔板（材料表）。
   2. 将 24 孔板中的培养物（步骤 4.1.4）与柔和的移液短暂混合。将培养物稀释到 OD₇₅₀ = 0.1±0.2，以避免液体处理系统中的喷嘴堵塞。将适当体积的培养样品添加到 96 孔板中，使用过滤灭菌 1x 磷酸盐缓冲盐水 （PBS） 将最终体积达到 250 μL。在含有 60 μL BG11 和 190 μL 1x PBS 的板上为介质溶液包括一个空白孔。
      注: 如果需要重新运行示例，建议使用此卷。不建议高于 250 μL 的体积，因为每口井的最大体积为 300 μL。
   3. 一旦流量细胞仪准备就绪，将装有培养样品的 96 孔板放入液体处理站。设置流式细胞仪的软件协议，以收集 10，000 个单个事件（例如单元）的测量值。使用 488 nm/515_545 nm 的激励/发射波长测量 eYFP 荧光。首先测量并检查从空白井的读数（图7A），然后运行样本。
   4. 门的蓝藻细胞群在正向和侧面散射数据集，不包括与空白读数常见的区域（图7B）。从携带eYFP表达盒的转基因菌株中减去适当负控制菌株的生物复制的平均eYFP荧光值（图7C，D）。在所需时间点绘制每个实验培养值每个细胞的荧值中位数平均值（例如，72 小时;图 7E.

5. 从蓝藻中提取基因组DNA

注:以下协议使用商业DNA提取试剂盒（材料表）。

1. 在 BG11 中生长蓝藻液体培养物（如第 3.1 节所述），直到 OD₇₅₀ = 1.5±3.0。在 3，000 x g下旋转 10 mL 的培养物 10 分钟，然后丢弃上清液。通过在-20°C孵育管子30分钟，冷冻颗粒。
2. 加入400 μL的赖沙缓冲液（缓冲AP1）和400μL的核糖核酸溶液（RNase A），以及50%（w/v）的玻璃珠（直径0.5毫米）。使用 30 Hz（即相当于 1，800 次振荡/分钟）使用珠磨机 （材料表）中断样品 6 分钟。
3. 以 17，000 x g旋转样品 5 分钟，小心地将上清液转移到新管中并丢弃颗粒。按照制造商的说明（材料表）继续操作。

6. 阿加罗斯凝胶电泳

1. 铸造含有0.02%（v/v）溴化铀的1%（w/v）甘蔗凝胶。加载样品和适当的DNA阶梯参考。
2. 以 125 V 的速度运行样品 50 分钟。检查紫外线 （UV） 透射器上的带分离。
   注: 运行时间和甘蔗凝胶百分比可以修改，以适应预期的波段大小。例如，较高的脂糖凝胶百分比和更长的运行时间可以改善DNA产物的带分辨率和分离<500 bp。

7. 殖民地 PCR

1. 使用标准套件（材料表）和引物的适当组合（例如，在装配区域侧侧或特定于装配区域内的序列的引物）设置 PCR 反应混合物（表 3）。将10μL移液器放入PCR管中。
2. 用无菌牙签或10μL移液器尖端轻轻触摸单个白色菌落的顶部，并接种含有PCR反应混合物的PCR管。小心标记菌落，并与特定的PCR管匹配。轻轻搅拌反应混合物，确保大肠杆菌细胞被放入溶液中。
3. 通过 PCR 放大产品。使用一个程序，包括初始变性步骤 95 °C 的 60 s，30 轮 95 °C 的 15 s，58 °C 的 15 s（比底漆的 T_m值低几度），72°C 用于 30 s（30 s/kb 的刀片），然后是 72°C 的最后扩展步骤，为期 5 分钟。

8. BG11介质和板材的准备

1. 根据Lea-Smith^等人11，准备100xBG11介质、铁（铁）、微量元素、磷酸盐（K₂HPO_4）、Na2CO₃和TES缓冲液的库存溶液。磷肥和Na₂CO₃股票。使用 0.2 μm 过滤器过滤消毒 TES 缓冲液 （pH 8.2） 和 NaHCO₃库存解决方案。
2. 准备 1 L BG11 介质。将 100x BG11 的 10 mL、1 mL 微量元素和 1 mL 的铁库存混合，并将溶液与 976 mL 的水混合。一旦溶液冷却到RT，加入1 mL的磷酸盐库存，1 mL的Na₂CO₃库存和10 mL的NaHCO_3，并调整到pH 7.6×7.8与1M HCl。
3. LB-BG11 琼脂板（1.5% [w/v]）
   1. 将 700 mL 的去离子水和 15 克琼脂混合在玻璃瓶中。在第二个烧瓶中，加入186 mL的水、100x BG11的10 mL、1 mL的微量元素和1 mL的铁库存。高压灭菌两种解决方案。
   2. 一旦溶液冷却到60°C左右，将它们结合起来，加入1 mL的磷酸盐库存，1mL的Na₂CO₃股票，10 mL的NaHCO₃库存和50 mL的LB无菌介质，这应该给1L.Cast Petri菜肴与25的最终体积 LB-BG11琼脂介质的mL。
4. BG11_Kan50 琼脂板（1.5% [w/v]）
   1. 将 700 mL 的去离子水和 15 克琼脂混合在玻璃瓶中。在第二瓶中，加入3克硫磺酸钠（Na₂S₂O 3）、226 mL 水、100x BG11 库存10 mL、1 mL微量元素和 1 mL 铁库存。高压灭菌两种解决方案。
   2. 一旦溶液冷却到60°C左右，将它们结合起来，加入1mL的磷酸盐库存，1mL的Na₂CO₃库存，10mL的TES缓冲液库存，10mL的NaHCO₃库存，这应该给1L.添加卡那霉素硫酸盐的最终体积最终浓度为50μg/mL，用35 mL的介质铸造培养皿。

结果

为了演示金门装配工作流程，在 1 级位置（正向）接受器矢量 （pICH47732） 中组装了一个表达盒，其中包含以下 0 级部件:C-phycocyanin_operc560 （pC0.005） 的启动器，eYFP （pC0.008） 和双终止器 T_rrnB （pC0.082）¹²的编码顺序。在组件反应转化后，使用大肠杆菌菌落的标准蓝白筛选成功组装（图3）。1 级向?...

讨论

与其他矢量装配方法相比，金门装配具有几个优点，特别是在可伸缩^性20，21方面。然而，在实验室中建立金门系统需要时间来熟悉各个部件和接受方矢量库以及整体装配流程。对于更复杂的程序集或并行执行大量复杂程序集（例如，制作一套包含多个基因表达盒的 T 级矢量），通常需要仔细规划。我们建议首先列出所需的所有基因表达盒组合，然后映?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside (X-Gal)	Thermo Fisher Scientific	R0404	Used in 2.1.3.
Adenosine 5′-triphosphate (ATP) disodium salt	Sigma-Aldrich	A2383	Used in Table 2.
Agar (microbiology tested)	Sigma-Aldrich	A1296-500g	Used in 8.3.
Agarose	Bioline	BIO-41026	Used in 6.
Attune NxT Flow Cytometer	Thermo Fisher Scientific	-	Used in 4.3.1.
Bovine Serum Albumin (BSA)	Sigma-Aldrich	A2153	Used in Table 2.
BpiI (BbsI)	Thermo Fisher Scientific	ER1011	Used in Table 2.
BsaI (Eco31I)	Thermo Fisher Scientific	ER0291	Used in Table 2.
Carbenicillin disodium	VWR International	A1491.0005	Used in 2.1.3.
Corning Costar TC-Treated flat-bottom 24 well plates	Sigma-Aldrich	CLS3527	Used in 4.1.3.
Dimethyl Sulfoxide (DMSO)	Thermo Fisher Scientific	BP231-100	Used in 3.6.2.
DNeasy Plant Mini Kit	Qiagen	69104	DNA extraction kit. Used in 5.
FLUOstar Omega Microplate reader	BMG Labtech	-	Used in 4.2.2.
GeneJET Plasmid Miniprep Kit	Thermo Fisher Scientific	K0503	Plasmid purification kit. Used in step 2.3.2.
Glass beads (0.5 mm diameter)	BioSpec Products	11079105	Used in 5.2.
Glycerol	Thermo Fisher Scientific	10021083	Used in 2.3.1, 3.6.2.
Isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside (IPTG)	Thermo Fisher Scientific	10356553	Used in 2.1.3.
Kanamycin sulphate (Gibco)	Thermo Fisher Scientific	11815-024	Used in 2.1.3.
Membrane filters (0.45 μm)	MF-Millipore	HAWP02500	Used in 3.3.7
Microplates, 96-well, flat-bottom (Chimney Well) µCLEAR	Greiner Bio-One	655096	Used in 4.2.1.
Monarch DNA Gel Extraction Kit	New England Biolabs	T1020S	Used in 1.1.2.2.
Monarch PCR DNA Cleanup Kit	New England Biolabs	T1030	DNA purification kit. Used in 1.1.2.3.
Multitron Pro incubator with LEDs	Infors HT	-	Shaking incubator with white LED lights. Used in 4.1.4.
MyTaq DNA Polymerase	Bioline	BIO-21108	Used in 7.1.
NanoDrop One	Thermo Fisher Scientific	ND-ONE-W	Used in 2.3.3.
One Shot TOP10 chemically competent E. coli	Thermo Fisher Scientific	C404010	Used in 2.1.1.
Phosphate buffer saline (PBS) solution (10X concentrate)	VWR International	K813	Used in 4.3.2.
Q5High-Fidelity DNA Polymerase	New England Biolabs	M0491S	Used in 1.1.2.1.
Quick-Load 1 kb DNA Ladder	New England Biolabs	N0468S	Used in Figure 4.
Screw-cap tubes (1.5 ml)	Starstedt	72.692.210	Used in 3.6.3
Spectinomycin dihydrochloride pentahydrate	VWR International	J61820.06	Used in 2.1.3.
Sterilin Clear Microtiter round-bottom 96-well plates	Thermo Fisher Scientific	612U96	Used in 4.3.1.
T4 DNA ligase	Thermo Fisher Scientific	EL0011	Used in Table 2.
TissueLyser II	Qiagen	85300	Bead mill. Used in 5.2.