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In questo articolo

  • Riepilogo
  • Abstract
  • Introduzione
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  • Risultati
  • Discussione
  • Divulgazioni
  • Riconoscimenti
  • Materiali
  • Riferimenti
  • Ristampe e Autorizzazioni

Riepilogo

Qui, presentiamo un protocollo che descrive come i) assemblare un vettore auto-replicante utilizzando il toolkit di clonazione modulare CyanoGate, ii) introdurre il vettore in un ospite cianobatterico per coniugazione, e iii) caratterizzano ceppi di cianobatteri transgenici utilizzando un lettore di lamele o citometria di flusso.

Abstract

I cianobatteri sono un gruppo eterogeneo di organismi fotosintetici procyotici che possono essere geneticamente modificati per la produzione rinnovabile di beni industriali utili. I recenti progressi nella biologia sintetica hanno portato allo sviluppo di diversi toolkit di clonazione come CyanoGate, un sistema di clonazione modulare standardizzato per la costruzione di vettori plasmidi per la successiva trasformazione o trasferimento coniugale nei cianobatteri. Qui delineamo un metodo dettagliato per assemblare un vettore auto-replicante (ad esempio, portando una cassetta di espressione marcatore fluorescente) e il trasferimento coniugale del vettore nei ceppi cianobatterici Synechocystis sp. PCC 6803 o Synechococcus elongatus UTEX 2973. Inoltre, illustreremo come caratterizzare le prestazioni di una parte genetica (ad esempio, un promotore) utilizzando un lettore di lastre o una citometria di flusso.

Introduzione

I cianobatteri sono batteri autotrofici che possono essere utilizzati per la biosintesi di un'ampia varietà di prodotti metabolici naturali ed eterologhi di alto valore1,2,3,4,5, 6. Diversi ostacoli devono ancora essere superati per espandere la loro redditività commerciale, in particolare, le rese relativamente scarse rispetto alle bio-piattaforme eterotrofiche (ad esempio, Escherichia coli e lievito)7. La recente espansione degli strumenti di ingegneria genetica disponibili e l'assorbimento del paradigma della biologia sintetica nella ricerca cianobatterica sta contribuendo a superare tali sfide e a sviluppare ulteriormente i cianobatteri come biofabbriche efficienti8, 9,10.

I principali approcci per introdurre il DNA nei cianobatteri sono la trasformazione, la coniugazione e l'elettroporazione. I vettori trasferiti ai cianobatteri mediante trasformazione o elettroporazione sono vettori "suicidio" (cioè vettori integrativi che facilitano la ricombinazione omologa), mentre i vettori auto-replicanti possono essere trasferiti ai cianobatteri trasformazione, coniugazione o elettroporazione. Per il primo, è disponibile un protocollo per le specie di modelli di ingegneria suscettibili alla trasformazione naturale11. Più recentemente, è stato sviluppato un kit di strumenti modulare di clonazione (MoClo) per cianobatteri chiamato CyanoGate che impiega un metodo standardizzato di assemblaggio vettoriale Golden Gate per l'ingegneria utilizzando la trasformazione naturale, l'elettroporazione o la coniugazione12.

Le tecniche di assemblaggio di tipo Golden Gate sono diventate sempre più popolari negli ultimi anni, e gli standard di assemblaggio e le librerie di parti sono ora disponibili per una varietà di organismi13,14,15,16 ,17. Golden Gate utilizza enzimi di restrizione IIS di tipo (ad esempio, BsaI, BpiI, BsmBI, Btg-I e AarI) e un'azione di accettatori e sbalzi univoci per facilitare l'assemblaggio gerarchico direzionale di sequenze multiple in una reazione di assemblaggio "one pot". Gli enzimi di restrizione IIS di tipo Riconoscono una sequenza asimmetrica unica e tagliano una distanza definita dai loro siti di riconoscimento per generare un taglio sfalsato e "estremità appiccicosa" (in genere una sporgenza di 4 nucleotidi [NT]), che può essere successivamente sfruttata per guidare il DNA ordinato reazioni di assemblaggio15,18. Ciò ha facilitato lo sviluppo di grandi librerie di parti modulari di livello 0 (ad esempio, promotori, frame di lettura aperti e terminatori) definiti da una sintassi comune, come lo standard PhytoBricks19. Le parti di livello 0 possono quindi essere facilmente assemblate in cassette di espressione di livello 1, in seguito alle quali gli assiemi di ordine superiore più complessi (ad esempio, costrutti di espressione multigenetica) possono essere compilati in un vettore di accettazione scelto12,15. Un vantaggio chiave delle tecniche di assemblaggio di tipo Golden Gate è la loro amenabilità all'automazione in impianti ad alta produttività, come le fonderie di DNA20,21, che possono consentire il test di progetti sperimentali complessi che non può essere facilmente raggiunto con il lavoro manuale.

CyanoGate si basa sul sistema Plant MoClo12,15. Per incorporare una nuova parte in CyanoGate, la sequenza di parti deve prima essere addomesticata, cioè i siti di riconoscimento "illegali" per BsaI e BpiI devono essere rimossi. Nel caso di una parte codifica per un frame di lettura aperto (cioè una sequenza di codifica, CDS), i siti di riconoscimento possono essere interrotti generando mutazioni sinonimi nella sequenza (cioè, cambiando un codone in un'alternativa che codifica per lo stesso residuo di amminoacidi). Ciò può essere ottenuto da una varietà di approcci, che vanno dalla sintesi del DNA alla reazione a catena polimerasi (PCR) strategie basate sull'amplificazione come Gibson assembly22. A seconda dell'espressione host utilizzato, si dovrebbe fare attenzione a evitare l'introduzione di codoni rari che potrebbero inibire l'efficienza della traduzione23. La rimozione dei siti di riconoscimento nelle sequenze promotore e terminatore è in genere un'impresa più rischiosa, poiché le modifiche possono influire sulla funzione e la parte potrebbe non funzionare come previsto. Ad esempio, le modifiche ai siti di binding del fattore di trascrizione putativa o al sito di legame del ribosoma all'interno di un promotore potrebbero alterare la forza e la reattività all'induzione/repressione. Allo stesso modo, le modifiche alle caratteristiche strutturali principali del terminatore (ad esempio, il gambo ricco di GC, il loop e la coda poli-U) possono modificare l'efficienza di terminazione e l'espressione genica effetto24,25. Sebbene siano disponibili diverse risorse online per prevedere l'attività delle sequenze promotore e terminatore e informare se una mutazione proposta influirà sulle prestazioni26,27, questi strumenti sono spesso scarsi predittori di prestazioni in cianobatteri28,29,30 . Di conseguenza, si raccomanda ancora la caratterizzazione in vivo delle parti modificate per confermare l'attività. Per facilitare la clonazione delle sequenze recalcitranti, CyanoGate include un vettore dell'accettatore di clonazione a bassa copia basato sul vettore BioBrick pSB4K512,16,31. Inoltre, un portale "Design and Build" è disponibile attraverso la Edinburgh Genome Foundry per aiutare con la progettazione vettoriale (dab.genomefoundry.org). Infine, e soprattutto, CyanoGate include due progetti di vettori dell'accettatore di livello T (equivalenti ai vettori dell'acceleratore di livello 2)15 per l'introduzione di DNA nei cianobatteri utilizzando vettori suicidi o vettori di gamma ospite di ampio tipo in grado di auto-replicarsi in diverse specie cianobatteriche32,33,34.

Qui ci concentreremo sulla descrizione di un protocollo per la generazione di vettori auto-replicanti di livello T e la modificazione genetica di Synechocystis PCC 6803 e Synechococcus elongatus UTEX 2973 (Synechocystis PCC 6803 e S. elongatus UTEX 2973 in seguito) per coniugazione (noto anche come accoppiamento triparentale). Il trasferimento coniugale di DNA tra cellule batteriche è un processo ben descritto ed è stato precedentemente utilizzato per l'ingegneria di specie cianobatteriche, in particolare quelle che non sono naturalmente competenti, come S. elongatus UTEX 297335, 36,37,38,39,40,41. In breve, le colture cianobatteriche vengono incubate con un ceppo E. coli che trasporta il vettore da trasferire (il vettore "cargo") e vettori (nella stessa deformazione E. coli o in ceppi aggiuntivi) per consentire la coniugazione ("mobilizer" vettori "helper"). Per il trasferimento coniugale sono necessarie quattro condizioni chiave: 1) il contatto diretto tra le cellule coinvolte nel trasferimento del DNA, 2) il vettore di carico deve essere compatibile con il sistema di coniugazione (cioè deve contenere un'origine adeguata del trasferimento (oriT), noto anche come bom (base di mobilità) sito), 3) una proteina di nicking del DNA (ad esempio, codificata dal gene della mafia) che intacca il DNA all'oriT per avviare il trasferimento a filamento del DNA nel cianobatterio deve essere presente ed esprimere vettori di carico o di supporto, e 4) il DNA trasferito non deve essere distrutto nel cianobatterio ricevente (cioè, deve essere resistente alla degradazione da, ad esempio, restrizione endonuclease attività)35,42. Affinché il vettore di carico persista, l'origine della replica deve essere compatibile con il cianobatterio ricevente per consentire l'auto-replicazione e la proliferazione nelle cellule figlie dopo la divisione. Per aiutare con le condizioni 3 e 4, diversi vettori helper sono disponibili attraverso Addgene e altre fonti commerciali che codificano per la mafia così come diverse metile per proteggere da endonucleasi nativi nel cianobatterio ospite43. In questo protocollo, la coniugazione è stata facilitata da un ceppo MC1061 E. coli che trasporta vettori mobilitatori e aiutanti pRK24 (www.addgeneorg/51950) e pRL528 (www.addgene.org/58495). Quando si scelgono i vettori da utilizzare per il trasferimento coniugale, occorre prestare attenzione. Ad esempio, nel kit CyanoGate il vettore cargo auto-replicante pPMQAK1-T codifica per una proteina Mob12. Tuttavia, pSEVA421-T non44e come tale, mob deve essere espresso da un vettore helper adatto. Anche i vettori utilizzati devono essere appropriati per l'organismo bersaglio. Ad esempio, un trasferimento efficiente dei coniugali in Anabaena sp. PCC 7120 richiede un vettore helper che protegga il vettore mobilitante dalla digestione (ad esempio, pRL623, che codifica per le tre metilasi AvaiM, Eco47iiM ed Ecot22iM)45, 46.

In questo protocollo viene ulteriormente descritto come caratterizzare le prestazioni delle parti (cioè promotori) con un marcatore fluorescente utilizzando un lettore di lastre o un citometro di flusso. I citometri di flusso sono in grado di misurare la fluorescenza su una singola base cellulare per una grande popolazione. Inoltre, i citometri di flusso consentono agli utenti di "portare" i dati acquisiti e rimuovere il rumore di fondo (ad esempio, dal particolato nella coltura o nella contaminazione). Al contrario, i lettori di placche acquisiscono una misurazione a fluorescenza aggregata di un dato volume di cultura, tipicamente in diversi pozzi replicanti. I principali vantaggi dei lettori di placche rispetto ai citometri includono il costo più basso, una maggiore disponibilità e in genere nessun requisito per software specializzato per l'analisi dei dati a valle. I principali inconvenienti dei lettori di placche sono la sensibilità relativamente più bassa rispetto ai citometri e potenziali problemi con la densità ottica delle culture misurate. Per le analisi comparative, i campioni di lettori di placche devono essere normalizzati per ogni pozzo (ad esempio, ad una misurazione della densità di coltura, generalmente presa come assorbimento alla densità ottica a 750 nm [OD750]), il che può portare a imprecisioni per i campioni troppo denso e/o non ben miscelato (ad es. quando è soggetto ad aggregazione o flocculazione).

Come panoramica, qui dimostriamo in dettaglio i principi di generazione di parti di livello 0, seguiti dall'assemblaggio gerarchico utilizzando il kit CyanoGate e la clonazione in un vettore adatto per il trasferimento coniugale. Dimostriamo quindi il processo di trasferimento coniugale, la selezione di ceppi transconiugici transconiugici che esprimono un marcatore fluorescente e la successiva acquisizione di dati di fluorescenza utilizzando un citometro di flusso o un lettore di lastre.

Protocollo

1. Assemblaggio vettoriale con i toolkit Plant MoClo e CyanoGate

NOTA: Prima di procedere con l'assemblaggio vettoriale, si consiglia vivamente agli utenti di familiarizzare con le strutture a livello vettoriale dei sistemi Plant e CyanoGate MoClo12,15.

  1. Costruzione di parti di livello 0
    NOTA: le parti di livello 0 possono essere sintetizzate come vettori completi o sequenze lineari per l'assieme con accettatori di livello 0 (ad esempio, gBlocks, IDT). In alternativa, le sequenze possono essere amplificate da un modello di origine (ad esempio, un vettore o un DNA genomico purificato). Qui viene descritto come generare una nuova parte di livello 0 da un prodotto amplificato. Una panoramica del processo di assemblaggio di Golden Gate dal livello 0 al livello T è mostrata inFigura 1.
    1. Progettare i primer.
      1. Decidere quale modulo di livello 0 assemblare e identificare le sporgengie appropriate 5 e 3 (Tabella 1)12,15. Controllare la sequenza di DNA da clonare per la presenza di siti di restrizione BpiI o BsaI.
        NOTA: una sequenza contenente uno di questi siti deve essere addomesticata modificando uno o più NT nella sequenza del sito di restrizione. Una strategia per eseguire questa operazione utilizzando l'assembly Golden Gate è descritta nella Figura 2.
      2. Per amplificare una sequenza di DNA, progettare una coppia di primer in avanti e indietro appropriata. Per il primer in avanti, selezionare 18-30 bp complementari all'estremità 5 o più della sequenza del modello di DNA. Per il primer inverso, selezionare 18-30 bp reverse complementare all'estremità 3 o più della sequenza del modello di DNA.
        NOTA: I motociclisti con temperature di fusione (Tm) di 58,62 gradi centigradi danno in genere i risultati di amplificazione più coerenti (Figura 1A).
      3. Aggiungere quanto segue all'estremità 5' del primer in avanti: 1) una stringa casuale di 4-6 NT alla fine 5 del sito BpiI, 2) il sito di restrizione BpiI (GAAGAC), 3) due NT casuali e 4) la sporgenza 5 o più selezionata nel passaggio 1.1.1.1. Aggiungere quanto segue all'estremità 5' del primer inverso: 1) una stringa casuale di 4-6 NT alla fine 5 del sito BpiI, 2) il sito di restrizione BpiI (GAAGAC), 3) due NT casuali e 4) la sporgenza di 3 gradi selezionata nel passaggio 1.1.1.1. Una volta finalizzate, ordinare le coppie di primer.
        NOTA: Vedere la figura 1A per un esempio di coppia di primer in avanti e inversa.
    2. Amplifica una sequenza di DNA dal DNA genomico.
      1. Estrarre il DNA genomico come descritto nella sezione 5. Amplifica i prodotti PCR utilizzando una polimerasi del DNA ad alta fedeltà (Tabella dei materiali).
        NOTA: Ad esempio, impostare le reazioni PCR (20-50 gradi centigradi) secondo le istruzioni del produttore. Usa 100 dollari di DNA genomico per reazione. Utilizzare un programma di ciclismo termico costituito da una fase iniziale di denaturazione di 98 gradi centigradi per 30 s, seguita da non più di 25 cicli di denaturazione a 98 gradi centigradi per 10 s, primer annealing a 58 s per 15 s e l'estensione del prodotto a 72 s per 30 s (modificare quest'ultimo a seconda del dimensioni del prodotto/tipo di polimerasi del DNA utilizzato), seguita da una fase di estensione finale di 72 gradi centigradi per 2 min.
      2. Se il prodotto PCR deve essere purificato in gel, eseguire l'intera reazione PCR su un gel di agarose come descritto nella sezione 6. Tagliare la banda di interesse dal gel di agarose e purificarla utilizzando un kit di estrazione gel (Tabella dei materiali).
      3. Alternativa al passaggio 1.1.2.2, se il prodotto PCR deve essere utilizzato senza purificazione del gel, verificare la dimensione della banda eseguendo un campione di reazione PCR (5 dollari ll) su un gel di agarose. Se il gel mostra solo la banda appropriata e nessuna prova di dimeri primer, purificare il prodotto PCR utilizzando un kit di purificazione del DNA (Tabella dei materiali).
      4. Elute DNA purificato in un piccolo volume di acqua deionizzata (ad es., 10 l) per ottenere un'alta concentrazione di DNA (>20 ng/L è in genere sufficiente).
    3. Assemblare il prodotto (o i prodotti del DNA amplificato, vedere la figura 2) nel livello 0. Preparare un mix di reazione di 20 -L con BpiI (Figura 1B) e impostare il programma del ciclore termico come descritto nella tabella 2. Procedere alla trasformazione di E. coli utilizzando 5 :L della miscela di reazione assemblata di livello 0 (come descritto nella sezione 2).
  2. Costruzione di assiemi di livello 1
    1. Decidere quali parti di livello 0 assemblare (Figura 1C e Tabella 1). Scegliere un vettore di accettazione di livello 1 appropriato15.
      NOTA: In questa fase è importante sapere quale sarà il design finale del vettore nel livello T, in quanto ciò influirà sulla scelta del vettore dell'accettatore di livello 1. La posizione di livello 1 (Avanti) vettore di accettazione (pICH47732) può essere utilizzato come predefinito se l'obiettivo è quello di avere un singolo assieme di livello 1 (ad esempio, una cassetta di espressione genica) nel livello T. Tuttavia, se due o più assiemi di livello 1 devono essere assemblati nel livello T, è necessario considerare la posizione e la direzione di ogni assieme di livello 1. È possibile assemblare fino a sette assiemi di livello 1 in un vettore dell'acceleratore di livello T utilizzando vettori di acceleratore di livello 1 con posizioni appropriate12.
    2. Assemblare le parti di livello 0 nel livello 1. Preparare un mix di reazione di 20 -L con BsaI e impostare il programma del ciclore termico come descritto nella tabella 2. Procedere alla trasformazione di E. coli utilizzando 5 :L della miscela di reazione di livello 1 assemblata (come descritto nella sezione 2).
  3. Costruzione di assiemi di livello T
    1. Decidere quali assiemi di livello 1 assemblare (Figura 1D). Scegliere un vettore di accettazione di livello T appropriato.
      NOTA: pUC19A-T (resistenza all'ampicillina) e pUC19S-T (resistenza alla spettronomicina) sono vettori integrativi di numero ad alta copia che non sono in grado di replicarsi nei cianobatteri e sono utilizzati principalmente per l'integrazione genomica (ad esempio, knock-in o knock-out di geni) tramite ricombinazione omologa12. La consegna di vettori integrativi può procedere con la trasformazione naturale in amabili specie cianobatteriche11. pPMQAK1-T è un ampio range host, vettore replicativo fornito tramite trasferimento coniugale (sezione 3).
    2. Scegliere un fine-link appropriato per sigarare l'estremità di 3 gradi dell'assieme di livello 1 finale alla backbone Livello T15.
      NOTA: il Collegamento finale richiesto è lo stesso numero della posizione della parte finale. Ad esempio, un vettore di livello T con una sola parte di posizione di livello 1 (avanti o indietro) richiederà End-Link 1 (pICH50872) per la legatura nella backbone di livello T.
    3. Assemblare uno o più assiemi di livello 1 nel livello T. Preparare una combinazione di reazione con BpiI e il vettore End-Link richiesto e impostare il programma del ciclore termico come descritto nella tabella 2. Procedere alla trasformazione di E. coli utilizzando 5 :L del mix di reazione di livello T assemblato (come descritto nella sezione 2).

2. Trasformazione di E. coli e purificazione vettoriale

  1. Trasformazione di E. coli (giorno 1)
    1. Scongelare un'aliquota (25- L) di cellule E. coli chimicamente competenti (Tabella dei materiali) e pipetta delicatamente in un tubo da 1,5 mL sul ghiaccio. Aggiungete 5-L della miscela di assiemi (Livello 0, 1 o T) e incubate il tubo sul ghiaccio per altri 30-60 min.
    2. Le cellule di shock termico incubano il tubo in un bagno d'acqua a 42 gradi centigradi per 30 s, quindi riporre il tubo sul ghiaccio per 2 min. Incubare il tubo a 37 gradi centigradi per 1 h a 225 giri in un'incubatrice agitazione.
    3. Piastra 40 -L della coltura su una piastra di agar LB contenente l'appropriata concentrazione finale di antibiotici (100 g/mL per la spettromicina didihydrochloride pentahydrate [Livello 0], 100 g/mL di carcillina disodio [Livello 1], o 50 g/mL di solfato di canamicina [ Livello T]), 1 mM isopropil-beta-D-thiogalactopyranoside (IPTG) e 40 g/mL di 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-z-D-galactopyranoside (X-Gal) per lo screening blu-bianco. Incubare la piastra per una notte a 37 gradi centigradi.
      NOTA: La quantità di coltura placcata può essere variata a seconda dell'efficienza delle cellule competenti di E. coli e della reazione di legatura. Piastrare un volume maggiore se si osservano colonie <10 dopo l'incubazione notturna.
  2. Selezione delle colonie bianche e preparazione delle colture liquide (giorno 2)
    NOTA: a seconda dell'efficienza della reazione di assemblaggio e della successiva trasformazione, le piastre di agar LB non possono contenere colonie, colonie blu o colonie bianche (Figura 3). Le colonie blu sono indicative di vettori accettanti che non hanno subito restrizioni (cioè, è ancora presente una copia funzionale di lac. Le colonie bianche indicano che la cassetta dell'espressione lac è stata persa e sostituita da una parte/assemblaggio.
    1. Facoltativamente, verificare che le colonie bianche contengano il vettore previsto eseguendo la PCR come descritto nella sezione 7.
    2. Scegli colonie bianche singole (o colonie verificate PCR) con una punta di 10 gradini e trasferiscili su un tubo di centrifuga da 15 mL contenente un supporto LB (5 mL) e concentrazioni antibiotiche appropriate (fase 2.1.3). Incubare i tubi a 37 gradi durante la notte a 225 giri/min in un'incubatrice che trema.
  3. Purificazione vettoriale plasmide (giorno 3)
    1. Facoltativamente, preparare uno stock di glicerolo della cultura e. coli durante la notte per criostoccaggio a lungo termine di vettori. Aggiungete 500 llitri di coltura batterica a 500 - L del 50% (v/v) glicerolo in un tubo appropriato da 1,5,2,0 mL per crioregistratolo a -80 gradi centigradi. Mescolare delicatamente invertendo 5-10x. Congelare i campioni in azoto liquido e conservarli in un congelatore a -80 gradi centigradi.
    2. Scartare le colture in tubi centrifuga da 15 mL a 3.000 x g per 5-10 min. Scartare il supernatante senza disturbare il pellet cellulare. Purificare il vettore utilizzando un kit di purificazione plasmide (Tabella dei materiali). Vettore purificato in 35 - L di acqua deionizzata.
      NOTA: Utilizzare volumi di eluizione inferiori per aumentare ulteriormente la concentrazione vettoriale. Lo stesso eluente può essere messo attraverso una colonna di purificazione due volte per aumentare i rendimenti.
    3. Misurare la concentrazione del vettore nell'eluente utilizzando uno spettrofotometro (Tabella dei materiali).
      NOTA: I vettori di numero di copia alti in E. coli, ad esempio pUC19, in genere forniscono rendimenti di 50/300 ng/L. Vettori di numeri di copia bassi, ad esempio pPMQAK1-T, in genere danno rendimenti di 15/60 ng/L.
  4. Convalida vettoriale
    NOTA: i vettori possono essere verificati mediante digestione delle restrizioni (passaggio 2.4.1) e/o sequenziamento (passaggio 2.4.2).
    1. Limitare 0,5 o 1 g di vettore con uno o più enzimi di restrizione appropriati e verificare le dimensioni previste della banda, come descritto nella sezione 6(Figura 4).
      NOTA: le dimensioni delle bande errate indicano in genere un assieme errato, nel qual caso è possibile vagliare più colonie bianche o ripetere l'assemblaggio. BsaI e BpiI possono essere utilizzati per convalidare la dimensione corretta dell'inserto rispettivamente per gli assiemi di livello 0 e livello 1. BsaI o BpiI possono essere utilizzati in combinazione con un ulteriore enzima di restrizione compatibile che taglia all'interno dell'inserto e/o della spina dorsale vettoriale per produrre una serie distinta di bande ben separate dopo la digestione.
    2. Sequenziare il vettore mediante sequenziamento Sanger utilizzando un'appropriata primer a monte della regione assemblata utilizzando l'impianto di sequenziamento commerciale (Tabella 3).
      NOTA: tutte le nuove parti di livello 0 devono essere sequenziate per confermare l'identità della sequenza prevista. La convalida della sequenza dei vettori di livello 1 e T non è in genere necessaria se assemblata da parti di livello 0 precedentemente sequenziate.

3. Generazione di mutanti per coniugazione

NOTA: Qui, viene descritto un protocollo per il trasferimento coniugale di un vettore cargo auto-replicante in Synechocystis PCC 6803 o S. elongatus UTEX21,47. Questo protocollo è applicabile ad altre specie modello (ad esempio, S. elongatus PCC 7942 e Synechococcus sp. PCC 7002). Tutto il lavoro con i cianobatteri (e i preparati tamponati associati) deve essere fatto in condizioni sterili in una cappa a flusso laminare.

  1. Crescita della coltura cianobatterica (giorno 1)
    1. Preparare il mezzo BG11 secondo le piastre Lea-Smith et al.11e le piastre di agar con l'LB-BG11 e il BG11-Kan50 (sezione 8).
    2. Impostare una nuova coltura di Synechocystis PCC 6803 o S. elongatus UTEX 2973 inoculando un fiaschetta conica da 100 ml di mezzo BG11 fresco (50 mL) con cellule provenienti da una piastra di agar BG11 ascia ascia ascia. Coltiva le colture Synechocystis PCC 6803 a 30 gradi centigradi, 100 fotoni m-2s-1 a 100 giri/m e coltiva S. elongatus UTEX 2973 a 40 gradi, 300 fotoni mol m-2s -1 a 100 giri/m. Crescere le culture fino a quando OD750 - 0,5-1,5 (tipicamente 1/2 giorni).
      NOTA: le colture S. elongatus UTEX 2973 possono essere coltivate a 40 gradi centigradi in alta intensità luminosa (ad es., 2000 fotoni mol m-2s-1)48.
  2. Crescita dei ceppi helper e cargo E. coli (giorno 2)
    1. Inoculato LB medio contenente ampicillina (concentrazione finale 100 g/mL) e cloramfenicolo (concentrazione finale 25 g/mL) con un ceppo MC1061 E. coli contenente vettori pRK24 e pRL528 (cioè il ceppo di supporto) e crescono a 37 gradi durante la notte a 225 m in un incubatore tremante. Crescere un volume sufficiente di coltura di deformazione aiutante, supponendo che 1 mL di coltura è necessario per coniugazione.
    2. Inoculare LB medio (5 mL) contenente antibiotici appropriati con la coltura E. coli che trasporta il vettore di carico (cioè un vettore di livello T). Coltivare la coltura a 37 gradi centigradi durante la notte a 225 giri/min in un'incubatrice tremante.
  3. Trasferimento coniugale (accoppiamento triparentale) (giorno 3)
    1. Preparare l'aiutante E. coli e ceppi di carico. Centrifugare l'aiutante e il carico E. coli durante la notte colture a 3.000 x g per 10 min a temperatura ambiente. Scartare il supernatante senza disturbare il pellet cellulare.
    2. Lavare il pellet aggiungendo un mezzo LB fresco senza antibiotici. Utilizzare lo stesso volume delle impostazioni cultura iniziali. Risospendere il pellet pipettando delicatamente su e giù. Non vorticare la cultura. Ripetere questo passaggio 3x per rimuovere gli antibiotici residui dalla coltura durante la notte.
    3. Centrifugare la coltura risospesa (come nel passaggio 3.3.1), eliminare il supernatante e rispendere a metà il volume del supporto LB del volume di coltura iniziale (ad esempio, 2,5 mL se la cultura durante la notte era di 5 mL). Unire 450 l del ceppo di ausilio con 450 l della deformazione del carico in un tubo da 2 mL e mettere da parte (lasciare a RT) fino al punto 3.3.6.
    4. Preparare la coltura cianobatterica. Per ogni reazione di coniugazione, usate 1 mL di coltura cianobatterica (OD750 - 0,5,5).
    5. Centrifugare il volume totale richiesto di coltura cianobatterica a 1.500 x g per 10 min a RT, quindi scartare il supernatante con attenzione senza disturbare il pellet cellulare. Lavare il pellet aggiungendo un nuovo mezzo BG11 dello stesso volume iniziale. Risospendere il pellet da pipeting delicatamente su e giù, non vorticare la coltura. Ripetere questo passaggio 3x e mettere da parte la coltura lavata.
    6. Aggiungete una varietà di coltura cianobatterica lavata (900) ai ceppi combinati di E. coli (helper e cargo) (900 l) in un tubo da 2 mL. Mescolare le culture pipeting delicatamente su e giù. Non vortice. Incubare la miscela a RT per 30 min per Synechocystis PCC 6803 o 2 h per S. elongatus UTEX 2973.
    7. Centrifugare la miscela a 1.500 x g per 10 min a RT. Rimuovere 1,6 mL del sovrentrato. Risospendere il pellet nei restanti 200 dollari l'una di super-natante. Posizionare un filtro di membrana da 0,45 m su una piastra di agar LB-BG11 priva di antibiotici (sezione 8). Diffondere con cura 200 -L della coltura E. coli/cyanobacterial mix sulla membrana con uno spalmatore sterile o una punta sterile piegata e sigillare la piastra con pellicola di paraffina.
    8. Incubare la piastra LB-BG11 con la membrana per 24 h. Mantenere le membrane con colture Synechocystis PCC 6803 a 30 , 100 di fotoni mol m-2s-1. Mantenere le membrane con le colture S. elongatus UTEX 2973 a 40 gradi centigradi in 150 fotoni mol m-2s-1.
  4. Trasferimento di membrana
    1. Dopo 24 h, trasferire con attenzione la membrana utilizzando pinze sterilizzate a fiamma in una piastra di agar BG11 fresca contenente antibiotici appropriati (sezione 8) da selezionare per il vettore di carico. Sigillare la piastra con pellicola di paraffina.
    2. Incubare la placca di agar BG11 in condizioni di crescita appropriate, come descritto sopra per Synechocystis PCC 6803 o S. elongatus UTEX 2973, fino a quando non compaiono colonie.
      NOTA: le colonie appaiono in genere dopo 7-14 giorni per Synechocystis PCC 6803 e 3/7 giorni per S. elongatus UTEX 2973.
  5. Selezione di coniugati
    NOTA: Solo le colonie cianobatteriche che trasportano il vettore di carico saranno in grado di crescere sulla membrana (Figura 5).
    1. Utilizzando un ciclo sterile di calore, selezionare almeno due colonie individuali dalla membrana e striscia su una nuova piastra di agar BG11 contenente antibiotici appropriati (Figura 5C).
      NOTA: le colonie appena striate possono ancora essere contaminate da E. coli trasportate dalla coniugazione (cioè se piccole colonie bianche sono evidenti sulla piastra), quindi due o tre ulteriori giri di re-streaking su piastre fresche di agar BG11 sono tipicamente necessario per ottenere una coltura cianobatterica ascia.
    2. Confermare l'assenza di contaminazione da E. coli inoculando una striscia di coltura cianobatterica in un tubo centrifugato rel da 15 mL contenente 5 mL di LB medio e incubando a 37 gradi durante la notte a 225 giri/m in un'incubatrice tremante. Dopo un periodo di crescita sufficiente (7 giorni), scegli singole colonie axeniche per creare colture liquide per criostorage a lungo termine o sperimentazioni successive.
  6. Crioconservazione dei ceppi cianobatterici
    1. Coltiva una coltura liquida cianobatterica in BG11 (come descritto nella sezione 3.1) fino all'OD750 x 1,5-3,0. Centrifuga 10 mL di coltura per 10 min a 1.500 x g, rimuovere il supernatante e risospendere le cellule in 5 mL di medio BG11 fresco.
    2. Aggiungere 3,5 mL di autoclave sterilizzato 50% (v/v) glicerolo per una concentrazione finale di glicerolo di49. Questo approccio funziona bene per Synechocystis PCC 6803. In alternativa, aggiungere 5 mL di filtro sterilizzato BG11 contenente 16% (v/v) di zolfo dimetilo (DMSO) per una concentrazione finale di DMSO di 8% (v/v)50. Questo approccio è consigliato per la maggior parte dei ceppi, tra cui S. elongatus UTEX 2973.
      AVVISO: il DMSO è tossico e deve essere gestito con un'adeguata protezione.
    3. Mescolare delicatamente invertendo 5-10x. Subaliquot 1 mL di coltura in tubi a cappuccio a vite da 1,5 mL separati (Tabella dei materiali). Collocare i tubi in un congelatore a -80 gradi centigradi per la crioconservazione. Non congelare in azoto liquido.
      NOTA: si raccomandano almeno tre scorte per ceppo.
    4. Per il recupero, rimuovere un tubo dal congelatore -80 gradi centigradi e scongelare la coltura in un bagno d'acqua a 35 gradi mentre si mescola delicatamente. Aggiungere la cultura scongelata a 50 mL di medio BG11 fresco e crescere come coltura liquida (come descritto nella sezione 3.1).
      NOTA: In alternativa, la coltura può essere striata e coltivata su un piatto fresco di agar BG11. Le colture transgeniche che trasportano marcatori di selezione devono essere rivitalizzate inizialmente su piastre di agar BG11 senza antibiotici e poi restriate su piastre di agar BG11 con antibiotici appropriati.

4. Promotore caratterizzazione

NOTA: Qui viene descritto un approccio standard per analizzare la forza di una parte promotrice misurando i livelli di espressione di un marcatore fluorescente (eYFP) in seguito a un periodo di crescita di 72 h utilizzando un lettore di lastre o un citometro di flusso12.

  1. Crescita culturale
    1. Impostare colture di semi inoculando 10 mL di mezzo BG11 contenente antibiotici appropriati con una singola colonia del ceppo cianobatterico transgenico che porta la cassetta di espressione marcatore fluorescente. Preparare anche le colture di semi per ceppi di controllo negativi appropriati (ad esempio, un ceppo di tipo selvaggio e/o un ceppo transgenico che trasporta la stessa spina dorsale vettoriale ma privo della cassetta di espressione del marcatore fluorescente).
      NOTA: si raccomandano almeno quattro repliche biologiche.
    2. Coltiva le colture di semi per 48 h o fino a quando oD750
    3. Per tenere traccia dell'espressione del promotore nel tempo, misurare innanzitutto l'OD750 di ogni cultura del seme. Calcolare i requisiti di diluizione per portare ogni coltura a un OD750 iniziale - 0,2. Impostare campioni di coltura sperimentale diluiti (volume totale di 2 mL) in una piastra piatta di 24 pozze (Tabella dei materiali).
    4. Incubare la piastra in un incubatore di agitazione con luci LED bianche (Tabella dei materiali) in condizioni di crescita appropriate. Misurare la densità di crescita della coltura (OD750)e la fluorescenza delle proteine fluorescenti gialle (eYFP) potenziate utilizzando un lettore di lastre (sezione 4.2) o un citometro di flusso (sezione 4.3).
      NOTA: le impostazioni cultura Synechocystis PCC 6803 e S. elongatus UTEX 2973 possono essere coltivate come nel passaggio 3.1.2. Si raccomanda vivamente che la piastra sia mantenuta sotto un'elevata umidità (95%) per evitare l'evaporazione dei campioni di coltura.
  2. Lettore di piastre
    1. Mescolare brevemente le culture nella piastra 24-well (passaggio 4.1.4) con pipettaggio delicato. Trasferire un sottocampione di ciascuna coltura in una piastra nera piatta 96 po ' (Tabella dei materiali). Diluire se necessario (100 o l volume finale). Evitare la formazione di bolle in quanto questo può interferire con la precisione di misurazione.
      NOTA: Si consiglia di eseguire tutte le misurazioni su campioni in un intervallo OD750 di 0,2.1.0. Poiché la densità delle colture nel pozzo 24 aumenterà nel tempo, si raccomandano le seguenti diluizioni in base agli aumenti previsti delle condizioni di crescita standard: nessuna diluizione a 0 h, 1:4 a 24 h, 1:10 a 48 h e 1:10 a 72 h. Ad esempio, a 24 h raccogliere 25 - L di coltura e mescolare con 75 -L di BG11 medio.
    2. Includere due pozze vuote nella piastra del pozzo 96 (cioè 100 -L di Mezzo BG11). Mettere la piastra da 96-po in un lettore di piastra (Tabella dei materiali). Agitare la piastra per 60 s a 500 rpm utilizzando lo shaker orbitale nel lettore di piastre per mescolare i pozzetti.
      NOTA: Le colture cianobatteriche possono aggregarsi e/o flocculate, quindi una buona miscelazione è fondamentale prima della lettura per misurazioni accurate.
    3. Misurare la fluorescenza OD750 e eYFP con lunghezze d'onda di eccitazione/emissione a 485 nm/520 nm.
    4. Sottrarre la media delle misurazioni OD750 dei due pozzi vuoti dalla misura OD750 di ogni pozzo campione contenente coltura cianobatterici.
    5. Normalizzare i valori di fluorescenza di ogni campione di coltura dividendo la misurazione della fluorescenza eYFP (passaggio 4.2.3) per l'OD750 regolato della coltura (passaggio 4.2.4). Quindi, sottrarre il valore medio di fluorescenza eYFP normalizzato (eYFP fluorescenza/OD750)delle repliche biologiche di un adeguato ceppo di controllo negativo dai ceppi transgenici che trasportano la cassetta di espressione eYFP.
      NOTA: I cianobatteri fluorescenza naturale a causa della presenza di pigmenti, come clorofilla e phycobiliproteine.
    6. Crescita della coltura di trama nel tempo (Figura 6A) e i valori medi di fluorescenza eYFP normalizzati di ogni coltura sperimentale nei punti temporali desiderati (ad esempio, 72 h; Figura 6B).
  3. Cilindro di flusso
    1. Scegliere una piastra compatibile per il sistema di movimentazione del liquido del citometro a flusso. Ad esempio, utilizzare una piastra di 96 pozzeri abbondante (Tabella dei materiali) con il citometro di flusso ( Tabella deimateriali) utilizzato in questo protocollo.
    2. Mescolare brevemente le culture nella piastra 24-well (passaggio 4.1.4) con pipettaggio delicato. Diluire le colture a OD750 - 0,1,0,2 per evitare ostruzioni nel sistema di movimentazione dei liquidi. Aggiungere un volume appropriato di campione di coltura alla piastra di 96 pozze e portare ad un volume finale di 250 gradi con salina con buffer fosfato sterilizzato a filtro 1x (PBS) con buffer di fosfato. Includere un pozzetto bianco per la soluzione media sulla piastra contenente 60 -L di BG11 e 190 -L di 1x PBS.
      NOTA: questo volume è consigliato nel caso in cui sia necessario eseguire nuovamente i campioni. I volumi superiori a 250 L non sono raccomandati in quanto il volume massimo di ogni pozzo è di 300 .
    3. Una volta che il citometro di flusso è pronto per l'uso, posizionare la piastra da 96 pozzetto con campioni di coltura nella stazione di movimentazione dei liquidi. Impostare il protocollo software per il citometro di flusso per raccogliere le misurazioni di 10.000 singoli eventi (ad esempio, le celle). Misurare la fluorescenza eYFP con lunghezze d'onda di eccitazione/emissione di 488 nm/515-545 nm. Misurare innanzitutto e controllare la lettura dal pozzo vuoto (Figura 7A), quindi eseguire i campioni.
    4. Cancellare la popolazione di cellule cianobatteriche all'interno dei set di dati di dispersione in avanti e laterale, escluse le regioni comuni con la lettura in bianco (Figura 7B). Sottrarre i valori medi di fluorescenza eYFP delle repliche biologiche di un adeguato ceppo di controllo negativo dai ceppi transgenici che trasportano l'espressione eYFP cassetta (Figura 7C,D). Tracciare la media dei valori di fluorescenza mediana per cellula per ogni coltura sperimentale nei punti temporali desiderati (ad esempio, 72 h; Figura 7E).

5. Estrazione del DNA genomico dai cianobatteri

NOTA: il protocollo riportato di seguito utilizza un kit di estrazione del DNA commerciale (Tabella dei materiali).

  1. Coltiva una coltura liquida cianobatterica in BG11 (come descritto nella sezione 3.1) fino all'OD750 x 1,5-3,0. Girare giù di 10 mL di coltura a 3.000 x g per 10 min e scartare il supernatante. Congelare il pellet incubando i tubi a -20 gradi centigradi per 30 min.
  2. Aggiungere 400 l of lysis buffer (buffer AP1) e 400 L di soluzione ribonucleato (RNase A) e 50% (w/v) di perline di vetro (diametro di 0,5 mm). Interrompere i campioni utilizzando un mulino a perline (Tabella dei materiali) a 30 Hz (cioè, equivalente a 1.800 oscillazioni/min) per 6 min.
  3. Girare il campione a 17.000 x g per 5 min e trasferire con attenzione il supernatante in un nuovo tubo e scartare il pellet. Procedere secondo le istruzioni del fabbricante (Tabella dei materiali).

6. Elettroforesi gel di agarose

  1. Lanciare un gel di agarose dell'1% (w/v) contenente 0,02% (v/v) bromuro di etidio. Caricare i campioni e un riferimento appropriato alla scala del DNA.
  2. Eseguire i campioni per 50 min a 125 V. Controllare la separazione della banda su un transilluminatore ultravioletto (UV).
    NOTA: il tempo di esecuzione e la percentuale di gel di agarose possono essere modificati per adattarsi alle dimensioni della banda previste. Ad esempio, una percentuale più alta di gel di agarose e tempi di esecuzione più lunghi possono migliorare la risoluzione della banda e la separazione dei prodotti DNA <500 bp.

7. Colonia PCR

  1. Impostare una combinazione di reazione PCR utilizzando un kit standard (Tabella dei materiali) e una combinazione appropriata di primer (ad esempio, primer che fiancheggiano la regione di assemblaggio o sono specifici delle sequenze all'interno della regione di assemblaggio ( Tabella3). Pipetta 10 - L in un tubo PCR.
  2. Toccare delicatamente la parte superiore di una singola colonia bianca con uno stuzzicadenti sterile o una punta di pipetta da 10 l'e inoculare un tubo PCR contenente il mix di reazione PCR. Fare attenzione a contrassegnare la colonia e abbinare con il tubo PCR specifico. Mescolare delicatamente il mix di reazione per garantire che le cellule E. coli vengano versate nella soluzione.
  3. Amplifica i prodotti pcR. Utilizzare un programma costituito da una fase iniziale di denaturazione di 95 gradi centigradi per 60 s, 30 colpi di 95 s per 15 s, 58 gradi centigradi per 15 s (pochi gradi al di sotto dei valori Tm dei primer) , 72 gradi centigradi per 30 s (30 s/kb di inserto) , seguito da un passaggio di estensione finale di 72 gradi centigradi per 5 min.

8. Preparazione del supporto BG11 e piastre

  1. Preparare soluzioni stock di 100x BG11 medio, ferro (citrato ferrico ammonio), oligoelementi, fosfato (K2HPO4), Na2CO3 e TES buffer secondo Lea-Smith et al.11. Autoclave fosfato e Na2CO3 stock. Utilizzare filtri da 0,2 m per filtrare sterilizzare il buffer TES (pH 8.2) e le soluzioni stock NaHCO3.
  2. Preparare 1 L di BG11 medio. Mescolare 10 mL di 100x BG11, 1 mL di oligoelementi e 1 mL di brodo di ferro e autoclave la soluzione con 976 mL di acqua. Una volta che la soluzione si è raffreddata a RT, aggiungere 1 mL di brodo di fosfato, 1 mL di Na2CO3 stock e 10 mL di NaHCO3e regolare al pH 7.6.7.8 con 1 M HCl.
  3. Piastre di agar LB-BG11 (1,5% [w/v])
    1. Unire 700 mL di acqua deionizzata e 15 g di agar in una fiaschetta di vetro. In un secondo flacone, aggiungere 186 mL di acqua, 10 mL di 100x BG11, 1 mL di oligoelementi e 1 mL di brodo di ferro. Autoclave entrambe le soluzioni.
    2. Una volta che le soluzioni si sono raffreddate a circa 60 gradi centigradi, combinarle e aggiungere 1 mL di brodo di fosfato, 1 mL di Na2CO3 stock, 10 mL di NaHCO3 stock e 50 mL di supporto sterile LB, che dovrebbe dare un volume finale di 1 L. Cast Petri piatti con 25 mL del mezzo agar LB-BG11.
  4. Piastre di agar BG11-Kan50 (1,5% [w/v])
    1. Unire 700 mL di acqua deionizzata e 15 g di agar in una fiaschetta di vetro. In un secondo flacone, aggiungere 3 g di tiosulfo di sodio (Na2S2O3),226 mL di acqua, 10 mL di 100x bG11 stock, 1 mL di oligoelementi e 1 mL di brodo di ferro. Autoclave entrambe le soluzioni.
    2. Una volta che le soluzioni si sono raffreddate a circa 60 gradi centigradi, combinarle e aggiungere 1 mL di stock di fosfato, 1 mL di stock di Na2CO3, 10 mL di brodo buffer TES e 10 mL di stock NaHCO3, che dovrebbe dare un volume finale di 1 L. Add kanamycin solfato ad una concentrazione finale di 50 g/mL e piatti Petri cast con 35 mL di media.

Risultati

Per illustrare il flusso di lavoro dell'assieme Golden Gate, una cassetta di espressione è stata assemblata nel vettore dell'accettatore di livello 1 (Avanti) (pICH47732) contenente le seguenti parti di livello 0: promotore dell'operone C-phycocyaninPpc560 (pC0.005), la sequenza di codifica per eYFP (pC0.008) e il doppio terminatore TrrnB (pC0.082)12. In seguito alla trasformazione della reazione di assemblaggio, le assemble...

Discussione

L'assemblaggio Golden Gate presenta diversi vantaggi rispetto ad altri metodi di assemblaggio vettoriale, in particolare in termini di scalabilità20,21. Tuttavia, la configurazione del sistema Golden Gate in laboratorio richiede tempo per sviluppare una familiarità con le varie parti e le librerie vettoriali dell'accettatore e i processi di assemblaggio complessivi. È spesso necessaria un'attenta pianificazione per assiemi più complessi o quando si esegue un ...

Divulgazioni

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Riconoscimenti

Gli autori sono grati alla rete PHYCONET PhyCONET Biotechnology and Biological Sciences Research Council (BBSRC) in Industrial Biotechnology and Bioenergy (NIBB) e all'Industrial Biotechnology Innovation Centre (IBioIC) per il sostegno finanziario. GARG, AASO e AP riconoscono il sostegno al finanziamento del programma BBSRC EASTBIO CASE PhD (numero di sovvenzione BB/M010996/1), del programma di dottorato Consejo Nacional de Ciencia y Tecnolog-a (CONACYT) e del programma di dottorato IBioIC-BBSRC Collaborative Training Partnership (CTP), rispettivamente. Ringraziamo Conrad Mullineaux (Queen Mary University of London) e Poul Eric Jensen e Julie Annemarie (Università di Copenaghen) per i contributi e i consigli sui vettori e sui protocolli plasmici.

Materiali

NameCompanyCatalog NumberComments
5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside (X-Gal)Thermo Fisher ScientificR0404Used in 2.1.3.
Adenosine 5′-triphosphate (ATP) disodium saltSigma-AldrichA2383Used in Table 2.
Agar (microbiology tested)Sigma-AldrichA1296-500gUsed in 8.3.
AgaroseBiolineBIO-41026Used in 6.
Attune NxT Flow CytometerThermo Fisher Scientific-Used in 4.3.1.
Bovine Serum Albumin (BSA)Sigma-AldrichA2153Used in Table 2.
BpiI (BbsI)Thermo Fisher ScientificER1011Used in Table 2.
BsaI (Eco31I)Thermo Fisher ScientificER0291Used in Table 2.
Carbenicillin disodiumVWR InternationalA1491.0005Used in 2.1.3.
Corning Costar TC-Treated flat-bottom 24 well platesSigma-AldrichCLS3527Used in 4.1.3.
Dimethyl Sulfoxide (DMSO)Thermo Fisher ScientificBP231-100Used in 3.6.2.
DNeasy Plant Mini KitQiagen69104DNA extraction kit. Used in 5.
FLUOstar Omega Microplate readerBMG Labtech-Used in 4.2.2.
GeneJET Plasmid Miniprep KitThermo Fisher ScientificK0503Plasmid purification kit. Used in step 2.3.2.
Glass beads (0.5 mm diameter)BioSpec Products11079105Used in 5.2.
GlycerolThermo Fisher Scientific10021083Used in 2.3.1, 3.6.2.
Isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside (IPTG)Thermo Fisher Scientific10356553Used in 2.1.3.
Kanamycin sulphate (Gibco)Thermo Fisher Scientific11815-024Used in 2.1.3.
Membrane filters (0.45 μm)MF-MilliporeHAWP02500Used in 3.3.7
Microplates, 96-well, flat-bottom (Chimney Well) µCLEARGreiner Bio-One655096Used in 4.2.1.
Monarch DNA Gel Extraction KitNew England BiolabsT1020SUsed in 1.1.2.2.
Monarch PCR DNA Cleanup KitNew England BiolabsT1030DNA purification kit. Used in 1.1.2.3.
Multitron Pro incubator with LEDsInfors HT-Shaking incubator with white LED lights. Used in 4.1.4.
MyTaq DNA PolymeraseBiolineBIO-21108Used in 7.1.
NanoDrop OneThermo Fisher ScientificND-ONE-WUsed in 2.3.3.
One Shot TOP10 chemically competent E. coliThermo Fisher ScientificC404010Used in 2.1.1.
Phosphate buffer saline (PBS) solution (10X concentrate)VWR InternationalK813Used in 4.3.2.
Q5High-Fidelity DNA PolymeraseNew England BiolabsM0491SUsed in 1.1.2.1.
Quick-Load 1 kb DNA LadderNew England BiolabsN0468SUsed in Figure 4.
Screw-cap tubes (1.5 ml)Starstedt72.692.210Used in 3.6.3
Spectinomycin dihydrochloride pentahydrateVWR InternationalJ61820.06Used in 2.1.3.
Sterilin Clear Microtiter round-bottom 96-well platesThermo Fisher Scientific612U96Used in 4.3.1.
T4 DNA ligaseThermo Fisher ScientificEL0011Used in Table 2.
TissueLyser IIQiagen85300Bead mill. Used in 5.2.

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