JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

ينتج تضيق الحنجرة من ترسب الندبة الباثولوجي الذي يضيق بشكل خطير مجري القصبات الهوائية ويفتقر إلى العلاجات الطبية الفعالة. باستخدام PLLA-PCL (70 ٪ بولي-L-lactide و 30 ٪ polycaprolactone) الدعامات كنظام تسليم المخدرات المحلية ، يمكن دراسة العلاجات المحتملة التي تهدف إلى خفض انتشار ندبه في القصبة الهوائية.

Abstract

تضيق الحنجرة (لتر) هو تضييق باثولوجي للتهاب الرغامي والقصبة الهوائية مما يؤدي إلى انسداد خارج المضيق وضيق كبير في التنفس. ينتج هذا المرض عن أصابه الغشاء المخاطي من جسم غريب في القصبة الهوائية ، مما يؤدي إلى تلف الانسجه والاستجابة التهابيه المحلية التي تذهب بشكل منحرف ، مما يؤدي إلى ترسب الانسجه المصابة بندبات مرضيه. العلاج لل ه هو الجراحية بسبب عدم وجود العلاجات الطبية الفعالة. والغرض من هذا الأسلوب هو بناء الدعامات المتوافقة مع الحيوية التي يمكن تصغيرها لوضعها في الفئران مع لتر. أظهرنا ان PLLA-PCL (70 ٪ بولي-L-lactide و 30 ٪ polycaprolactone) بناء كان الأمثل نشاط القوه ، كانت متوافقة بيولوجيا ، عمليا في وضع الدعامات في الجسم الحيوي ، وقادره علي التملص من المخدرات. يوفر هذا الأسلوب نظام تسليم المخدرات لاختبار العوامل المناعية المختلفة لمنع التهاب محليا والحد من تليف مجري التنفس. تصنيع الدعامات ياخذ 28 − 30 ح ويمكن استنساخها بسهوله ، مما يسمح للتجارب مع الأفواج الكبيرة. هنا أدرجنا راباميسين المخدرات داخل الدعامة لاختبار فعاليتها في الحد من التليف وترسب الكولاجين. وكشفت النتائج ان الخيام plla-PCL أظهرت الإفراج عن راباميسين موثوق بها ، وكانت مستقره ميكانيكيا في الظروف الفسيولوجية ، وكانت متوافقة بيولوجيا ، مما يحفز استجابه التهابيه قليلا في القصبة الهوائية. وعلاوة علي ذلك ، فان الدعامات PLLA-PCL التي تقلل من الندبات في القصبة الهوائية في الجسم المجري.

Introduction

تضيق القصبة الهوائية هو تضييق باثولوجي للرغامي في معظم الأحيان بسبب الاصابه بعد التنبيب الضموري. الجمع بين الاستعمار البكتيري ، استجابه الجسم الاجنبيه لفغر الرغامي أو أنبوب الرغامي ، والعوامل الخاصة بالمريض تؤدي إلى استجابه التهابيه شاذة. يؤدي هذا الاستجابة المناعية غير المتكيفة إلى ترسب الكولاجين في القصبة الهوائية ، مما يؤدي إلى تضييق القصبة الهوائية والتضيق اللاحق1،2. ونظرا لان العلاج الحالي لهذا المرض هو في المقام الأول الجراحية ، وتطوير بديل العلاج الطبي القائم علي نموذج استهداف مسارات التهابيه والخبيثة المنحرفة التي تؤدي إلى ترسب الكولاجين المفرط قد درست. راتاميسين ، الذي يمنع مركب الإشارات mTOR ، وقد ثبت ان لها تاثيرات المناعة ، فضلا عن تاثير مضاد لليفي قوي. ومع ذلك, عندما يتم أداره راباميسين بالمنهجية, الآثار الجانبية الشائعة (علي سبيل المثال, فرط الدهون, فقر الدم, نقص الصفيحات) يمكن ان تكون واضحة3. والغرض من منهجيتنا هو تطوير وسيله لإيصال المخدرات المحلية عمليا لاستخدامها في مجري التنفس من شانها ان تقلل من هذه الآثار الجهازية. تركز تقييماتنا علي التحقيق في الاستجابة المناعية المحلية لبناء تسليم المخدرات ، فضلا عن قدرتها علي كبح وظيفة الخلايا الليفية وتغيير البيئة المناعية المحلية. وتشمل النتائج الخاصة بالمرض في اختبار الجسم الذي يقيم علامات التليف.

وقد استخدمت الدعامات القابلة للتحلل من المخدرات في النماذج الحيوانية من الامراض في أنظمه الأعضاء المتعددة ، بما في ذلك مجري التنفس4. لأداره تضيق المسالك الهوائية أو الانهيار ، وقد استخدمت التحقيقات السابقة المخدرات المغلفة السيليكون والدعامات القائمة علي النيكل5. تم اختيار بناء PLLA-PCL لهذا الأسلوب بالذات بسبب الشخصية الخاصة به الإدمان المخدرات والقوه الميكانيكية في الظروف الفسيولوجية علي مدي فتره من 3 أسابيع, وقد ثبت في الدراسات المنشورة السابقة6. PLLA-PCL هو أيضا ماده متوافقة بيولوجيا وقابله للتحلل بالفعل وافقت عليها FDA4. وقد درست الدعامات المتوافقة مع الحيوية سيسبلاتين و MMC في نماذج الحيوانية الكبيرة مثل الأرانب والقطط. ومع ذلك ، في هذه النماذج الحيوانية ، لم توضع الدعامات في نموذج حيواني من المرض وزرعت transcervically. توفر هذه الدراسة طريقه فريدة لتقييم الدعامات المتوافقة مع الادويه الحيوية التي توضع عبر الفم في نموذج الماوس لإصابات المسالك الهوائية وتضيق الحنجرة. والدعامة الحيوية التي تفلت من المخدرات المناعية محليا ويمكن تصغيرها للدراسة في نموذج murine هي قيمه للبحوث السريرية المسبقة الانتقالية. المحاولات السابقة في استخدام الدعامات مع المواد الأخرى بنيات ولدت استجابات قويه الجسم الغريبة تفاقم التهاب الكامن الذي يميز الجهاز7. هذه المنهجية ، علي حد علمنا ، هي الاولي من نوعها لدراسة الآثار المناعية والمضادة لليفي لنظام توصيل الادويه المرتكزة علي الدعامات في نموذج murine من لتر. نموذج murine نفسه يوفر العديد من المزايا لدراسة اثار المخدرات المناعية علي القصبة الهوائية. ويمكن دراسة الفئران المعدلة وراثيا والأفواج التجريبية من الفئران الصحية والمريضة ، والتي يمكن ان تؤدي إلى استنساخ التجريبية وتحسين فعاليه التكلفة. وعلاوة علي ذلك ، فان تسليم الدعامة transorally في القصبة الهوائية الماوس يحاكي التسليم السريري لهذه الدعامة في البشر ، والتي تسلط الضوء كذلك علي ميزه متعديه من هذه الطريقة. وأخيرا ، السهولة النسبية التي يمكن ان تنتج الدعامة PLLA-PCL مع المخدرات يسمح للتعديلات لتقديم العلاجات الدوائية البديلة التي تهدف إلى الحد من تشكيل ندبه في القصبة الهوائية.

Protocol

ملاحظه: تمت الموافقة علي جميع الطرق الموصوفة هنا من قبل لجنه الرعاية الحيوانية والاستخدام التابعة لجامعه جونز هوبكنز (MO12M354).

1. اعداد راباميسين في plla-PCL

  1. اعداد قارورة زجاجيه اثنين (مع قبعات) من 70:30 البوليمر PLLA-PCL الحلول (اللزوجة المتاصله 1.3 − 1.8 DL/G ؛ جدول المواد) الحلول ، مع قارورة واحده تحتوي علي 1.0 ٪ راباميسين والاخر دون راباميسين.
    1. جعل 1.0 ٪ راباميسين التي تحتوي علي محلول البوليمر عن طريق أضافه 6 ملغ من راباميسين إلى 600 ملغ من 70:30 plla-PCL في قارورة زجاجيه.
    2. لمحلول البوليمر دون راباميسين (السيطرة) ، أضافه فقط 600 ملغ من 70:30 plla-PCL إلى قارورة زجاجيه.
  2. تحت غطاء الدخان ، أضافه 6 مل من ثنائي كلورو ميثان إلى كل قارورة زجاجيه.
    تحذير: ثنائي كلورو ميثان هي ماده مسببه للتاكل ويجب استخدام الماصات الزجاجية فقط. وتشمل احتياطات السلامة المناسبة حماية العين الشخصية والقفازات.
  3. أضافه 120 μL من الجلسرين لكل قارورة زجاجيه (لحل 2 ٪ الجلسرين).
    ملاحظه: أضافه الجلسرين يسمح لزيادة المرونة وانخفاض صلابة في بناء الدعامات.
  4. تلخيص قوارير الزجاج والسماح 70:30 plla-PCL مع وبدون راباميسين لحل والتجانس ل 6 − 12 ح.
    ملاحظه: يمكن أيضا وضع قوارير زجاجيه علي منصة تهتز الدورية لحل أسرع.

2. اختبار التملص من rapamycin

  1. ماصه 1 مل من 70:30 حل PLLA-PCL التي تحتوي علي 1 ٪ راتاميسين في صحن بيتري الزجاج.
    ملاحظه: هذا الحجم من 70:30 الحل plla-PCL التي تحتوي علي 1 ٪ راتاميسين سوف تحتوي علي 120 ميكروغرام من راباميسين ويمثل المبلغ الإجمالي من راباميسين في كل بناء. ويمكن استخدام احجام وتركيزات بديله.
  2. السماح 70:30 PLLA-PCL مع 1 ٪ راتاميسين تتصلب إلى قرص مسطح في صحن بيتري الزجاج.
  3. مره واحده تصلب ، ووضع القرص في 2 مل من الفوسفات-مخزنه المالحة (تلفزيوني ، pH 7.4) واحتضان في 37 درجه مئوية الغرفة.
  4. جمع واستبدال تلفزيوني (2 مل) كل 24 ح واستخدام المجمعة التي جمعت لتحليل اللوني السائل عاليه الأداء (hplc) من محتوي راباميسين.
  5. استخدام التلقائية والعمود C18 4.6 cm x 250 mm hplc لتشغيل عينات من خلال حاقن التلقائي مع التخفيفات التسلسلية من راباميسين لإنشاء منحني قياسي معايره. تشغيل كل عينه في ثلاث نسخ.
    ملاحظه: التخفيفات التسلسلية من راباميسين ليتم اختبارها تشمل 10 ٪ ، 1 ٪ ، 0.1 ٪ ، و 0.01 ٪.
  6. استخدام مرحله المحمول من المياه الصف hplc و اسيتلونيتريل مع حجم 10/90/حجم مع معدل تدفق 2.0 mL/min. تعيين الامتصاص خلال hplc ل راباميسين إلى 280 nm.
    ملاحظه: يظهر الشكل 1 التملص من راباميسين علي مدي 14 يوما.

3-إنشاء الدعامات الهوائية لممرات المجاري

ملاحظه: نفذ الخطوات 3-2-3-9 باستخدام مواد معقمه وتقنيه معقمه لتجنب التلوث الذي من شانه ان يؤثر في التطبيقات المجرية والانبوبيه.

  1. اعداد حلول plla-PCL التي تحتوي علي راباميسين كما هو موضح في القسم 1.
  2. باستخدام ماصه الزجاج باستور مع بالون مطاطي ، وتطبيق 1 مل من محلول PLLA-PCL التي تحتوي علي 1 ٪ راتاميسين علي الاوعيه الوريدية من 22 جرام الإيثيلين بروبيلين القائمة علي أساس البروبيلين (جدول المواد). عقد الاوعيه الدموية في يد واحده واستخدام ماصه الزجاج لإسقاط حل PLLA-PCL علي مقياس الاوعيه. ببطء تدوير الاوعيه الدموية لضمان تغطيه متجانسة من الاوعيه الدموية مع حل PLLA-PCL.
    ملاحظه: في البداية ، سيكون الحل PLLA-PCL رقيقه ، ولكن كما يتبخر ثنائي كلورو ميثان اثناء التطبيق علي الاوعيه الدموية ، فان الحل تصبح أكثر لزجه إلى العفن علي الاوعيه الدموية. تحويل الاوعيه الدموية بشكل مستمر اثناء التطبيق مفيد. يجب ان يتم هذه الخطوة ببطء وبدقه لضمان سماكه متسقة من الدعامة.
  3. دعم الاوعيه الدموية مصبوب مع غيض من الاوعيه الدموية التي تواجه الهبوط والتي علي حافه صحن بيتري الزجاج لتجفيف.
  4. تسمح الدعامات لتجف لمده 24 ساعة في غطاء المحرك الفراغي في درجه حرارة الغرفة (الشكل 2ا).
  5. أزاله بناء الدعامات من الاوعيه الاساسيه من خلال التواء بلطف القسطرة الاساسيه الحرة والانزلاق بها من الدعامة مصبوب (الشكل 2ب).
  6. تحقق من الدعامة بحذر لأي عيوب قد تكون قد نتجت اثناء عمليه الصب. في حاله وجود عيب في الدعامة المحملة ، تخلص منه.
  7. تقليم كل نهاية من الدعامة المحملة مع مقص مستقيم غرامه بحيث حواف محوريه.
  8. باستخدام مقص مستقيم غرامه ، وقطع 3 أجزاء محوريه مم من الدعامة المدلي بها لاستخدامها في نموذج الماوس من لتر (الشكل 2ج).
    ملاحظه: حوالي 8 الدعامات يمكن ان تكون مصنوعة من الاوعيه الدموية المسبوكة واحد ، مع كل الدعامات 3 ملم تحتوي علي 120 ميكروغرام من rapamycin.
  9. تحميل الدعامات 3 ملم علي القسطرة الوريدية 22 جديده لاستخدامها في نموذج الماوس من لتر (الشكل 1).

4. التحريض تضيق الحنجرة في الفئران

  1. قبل اجراء في دراسات الماوس المجرية الحصول علي موافقه من لجنه رعاية الحيوانية والاستخدام.
  2. تخدير الذكر البالغ من العمر 9 أسابيع C57BL/6 عن طريق إعطاء حقنه داخل الصفاق من الكيتامين (80 − 100 مغ/كغ) و اكسيليازين (5 − 10 مغ/كغ).
    ملاحظه: سلالات أخرى من الفئران يمكن استبدالها ، ولكن من المستحسن ان يكون وزن الفئران بين 20 − 27 غرام.
  3. عشوائي الفئران في مجموعه تجريبية (أصابه تشيموميتشانيكال مع وضع 1 ٪ rapamycin التي تحتوي علي الدعامة PLLA-PCL) واثنين من مجموعات التحكم: 1) تشيموميتشانيكال أصابه مع وضع دعامة PLLA-PCL ، 2) تشيموميتشانيكال أصابه دون وضع الدعامات.
  4. وضع الماوس علي منصة الجراحية في موقف ضعيف. استخدام حلقه صغيره من الموضوع الملصقة علي الجانب العلوي من منصة لتوسيع العمود الفقري العنقي عن طريق حلقات حول القواطع المركزية.
  5. Affix اليدين والساقيين من الماوس إلى الجدول باستخدام قطعه 2 بوصه من الشريط. قرصه مخلب الماوس للتاكد من انه قد كان التخدير الكافي.
  6. ثم يجهز الموقع الجراحي. يجب أزاله الفراء الفوقي ويجب تنظيف الجلد (بالتناوب اليود أو فرك الكلوركسيدين مع الكحول أو مطهر الجلد المخفف) ثلاث مرات. يجب ان تكون المنطقة مغطاه بالقفازات المعقمة. وينبغي وضع الاداات المعقمة علي سطح معقم عندما لا تكون في الاستخدام.
  7. جعل 1.5 سم الخط الأوسط شق عمودي في عنق الماوس باستخدام غرامه مقص قزحية المنحني. يقسم الغدة الصعتريه الفوقية والفصين الناتجين لتصور القصبة الهوائية. تقسيم العضلات الفوقية المفرطة والدرقية (الحزام) في المرفق المتفوق ثنائيا.
    ملاحظه: يجب ان يكون مجمع الحنجرة بأكمله مكشوفا تماما بعد هذا.
  8. مرر 22 جرام من الشعيرات عبر الحنجرة في القصبة الهوائية. استخدام ملقط صغير لتطبيق الضغط علي الحنجرة الاماميه للماوس للمساعدة في وضع الصحيح للاوعيه الدموية. تصور الاوعيه الدموية البيضاء من خلال القصبة الهوائية لضمان الوضع الصحيح (غير المريء).
    ملاحظه: القصبة الهوائية الماوس رقيقه للغاية سيتم تصور الاوعيه الدموية البيضاء من خلال القصبة الهوائية الشفافة.
  9. مرر فرشاه السلك المغلفة بالجفن من خلال مقياس الشعيرات المدرج.
  10. ببطء سحب الاوعيه الدموية بحيث لا تبقي سوي فرشاه سلك في القصبة الهوائية.
  11. تطبيق الضغط المضاد باستخدام ملقط غرامه علي القصبة الهوائية لتعطيل التجويف الرغامي ميكانيكيا مع فرشاه الأسلاك.
  12. أعد تركيب الاوعيه الدموية في القصبة الهوائية فوق الفرشاة السلكية.
  13. أزاله فرشاه الأسلاك وأعاده تطبيق bleomycin.
  14. كرر الخطوات 4.8 − 4.12 ما مجموعه 5x. تطبيق بليوميسين علي الفرشاة بين كل تطبيق.
    ملاحظه: يمكن العثور علي التحقق من صحة ووصف هذا النموذج في هليل وآخرون8.
  15. أزاله مقياس الاوعيه الدموية من القصبة الهوائية الماوس.
    ملاحظه: إذا لم يتم وضع الدعامات ، يمكن إغلاق الشق باستخدام غراء الانسجه.

5. وضع الدعامات PLLA-PCL عبر الفم في الفئران

  1. حمل دعامة واحده بحجم 3 مم علي مقياس وعائي 22 غ فارغ (الشكل 3ا).
    ملاحظه: يجب ان تبقي الدعامة 5 مم من طرف الاوعيه الدموية.
  2. رسم خط عمودي اسود رقيقه علي الدعامات المحملة 3 مم.
    ملاحظه: هذا الخط يسمح لتحسين التصور للدعامة في القصبة الهوائية.
  3. عبر التنبيب الماوس مع الاوعيه الدموية التي تم تحميلها مسبقا مع الدعامة.
  4. تصور الدعامة علي مقياس الاوعيه في القصبة الهوائية من خلال شق عبر عنق الرحم (الشكل 3ب).
    ملاحظه: القصبة الهوائية رقيقه جدا ، مما يسمح لصبغه سوداء علي الدعامة ليتم تصورها من خلال القصبة الهوائية. استخدم هذا لتاكيد موضع التعقب الصحيح.
  5. امسك الدعامة في مكانها بالإمساك بالقصبة الهوائية من خلال شق عنق الرحم بملقط ناعم.
  6. أزاله الاوعيه الدموية عبر الفم مع الحفاظ علي قبضه علي الدعامة مع ملقط غرامه.
    ملاحظه: من المهم للغاية عدم تطبيق الكثير من القوه علي الدعامة لعدم سحق التجويف عند أزاله الاوعيه الدموية. ومع ذلك ، مطلوب قوه كافيه لضمان عدم أزاله الدعامة مع الاوعيه الدموية. ويمكن استخدام سياليندوسكوبي mm 0.8 لتصور موقع ووضع الدعامة في القصبة الهوائية.
  7. إغلاق شق عبر عنق الرحم مع الغراء الانسجه.
  8. السماح لكل الماوس لاستعاده مستوي نشاطها الأصلي قبل وضعه مره أخرى في قفصه.

6. اعداد النسيجية من العينات

  1. تخدير الفئران مع الفئران المخدرة المستنشقة والتضحية مع خلع عنق الرحم لكل بروتوكول الحيوانية بعد 7 ، 14 ، أو 21 يوما.
    ملاحظه: استنادا إلى فتره الدراسة ، يمكن استخدام فترات زمنيه مختلفه (علي سبيل المثال ، 28 ، 30 يوما ، الخ).
  2. ضع الماوس علي المنصة الجراحية كما هو موضح في الخطوات 4.4 و 4.5.
  3. أعاده فتح شق الرقبة علي الماوس باستخدام غرامه مقص قزحية المنحني.
  4. فضح القصبة الهوائية في الخطوة 4.6.
  5. تقسيم القصبة الهوائية البعيدة تحت مستوي الدعامة باستخدام مقص قزحية منحنيه غرامه.
  6. تقسيم القصبة الهوائية القريبة تحت الحنجرة وفوق الدعامة باستخدام مقص القزحية المنحنية غرامه.
    ملاحظه: من المهم تقسيم القصبة الهوائية البعيدة أولا لمنع القصبة الهوائية من التراجع في الصدر.
  7. افصل القصبة الهوائية المنقسمة عن المريء وأزل القصبة الهوائية من الفاره.
    ملاحظه: سيتم الاحتفاظ الدعامات لا يزال داخل القصبة الهوائية الماوس.
  8. أزاله الدعامات من القصبة الهوائية وإصلاح في 10 ٪ فورالين ل 24 ساعة.
  9. تضمين formalin-ثابت الفئران القصبة الهوائية العينات في البارافين مع نهاية البعيدة المنحى سوبريورلي بحيث يمكن اجراء التخفيضات المحورية من القصبة الهوائية في الخطوة التالية.
  10. قطع 5 ميكرون المقاطع من القصبة الهوائية الماوس جزءا لا يتجزا من البارافين باستخدام ميكروتومي.
    ملاحظه: يجب قطع العينات بالمحاور بدءا من القصبة الهوائية البعيدة.
  11. الحصول علي 5 ميكرون القسم التمثيلي كل 250 μm علي طول العينة.
  12. كامل H & E وصمه عار علي كل قسم تمثيلي.
    1. المغادرين الشرائح عن طريق وضع في الزيلين 2x لكل شريحة لمده 3 دقائق.
    2. ضع الشرائح في 100 ٪ الايثانول لمده 2 دقيقه ، 95 ٪ الايثانول لمده 2 دقيقه ، و 70 ٪ الايثانول لمده 2 دقيقه لترطيب.
    3. اغسل الشرائح بماء الصنبور الجاري لمده 2 دقيقه.
    4. وصمه عار الشرائح في الهيلوكسيلين لمده 3 − 5 دقيقه.
    5. اغسل الشرائح بماء الصنبور الجاري لمده 5 دقائق.
    6. وضع الشرائح في 1 ٪ حمض الكحول لمده 1 دقيقه.
    7. اغسل الشرائح بماء الصنبور الجاري لمده دقيقه واحده.
    8. شطف في 0.2 ٪ ماء الأمونيا لمده 30 ثانيه.
    9. شطف الشرائح في ماء الصنبور تشغيل لمده 5 دقائق. تراجع في 95 ٪ الايثانول 10x.
    10. ايوسين وصمه عار من خلال وضع الشريحة في يوزين phloxine ل 30 s.
    11. ديهيدرات الشرائح عن طريق وضع في 95 ٪ الايثانول لمده 5 دقائق ، تليها الايثانول المطلق 2x لمده 5 دقائق.
    12. مكان في اكسيلين 2x لمده 5 دقائق.
    13. جبل الشرائح مع المتوسطة القائمة علي التثبيت اكسيلين.
  13. قياس سماكه بروبينا لأمينا كما هو موضح في هليل وآخرون8.

7. التوافق الحيوي الدعامات في الجسم المجري

  1. اعداد أقسام الانسجه كما في الخطوات 6.1 − 6.4. لا تقم بازاله الدعامات من هذه الأقسام الرغامية من أجل تصور التغيرات في التهاب بالنسبة لموقع الدعامة داخل تجويف القصبة الهوائية.
    1. لتحديد استجابه الجسم الغريبة الحاده إلى الدعامة ، ومراقبه الضامة والنشاط خليه T باستخدام CD3 و F4/80 علامات.
      ملاحظه: يمكن أيضا استخدام علامات أخرى لتحديد رد الفعل التهابي الحاد علي الدعامة.
    2. الحصول علي قطع 5 ميكرومتر من القصبة الهوائية المضمنة البارافين علي الشرائح المائية المتاحة تجاريا بالاضافه إلى (جدول المواد). ضع قسمين علي كل شريحة.
      ملاحظه: يجب ان تكون هذه المقاطع من منطقه القصبة الهوائية حيث وضعت الدعامة PLLA-PCL.
  2. ضع الشرائح في الزيلين 2x لمده 5 دقائق لكل منهما.
  3. ضع الشرائح في 100 ٪ الايثانول 2x لمده 3 دقائق لكل منهما.
  4. ضع الشرائح في 95 ٪ الايثانول لمده 1 دقيقه.
  5. وضع الشرائح في رف تلطيخ الانسجه بحيث يتم مغمورة في المخزن المؤقت استرداد مستضد (جدول المواد) ومن ثم وضع في باخرة الخضار مع الماء المغلي لمده 20 دقيقه.
  6. أزاله الرفوف تلطيخ من الباخرة وتجاهل المخزن المؤقت استرداد antigen.
  7. استبدال المخزن المؤقت مع 1 مل من تلفزيوني.
  8. وضع الشرائح في مربع تلطيخ الرطب لمده دقيقه واحده.
  9. تجاهل العروض التلفزيونية واحتضان الشرائح مع النسر المعدل دولبيكو المتوسطة (DMEM) مع 10 ٪ لمده 30 دقيقه.
  10. تجاهل DMEM وأضافه خليط من اثنين من الأجسام المضادة الاساسيه التي أثيرت في الأنواع المختلفة. تغطيه الشرائح مع فيلم البارافين واحتضان بين عشيه وضحيها في 4 درجه مئوية في غرفه مظلمة.
    ملاحظه: في هذا البروتوكول الأرنب المضادة لCD3 والفئران المضادة F4/80 (جدول المواد) واستخدمت.
  11. اغسل الشرائح في 3x تلفزيوني لمده 5 دقائق.
  12. احتضان الشرائح مع الأجسام المضادة الثانوية الخاصة بأنواع الأجسام المضادة الاساسيه (جدول المواد) المخففة في dmem بنسبه 10% لمده 0.5 − 1 ساعة في درجه حرارة الغرفة في الظلام.
  13. اغسل الشرائح في 3x التلفزيونية لمده 5 دقائق في الظلام.
  14. جبل الشرائح علي الشفتين مع قطره من المتوسطة المتصاعدة مع 4 ' 6-diamidino-2-فينيلانديول (DAPI). خزن الشرائح في الظلام عند 20 درجه مئوية أو 4 درجات مئوية.
  15. راقب الشرائح الملونة علي المجهر البؤري الضوئي بالليزر والصورة.
  16. تحديد العدد الإجمالي للخلايا الملوثة مع DAPI والأجسام المضادة ذات الفائدة للمقارنة مع القصبة الهوائية غير المصابة.

8. الماوس القصبة الهوائية تحليل التعبير الجيني الكمي

  1. جمع القصبة الهوائية الماوس كما هو موضح في الخطوات 6.1 − 6.7 وأزاله الدعامات.
    ملاحظه: يمكن تخزين الرغامي الفار المقطوع في 80 درجه مئوية الفريزر لمده تصل إلى 2 سنوات.
  2. المجففة الانسجه الرغامي حصادها في الخطوة 8.1 باستخدام مقص غرامه ومزيد من التجانس باستخدام حبه الخالط مطحنه مع 1.4 مم الخرز السيراميك (جدول المواد) كجزء من المتاحة تجاريا المستندة إلى العمود الريبي استخراج مجموعه (جدول المواد).
    ملاحظه: إعدادات الخالط مطحنه حبه = 1 40 s دوره في 6 م/ث.
  3. استخراج الحمض الريبي النيبالي من محلله الرغامي باستخدام العمود القائم علي استخراج وتنقيه عده (جدول المواد) بعد تعليمات الشركة المصنعة.
  4. تحديد كميه الحمض الريبي النيبالي من كل عينه باستخدام مقياس طيفي (جدول المواد).
    ملاحظه: يتم تقييم نقاء الحمض الريبي النيبالي باستخدام نسبه 260/230 نانومتر مع عينه الحمض الريبي النيبالي النقي القراءة 2.0.
  5. إنشاء DNA التكميلية من الحمض النووي الريبي المستخرجة باستخدام النسخ العكسي (جدول المواد) وثيرموسيكلير مع الإعدادات التالية: 5 دقيقه عند 25 درجه مئوية (فتيله) ، 46 درجه مئوية لمده 30 دقيقه (عكس النسخ) ، ثم 95 درجه مئوية لمده 1 دقيقه (تعطيل النسخ العكسي).
  6. تمييع عينات الحمض النووي التكميلية مع المياه الحرة RNase إلى تركيز من 10 − 25 نانوغرام/مل لاستخدامها في الوقت الحقيقي الكمي PCR.
  7. مزيج 1 μL من الحمض النووي التكميلي (10 − 25 نانوغرام/مل) مع 10 μL من المزيج PCR (جدول المواد) ، 8 Μl من ddh2O و 0.5 Μl من 10 μM إلى الامام والإشعال العكسي لجين الفائدة في بئر واحده من لوحه PCR 96 (جدول المواد).
    ملاحظه: يجب ان يكون إجمالي وحده التخزين في كل بئر 20 μL. وينبغي لكل بئر علي لوحه 96 جيدا تحتوي علي عينه واحده فقط وجين واحد من الفائدة.
  8. كرر الخطوات 8.1 – 8.7 لجميع الجينات المثيرة للاهتمام وتشغيل كل عينه لكل جين في ثلاث نسخ.
    ملاحظه: تستخدم عاده الإشعال الامامي والعكسي الخاص بالجينات (جدول المواد) للكولاجين 1 ، والكولاجين 3 ، والجينات المرجعية β-actin للتحقيق في علامات التليف.
  9. وضع لوحه جيدا 96 علي اله PCR الكمية في الوقت الحقيقي والبدء في البروتوكول التالي: تفسد في 95 درجه مئوية ل 15 ثانيه واننيل وتمتد في 60 درجه مئوية ل 60 s لدورات 40.
  10. تطبيع قيمه عتبه الدورة (CT) للكشف عن المنتجات الجينية لكل جين من الفائدة (غوى) إلى القيمة المقطعية للجينات المرجعية β-actin لجميع العينات للحصول علي ΔCT لكل غوى. ثم ، قارن قيم ΔCT لكل غوى للعينات المعالجة وغير المعالجة لتوليد ΔΔCT.
    ملاحظه: عتبه الدورة هي النقطة علي منحني التضخيم عند وجود كميه محدده سلفا من المنتج الجيني (ΔRn). يجب تحديد قيمه ΔRn لكل رد فعل لكل جين الفائدة ويجب ان تقع علي الجزء الخطي من منحني التضخيم.
    ملاحظه: ΔCT = CT (غوى) – CT (الجينات المرجعية); ΔΔCT = ΔCT (معالجه) – ΔCT (غير المعالجة).
  11. حساب التغير النسبي في التعبير الجيني بين العينات المعالجة وغير المعالجة كتعبير عن تغيير الطية عن طريق حساب 2δδCT.

النتائج

وكان بناء الدعامات plla-PCL القابلة للتحلل التي تم تحميلها مع راباميسين المستخدمة في هذه الدراسة قادره علي التملص راباميسين بطريقه متسقة ويمكن التنبؤ بها في الظروف الفسيولوجية (الشكل 1). يبين الشكل 2 الدعامة PLLA-PCL التي تم وضعها حول مقياس الشعيرات 22 جرام لاستخدا?...

Discussion

الخطوات الأكثر اهميه لبناء بنجاح واستخدام الدعامات المخدرات التملص في الجسم الحيوي هي 1) تحديد نسبه PLLA-PCL الأمثل لمعدل الإدمان المخدرات مرغوب فيه ، 2) تحديد التركيز المناسب من المخدرات ليكون التملص ، 3) صب الدعامات حول الاوعيه الدموية لاستخدامها في الجسم الفيفو ، و 4) نقل الدعامات عبر الفم إل...

Disclosures

وليس لدي المؤلفين ما يفصحون عنه.

Acknowledgements

المعهد الوطني لامراض الصمم وغيرها من اضطرابات الاتصال في المعاهد الوطنية للصحة تحت رقم الجائزة 1K23DC014082 و 1K23DC014082 (الكسندر هليل). وقد دعمت هذه الدراسة أيضا ماليا من قبل الجمعية الثلاثية والكلية الامريكيه للجراحين (الكسندر هليل) ، ومؤسسه الجمعية الطبية الامريكيه ، شيكاغو ، IL (Madhavi Duvvuri) ومنحه T32 NIDCD التدريب (كيفن Motz).

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
1. For stent
22-gauge angiocatheterJelco4050
DichloromethaneSigma Aldrich270997-100ML
GlycerolFisher Scientific56-81-5Available from other vendors as well.
PDLGASigma Aldrich739955-5G
PLLA-PCL (70 : 30)Evonik Industries AG65053
RapamycinLC LaboratoriesR-5000
2. Animal surgery
Wire brushMill-Rose Company320101
3. For immunohistochemistry staining
Antigen retrival bufferAbcamab93678Available from other vendors as well; acidic pH needed
DAPICell Signaling8961S
DMEMThermoFisher Scientific11965-092Available from other vendors as well.
FBS (Fetal Bovine Serum)MilliporeSigmaF4135-500ML
Goat anti-rabbit-488 antibodyLif technologya11008
Goat anti-rat-633 antibodyLif technologya21094
Hydrophilic plus slideBSB7028
PBSThermoFisher Scientific100-10023Available from other vendors as well.
Rabbit anti-CD3 antibodyAbcamab5690
Rat antiF4/80 antibodyBiolengend123101
Zeiss LSM 510 Meta Confocal MicroscopeZeiss
4. For quantative PCR
0.5mm glass beadsOMNI International19-645
Bead Mill HomoginizerOMNI International
Gene Specific Forward/Reverse PrimersGenomic Resources Core Facility
Nanodrop 2000 spectrophotometerThermo Scientific
Power SYBR Green MastermixLife Technologies4367659
RNeasy mini kitQiagen80404
StepOnePlus Real Time PCR systemLife Technologies

References

  1. Minnigerode, B., Richter, H. G. Pathophysiology of subglottic tracheal stenosis in childhood. Progress in Pediatric Surgery. 21, 1-7 (1987).
  2. Wynn, T. A. Fibrotic disease and the T(H)1/T(H)2 paradigm. Nature Reviews Immunology. 4 (8), 583-594 (2004).
  3. Kaplan, M. J., et al. Systemic Toxicity Following Administration of Sirolimus (formerly Rapamycin) for Psoriasis. Archives of Dermatology. 135 (5), 553-557 (1999).
  4. Kalra, A., et al. New-Generation Coronary Stents: Current Data and Future Directions. Currrent Atherosclerosis Reports. 19 (3), 14 (2017).
  5. Chao, Y. K., Liu, K. S., Wang, Y. C., Huang, Y. L., Liu, S. J. Biodegradable cisplatin-eluting tracheal stent for malignant airway obstruction: in vivo and in vitro studies. Chest. 144 (1), 193-199 (2013).
  6. Duvvuri, M., et al. Engineering an immunomodulatory drug-eluting stent to treat laryngotracheal stenosis. Biomaterials Science. 7 (5), 1863-1874 (2019).
  7. Mugru, S. D., Colt, H. G. Complications of silicone stent insertion in patients with expiratory central airway collapse. Annals of Thoracic Surgery. 84 (6), 1870-1877 (2007).
  8. Hillel, A. T., et al. An in situ, in vivo murine model for the study of laryngotracheal stenosis. JAMA Otolaryngolology Head Neck Surgery. 140 (10), 961-966 (2014).
  9. Can, E., Udenir, G., Kanneci, A. I., Kose, G., Bucak, S. Investigation of PLLA/PCL blends and paclitaxel release profiles. AAPS PharmSciTech. 12 (4), 1442-1453 (2011).
  10. Wang, T., et al. Paclitaxel Drug-eluting Tracheal Stent Could Reduce Granulation Tissue Formation in a Canine Model. Chinese Medical Journal (Engl). 129 (22), 2708-2713 (2016).
  11. Sigler, M., Klotzer, J., Quentin, T., Paul, T., Moller, O. Stent implantation into the tracheo-bronchial system in rabbits: histopathologic sequelae in bare metal vs. drug-eluting stents. Molecularand Cellular Pediatrics. 2 (1), 10 (2015).
  12. Robey, T. C., et al. Use of internal bioabsorbable PLGA "finger-type" stents in a rabbit tracheal reconstruction model. Archives of Otolaryngology Head Neck Surgery. 126 (8), 985-991 (2000).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

155 PLLA PCL

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved