Conception d'un Stent trachéal trachéheal biocompatible dans des souris avec la sténose laryngotratrahéheal

Résumé

La sténose laryngotratrale résulte d'un dépôt pathologique de cicatrices qui rétrécit de façon critique les voies respiratoires trachéales et manque de thérapies médicales efficaces. À l'aide d'un stent PLLA-PCL (70% poly-L-lactiure et 30% de polycaprolactone) comme système local d'administration de médicaments, des thérapies potentielles visant à diminuer la prolifération des cicatrices dans la trachée peuvent être étudiées.

Résumé

La sténose laryngotratrachéle (LTS) est un rétrécissement pathologique du subglottis et de la trachée menant à l'obstruction extrathoracique et à l'essoufflement significatif. LTS résulte de dommages muqueux d'un corps étranger dans la trachée, menant aux dommages de tissu et à une réponse inflammatoire locale qui va mal, menant au dépôt du tissu pathologique de cicatrice. Le traitement du SLR est chirurgical en raison de l'absence de thérapies médicales efficaces. Le but de cette méthode est de construire un stent biocompatible qui peut être miniaturisé pour placer dans les souris avec LTS. Nous avons démontré qu'une construction de PLLA-PCL (70% poly-L-lactide et 30% de polycaprolactone) avait la force biomécanique optimale, était biocompatible, réalisable pour un stent de placement in vivo, et capable d'élusiper le médicament. Cette méthode fournit un système d'administration de médicaments pour tester divers agents immunomodulatoires afin d'inhiber localement l'inflammation et de réduire la fibrose des voies respiratoires. La fabrication des endoprothèses prend de 28 à 30 h et peut être reproduite facilement, ce qui permet d'expérimenter avec de grandes cohortes. Ici, nous avons incorporé la rapamycine médicament dans l'endoprothèse pour tester son efficacité dans la réduction de la fibrose et le dépôt de collagène. Les résultats ont indiqué que les tentes de PLLA-PCL ont montré la libération fiable de rapamycine, étaient mécaniquement stables dans des conditions physiologiques, et étaient biocompatibles, induisant peu de réponse inflammatoire dans la trachée. En outre, les endoprothèses PLLA-PCL de rapamycine-eluting ont réduit la formation de cicatrice dans la trachée in vivo.

Introduction

La sténose laryngotratrachéale (LTS) est un rétrécissement pathologique de la trachée le plus souvent dû aux dommages iatrogènes de post-intubation. La combinaison de la colonisation bactérienne, de la réponse de corps étranger à un tube trachéochéatif ou endotrachéal, et des facteurs patient-spécifiques mènent à une réponse inflammatoire anormale. Cette réponse immunitaire inadaptée conduit au dépôt de collagène dans la trachée, ayant pour résultat le rétrécissement luminal de la trachée et la sténose suivante^1,2. Comme le traitement actuel pour cette maladie est principalement chirurgical, le développement d'un paradigme de traitement médicalement basé alternative ciblant les voies inflammatoires et profibrotiques aberrantes qui mènent au dépôt excessif de collagène a été étudié. La rapamycine, qui inhibe le complexe de signalisation mTOR, a été montrée pour avoir des effets immunosuppresseurs aussi bien qu'un effet antifibroblaste robuste. Cependant, lorsque la rapamycine est administrée de façon systémique, les effets secondaires courants (p. ex. hyperlipidémie, anémie, thrombocytopenie) peuvent être prononcés³. Le but de notre méthodologie est de développer un véhicule pour l'administration locale de médicaments praticable pour une utilisation dans les voies respiratoires qui réduirait ces effets systémiques. Nos évaluations se concentrent sur l'étude de la réponse immunitaire locale à la construction de l'administration de médicaments ainsi que sa capacité à inhiber la fonction du fibroblaste et à modifier le microenvironnement immunitaire local. Les résultats spécifiques à la maladie comprennent des tests in vivo qui évaluent les marqueurs de la fibrose.

Des endoprothèses biodégradables ont été utilisées dans les modèles animaux de la maladie dans plusieurs systèmes d'organes, y compris les voies respiratoires⁴. Pour la gestion de la sténose ou de l'effondrement des voies respiratoires, des enquêtes antérieures ont utilisé du silicone enduit de drogue et des endoprothèses à base de nickel⁵. Une construction de PLLA-PCL a été choisie pour cette méthode particulière en raison de son profil d'élution de drogue et de la force mécanique dans des conditions physiologiques sur une période de 3 semaines, qui a été démontrée dans les études éditées précédentes^6. PLLA-PCL est également un matériau biocompatible et biodégradable déjà approuvé par la FDA⁴. Les endoprothèses biocompatibles en cequissant le cisplatine et le MMC ont été étudiées dans de grands modèles animaux tels que les lapins et les chiens. Cependant, dans ces modèles animaux, les endoprothèses n'ont pas été placées dans un modèle animal de la maladie et ont été implantées transcervicalement. Cette étude fournit une méthode unique pour évaluer un stent biocompatible de drogue-élutage placé transorally dans un modèle de souris des dommages de voie aérienne et de la sténose laryngotraheal. Un stent biocompatible qui élude un médicament immunomodulateur localement et peut être miniaturisé pour l'étude dans un modèle murine est valable pour la recherche préclinique translationnelle. Les tentatives précédentes à l'utilisation d'endoprothèse avec d'autres constructions matérielles ont généré des réponses robustes de corps étranger aggravant l'inflammation fondamentale qui distingue LTS⁷. Cette méthodologie, à notre connaissance, est la première de son genre à étudier les effets immunomodulatoires et antifibrotiques d'un système d'administration de drogue à base d'endoprothèse dans un modèle murine de LTS. Le modèle murine lui-même offre plusieurs avantages pour étudier les effets d'un médicament immunomodulateur sur la trachée. Des souris génétiquement modifiées et des cohortes expérimentales de souris saines et malades peuvent être étudiées, ce qui peut mener à une reproductibilité expérimentale et améliorer la rentabilité. En outre, la livraison de l'endoprothèse transoralement dans la trachée de souris imite la livraison clinique d'un tel stent chez l'homme, qui accentue davantage l'avantage translationnel de cette méthode. Enfin, la facilité relative avec laquelle l'endoprothèse PLLA-PCL avec le médicament peut être produite permet des modifications pour fournir d'autres thérapies médicamenteuses visant à réduire la formation de cicatrices dans la trachée.

Protocole

REMARQUE : Toutes les méthodes décrites ici ont été approuvées par le Comité des soins et de l'utilisation des animaux de l'Université Johns Hopkins (MO12M354).

1. Préparation de la rapamycine en PLLA-PCL

1. Préparer deux flacons en verre (avec bouchons) de 70:30 solutions de polymère PLLA-PCL (viscosité inhérente 1,3 à 1,8 DL/G; Tableau des matériaux) solutions, avec une fiole contenant 1,0% de rapamycine et l'autre sans rapamycine.
   1. Faire une solution de 1,0% de rapamycine contenant des polymères en ajoutant 6 mg de rapamycine à 600 mg de 70:30 PLLA-PCL dans un flacon de verre.
   2. Pour la solution de polymère sans rapamycine (contrôle), ajoutez seulement 600 mg de 70:30 PLLA-PCL au flacon de verre.
2. Sous une hotte de fumée, ajouter 6 ml de dichlorométhane à chaque flacon de verre.
   CAUTION: Le dichlorométhane est un matériau corrosif et seules les pipettes en verre doivent être utilisées. Les précautions de sécurité appropriées comprennent la protection oculaire personnelle et des gants.
3. Ajouter 120 l de glycérol à chaque flacon de verre (pour 2 % de solution de glycérol).
   REMARQUE : L'ajout de glycérol permet une plus grande flexibilité et une diminution de la rigidité dans la construction de l'endoprothèse.
4. Récapitulez les flacons de verre et laissez 70:30 PLLA-PCL avec et sans rapamycine de se dissoudre et d'homogénéiser pendant 6 à 12 h.
   REMARQUE : Les flacons en verre peuvent également être placés sur une plate-forme tournante de secousse pour une dissolution plus rapide.

2. Test d'élution de Rapamycin

1. Pipette 1 mL de 70:30 PLLA-PCL solution contenant 1% rapamycine dans un plat en verre Petri.
   REMARQUE : Ce volume de 70:30 PLLA-PCL solution contenant 1% de rapamycine contiendra 120 g de rapamycine et représente la quantité totale de rapamycine dans chaque construction. D'autres volumes et concentrations peuvent être utilisés.
2. Laisser 70:30 PLLA-PCL avec 1% de rapamycine pour durcir dans un disque plat dans le plat en verre Petri.
3. Une fois durci, placez le disque dans 2 ml de saline tamponnée de phosphate (PBS, pH 7,4) et incubez-le dans une chambre à 37 oC.
4. Recueillir et remplacer PBS (2 mL) tous les 24 h et utiliser le PBS collecté pour l'analyse de la chromatographie liquide haute performance (HPLC) de la teneur en rapamycine.
5. Utilisez un autosampler et une colonne C₁₈ 4,6 cm x 250 mm HPLC pour faire passer des échantillons à travers l'injecteur d'autosampler ainsi que des dilutions en série de rapamycine pour créer une courbe standard calibrée. Exécuter chaque échantillon en triple.
   REMARQUE : Les dilutions en série de la rapamycine à tester comprennent 10 %, 1 %, 0,1 % et 0,01 %.
6. Utilisez une phase mobile d'eau et d'acétonitrile de qualité HPLC avec un volume/volume de 10/90 avec un débit de 2,0 ml/min. Régler l'absorption pendant le HPLC pour la rapamycine à 280 nm.
   REMARQUE : La figure 1 montre l'élution de la rapamycine sur une période de 14 jours.

3. Création d'endoprothèses de voies respiratoires murinep PLLA-PCL de rapamycine

REMARQUE : Effectuer des étapes 3.2-3.9 en utilisant des matériaux stériles et une technique stérile pour éviter la contamination qui influencerait les applications in vivo et in vitro.

1. Préparer des solutions PLLA-PCL contenant de la rapamycine telles que décrites à la section 1.
2. À l'aide d'une pipette Pasteur en verre avec un ballon en caoutchouc, appliquer 1 mL de solution PLLA-PCL contenant 1 % de rapamycine sur la canule veineuse d'un angiocatheter à base d'éthylène fluoré de 22 G(Tableau des matériaux). Tenez l'angiocatheter dans une main et utilisez la pipette en verre pour déposer la solution PLLA-PCL sur l'angiocatheter. Faites pivoter lentement l'angiocatheter pour assurer une couverture homogène de l'angiocatheter avec la solution PLLA-PCL.
   REMARQUE : Dans un premier temps, la solution PLLA-PCL sera mince, mais comme le dichlorométhane s'évapore pendant l'application sur l'angiocatheter, la solution deviendra plus visqueuse pour mouler sur l'angiocatheter. Il est bénéfique de tourner continuellement l'angiocatheter pendant l'application. Cette étape doit être faite lentement et méticuleusement pour assurer l'épaisseur cohérente de l'endoprothèse.
3. Propulsez l'angiocatheter moulé avec la pointe de l'angiocatheter vers le bas et la pochoir sur le bord d'un plat Petri en verre pour le séchage.
4. Laisser sécher les endoprothèses pendant 24 h dans un capot sous vide à température ambiante (figure 2A).
5. Retirez la construction de l'endoprothèse de l'angiocatheter sous-jacent en tordant doucement le cathéter sous-jacent et en le faisant glisser hors de l'endoprothèse moulée (Figure 2B).
6. Vérifiez l'endoprothèse circonscérientiellement pour tous les défauts qui peuvent avoir résulté pendant le processus de coulée. Si un défaut dans l'endoprothèse moulée est présent, jetez-le.
7. Couper chaque extrémité de l'endoprothèse moulée avec de fines ciseaux droites de sorte que les bords sont axiaux.
8. À l'aide de ciseaux fins et droits, couper des segments axiaux de 3 mm de l'endoprothèse moulée pour être utilisé dans un modèle de souris de LTS (Figure 2C).
   REMARQUE : Environ 8 endoprothèses peuvent être fabriquées à partir d'un angiocathéter moulé, chaque stent de 3 mm contenant 120 g de rapamycine.
9. Chargez l'endoprothèse de 3 mm sur un nouveau cathéter veineux de 22 pour une utilisation dans un modèle de souris de LTS (Figure 1).

4. Induction de sténose laryngotratratrique chez la souris

1. Avant de mener des études in vivo sur les souris, le Comité des soins et de l'utilisation des animaux a obtenu l'approbation.
2. Anesthésiez un C57BL/6 mâle de 9 semaines en injectant de la kétamine (80 à 100 mg/kg) et de la xylazine (5 à 10 mg/kg).
   REMARQUE: D'autres souches de souris peuvent être substituées, mais il est recommandé que le poids des souris soit entre 20 et 27 g.
3. Randomiser les souris dans un groupe expérimental (blessure chimiomécanique avec un placement d'un stent PLLA-PCL contenant de la rapamycine de 1 %) et deux groupes témoins : 1) lésions chimiomécaniques avec le placement d'un stent PLLA-PCL, 2) des lésions chimiomécaniques sans le placement d'un stent.
4. Placez une souris sur une plate-forme chirurgicale en position de supine. Utilisez une petite boucle de fil apposée sur le dessus de la plate-forme pour étendre la colonne cervicale en la boucle autour des incisifs centraux.
5. Affix les mains et les jambes de la souris à la table en utilisant des morceaux de ruban adhésif de 2 pouces. Pincez la patte de souris pour s'assurer qu'elle a eu une anesthésie adéquate.
6. Le site chirurgical est ensuite préparé. La fourrure sus-jacente doit être enlevée et la peau doit être nettoyée (alternant gommage à l'iode ou chlorhexidine avec de l'alcool ou un désinfectant dilué pour la peau) trois fois. La zone doit être drapée et des gants stériles être portés. Les instruments stérilisés doivent être posés sur une surface stérile lorsqu'ils ne sont pas utilisés.
7. Faire une incision verticale de 1,5 cm dans le cou de la souris à l'aide de ciseaux à iris incurvés fins. Diviser le thymus sus-sus et latéraliser les deux lobes résultants pour visualiser la trachée. Divisez les muscles sternohyoid et sternothyroid (strap) sus-sus-sus-susaires à l'attachement supérieur bilatéralement.
   REMARQUE : Le complexe laryngotracheal entier devrait être complètement exposé après ceci.
8. Passer un angiocatheter 22 G transorally à travers le larynx dans la trachée. Utilisez de petits forceps pour appliquer une pression sur le larynx antérieur de la souris pour aider à la bonne position de l'angiocatheter. Visualisez l'angiocatheter blanc à travers la trachée pour assurer un placement correct (non-oesophagine).
   REMARQUE : La trachée de souris est extrêmement mince et l'angiocatheter blanc sera visualisé par la trachée translucide.
9. Passer une brosse en fil de bléomycine à travers l'angiocatheter inséré.
10. Retirez lentement l'angiocatheter de sorte que seule la brosse métallique reste dans la trachée.
11. Appliquer la contre-pression à l'aide de fines forceps sur la trachée pour perturber mécaniquement le lumen trachéal avec la brosse métallique.
12. Réinsérer l'angiocatheter dans la trachée au-dessus de la brosse de fil.
13. Retirez la brosse métallique et réappliquez la bleomycine.
14. Répétez les étapes 4.8-4.12 un total de 5x. Appliquer de la bléomycine sur le pinceau entre chaque application.
    REMARQUE : La validation et la description de ce modèle se trouvent dans Hillel et coll.⁸.
15. Retirer l'angiocathéter de la trachée de la souris.
    REMARQUE : Si aucun endoprothèse ne doit être placé, l'incision peut être fermée avec de la colle de tissu.

5. Placement transoral d'endoprothèse De PLLA-PCL chez les souris

1. Chargez un stent moulé de 3 mm sur un angiocatheter vide de 22 G (Figure 3A).
   REMARQUE : L'endoprothèse doit reposer à 5 mm de la pointe de l'angiocatheter.
2. Dessinez une fine ligne verticale noire sur l'endoprothèse moulée de 3 mm.
   REMARQUE: Cette ligne permet une meilleure visualisation de l'endoprothèse dans la trachée.
3. Intuber transoralement la souris avec l'angiocatheter qui a été préchargé avec l'endoprothèse.
4. Visualisez l'endoprothèse sur l'angiocatheter dans la trachée par l'incision transcervicale (Figure 3B).
   REMARQUE: La trachée est très mince, permettant au colorant noir sur l'endoprothèse d'être visualisé à travers la trachée. Utilisez-le pour confirmer le placement trachéal correct.
5. Maintenez l'endoprothèse en place en saisissant la trachée à travers l'incision transcervicale avec de fines forceps.
6. Retirez l'angiocatheter transorally tout en maintenant une poignée sur l'endoprothèse avec les forceps fins.
   REMARQUE : Il est extrêmement important de ne pas appliquer trop de force sur l'endoprothèse pour ne pas écraser le lumen lorsque l'angiocatheter est enlevé. Cependant, une force suffisante est nécessaire pour s'assurer que l'endoprothèse n'est pas enlevée avec l'angiocatheter. Un sialendoscope de 0,8 mm peut être utilisé pour visualiser l'emplacement et le placement de l'endoprothèse dans la trachée.
7. Fermer l'incision transcervicale avec de la colle de tissu.
8. Permettre à chaque souris de retrouver son niveau d'activité d'origine avant de la remettre dans sa cage.

6. Préparation histologique des échantillons

1. Anesthésiez les souris atteintes d'anesthésique inhalé et sacrifiez les souris avec une luxation cervicale par protocole animal après 7, 14 ou 21 jours.
   REMARQUE : Selon la chronicité de l'étude, différents intervalles de temps peuvent être utilisés (p. ex., 28, 30 jours, etc.).
2. Placez une souris sur la plate-forme chirurgicale comme décrit dans les étapes 4.4 et 4.5.
3. Rouvrir l'incision du cou sur la souris à l'aide de ciseaux à iris incurvés fins.
4. Exposer la trachée par étape 4.6.
5. Divisez la trachée distale sous le niveau de l'endoprothèse à l'aide de ciseaux à iris incurvés fins.
6. Divisez la trachée proximale sous le larynx et au-dessus de l'endoprothèse à l'aide de ciseaux à iris incurvés fins.
   REMARQUE : Il est important de diviser la trachée distale d'abord pour empêcher la trachée de se rétracter dans le thorax.
7. Séparez la trachée divisée de l'œsophage postérieurement et retirez la trachée de la souris.
   REMARQUE : Les endoprothèses seront toujours conservées dans la trachée de la souris.
8. Retirer l'endoprothèse de la trachée et fixer dans 10% de formaline pendant 24 h.
9. Intégrez des spécimens de trachée de souris fixés par formaline dans la paraffine avec l'extrémité distale orientée de façon supérieure de sorte que les coupes axiales de la trachée puissent être faites dans l'étape suivante.
10. Couper des sections de 5 m de la trachée de souris incorporée à la paraffine à l'aide d'un microtome.
    REMARQUE : Les spécimens doivent être coupés axialement à partir de la trachée distale.
11. Obtenir une section représentative de 5 m tous les 250 m le long de la longueur du spécimen.
12. Affichez-vous complètement sur chaque section représentative.
    1. Déparaffiniser les diapositives en plaçant dans le xylène 2x par diapositive pendant 3 min.
    2. Placez les lames dans 100 % d'éthanol pendant 2 min, 95 % d'éthanol pendant 2 min et 70 % d'éthanol pendant 2 min pour se réhydrater.
    3. Laver les toboggans avec de l'eau courante du robinet pendant 2 min.
    4. Tainer les lames dans l'hématoxylin pendant 3 à 5 min.
    5. Laver les toboggans avec de l'eau courante du robinet pendant 5 min.
    6. Placer les lames dans 1% d'alcool acide pendant 1 min.
    7. Laver les toboggans avec de l'eau courante du robinet pendant 1 min.
    8. Rincer à 0,2 % d'eau d'ammoniac pendant 30 s.
    9. Rincer les glissières dans l'eau courante du robinet pendant 5 min. Trempez dans 95 % d'éthanol 10x.
    10. Tache d'éosine en plaçant la glissière dans la phloxine d'éosine pendant 30 s.
    11. Déshydrater les lames en plaçant dans 95% d'éthanol pendant 5 min, suivi de l'éthanol absolu 2x pour 5 min.
    12. Placer en xylène 2x pendant 5 min.
    13. Montez les diapositives avec un support de montage à base de xylène.
13. Mesurer l'épaisseur de la lamina propria telle que décrite dans Hillel et al.⁸.

7. Biocompatibilité stent in vivo

1. Préparer les sections de tissus comme dans les étapes 6.1-6.4. Ne retirez pas l'endoprothèse de ces sections trachéales afin de visualiser les changements de l'inflammation par rapport à l'emplacement de l'endoprothèse dans le lumen de la trachée.
   1. Pour déterminer la réponse aigue du corps étranger à l'endoprothèse, observez l'activité des macrophages et des lymphocytes T à l'aide de marqueurs CD3 et F4/80.
      REMARQUE : D'autres marqueurs peuvent également être utilisés pour déterminer la réaction inflammatoire aigue à l'endoprothèse.
   2. Obtenir des sections coupées de 5 m de la trachée incorporée à la paraffine sur des glissières hydrophiles et des glissières disponibles dans le commerce(tableau des matériaux). Placez deux sections sur chaque toboggan.
      REMARQUE : Ces sections devraient être d'une zone de la trachée où l'endoprothèse DePL-PCL a été placée.
2. Placer les lames en xylène 2x pendant 5 min chacune.
3. Placer les glissières dans 100% d'éthanol 2x pendant 3 min chacune.
4. Placer les lames dans 95 % d'éthanol pendant 1 min.
5. Placez les diapositives dans une grille de coloration histologique afin qu'elles soient immergées dans un tampon de récupération d'antigène(Tableau des matériaux)et placez-les dans un vapeur de légumes avec de l'eau bouillante pendant 20 min.
6. Retirez les grilles de coloration du vapeur et jetez le tampon de récupération d'antigène.
7. Remplacer le tampon par 1 ml de PBS.
8. Placer les diapositives dans une boîte à coloration humide pendant 1 min.
9. Jetez le PBS et incubez les diapositives avec le milieu d'aigle modifié de Dulbecco (DMEM) avec 10 % de FBS pendant 30 min.
10. Jeter le DMEM et ajouter un mélange de deux anticorps primaires élevés chez différentes espèces. Couvrir les diapositives de film de paraffine et couver toute la nuit à 4 oC dans une pièce sombre.
    REMARQUE: Dans ce protocole lapin anti-CD3 et rat anti-F4/80 (Tableau des matériaux) ont été utilisés.
11. Laver les diapositives en PBS 3x pendant 5 min.
12. Incuber les diapositives avec des anticorps secondaires spécifiques aux espèces d'anticorps primaires (Tableau des matériaux) dilués dans le DMEM avec 10% de FBS pour 0,5 à 1 h à température ambiante dans l'obscurité.
13. Laver les diapositives en PBS 3x pendant 5 min dans l'obscurité.
14. Montez les toboggans sur des couvertures avec une goutte de support de montage avec 4'6-diamidino-2-phenylindole (DAPI). Conserver les lames dans l'obscurité à 20 oC ou 4 oC.
15. Observez les diapositives tachées sur un microscope confocal de balayage laser et photographiez.
16. Quantifier le nombre total de cellules tachées de DAPI et d'anticorps d'intérêt pour la comparaison avec la trachée non blessée.

8. Analyse quantitative de l'expression des gènes de la trachée de souris

1. Recueillir la trachée de souris comme décrit dans les étapes 6.1-6.7 et enlever l'endoprothèse.
   REMARQUE : Les trachées de souris récoltées peuvent être conservées dans un congélateur de -80 oC pendant une durée pouvant aller jusqu'à 2 ans.
2. Desïculez le tissu trachéal récolté à l'étape 8.1 à l'aide de ciseaux fins et homogénéisez davantage à l'aide d'un homogénéisateur de moulin à perles avec des perles en céramique de 1,4 mm (Tableau des matériaux) dans le cadre d'un kit d'extraction d'ARN à base de colonnes disponible dans le commerce (Tableau des matériaux).
   REMARQUE : Réglages d'homogénéisateur de moulin à perles , un cycle de 40 s à 6 m/s.
3. Extraire l'ARN du lysate trachéal à l'aide d'un kit d'extraction et de purification à base de colonnes (Tableau des matériaux) suivant les instructions du fabricant.
4. Quantifier l'ARN de chaque échantillon à l'aide d'un spectrophotomètre (Tableau des matériaux).
   REMARQUE : La pureté de l'ARN est évaluée à l'aide du rapport de 260/230 nm avec un échantillon d'ARN pur lisant 2.0.
5. Créer de l'ADN complémentaire à partir d'ARN extrait à l'aide de transcriptase inversée(tableau des matériaux)et d'un thermocycler avec les réglages suivants : 5 min à 25 oC (amorçage), 46 oC pour 30 min (transcription inversée), puis 95 oC pour 1 min (inactivation de la transcriptase inverse).
6. Diluer les échantillons d'ADN complémentaires avec de l'eau libre de RNase à une concentration de 10 à 25 ng/mL pour une utilisation dans le PCR quantitatif en temps réel.
7. Mélanger 1 l de l'ADN complémentaire (10 à 25 ng/mL) avec 10 oL d'un mastermix PCR (Tableau des matériaux), 8 l de ddH₂O et 0,5 L de 10 apprêts avant et inversés pour le gène d'intérêt dans un puits d'une plaque PCR de 96 puits ( Tableaudes matériaux).
   REMARQUE : Le volume total dans chaque puits doit être de 20 l. Chaque puits de la plaque de puits 96 ne doit contenir qu'un seul échantillon et un gène d'intérêt.
8. Répétez les étapes 8.1-8.7 pour tous les gènes d'intérêt et exécutez chaque échantillon pour chaque gène dans triplicate.
   REMARQUE : Les amorces avant et inversées spécifiques aux gènes(Tableau des matériaux) pour le collagène 1, le collagène 3 et le gène de référence, l'actine, sont couramment utilisés pour étudier les marqueurs de la fibrose.
9. Placez la plaque de puits 96 sur la machine quantitative DE PCR en temps réel et lancez le protocole suivant : dénatureà95 oC pour 15 s et anneale et étendez-la à 60 oC pour 60 s pendant 40 cycles.
10. Normaliser la valeur seuil de cycle (CT) pour la détection des produits géniques de chaque gène d'intérêt (GOI) à la valeur de CT pour le gène de référence - actine pour tous les échantillons afin d'obtenir un TCC pour chaque GOI. Ensuite, comparez les valeurs de l'ITC pour chaque GOI pour les échantillons traités et non traités afin de générer un TCC.
    REMARQUE : Le seuil de cycle est le point sur la courbe d'amplification lorsqu'une quantité prédéterminée de produit génique est présente ( 'Rn). La valeur de chaque réaction doit être déterminée pour chaque gène d'intérêt et devrait tomber sur la partie linéaire de la courbe d'amplification.
    REMARQUE : TCT et CT (GOI) - CT (gène de référence); CT 'CT 'CT (traité) 'CT 'CT (non traité).
11. Calculer le changement relatif dans l'expression des gènes entre les échantillons traités et non traités comme une expression de changement de pli en calculant 2^CT.

Résultats

La construction d'endoprothèse stent Biodégradable PLLA-PCL chargée de rapamycine utilisée dans cette étude était capable d'éluder la rapamycine d'une manière cohérente et prévisible dans des conditions physiologiques (figure 1). La figure 2 montre l'endoprothèse PLLA-PCL projetée autour d'un angiocatheter de 22 G pour une utilisation dans un modèle murine de LTS. Pour déterminer si les effets de l'élution de rapamycine dans la trachée sont effic...

Discussion

Les étapes les plus critiques pour construire et utiliser avec succès un stent d'élution de drogue in vivo sont 1) déterminer le rapport optimal De PLLA-PCL pour le taux d'élution de drogue souhaitable, 2) déterminer la concentration appropriée de drogue à élucer, 3) moulant les endoprothèses autour de l'angiocatheter pour l'utilisation in vivo, et 4) transorally livrant l'endoprothèse dans les souris après induction de LTS sans causer l'obstruction mortelle de voie aérienne.

Bien...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
1. For stent
22-gauge angiocatheter	Jelco	4050
Dichloromethane	Sigma Aldrich	270997-100ML
Glycerol	Fisher Scientific	56-81-5	Available from other vendors as well.
PDLGA	Sigma Aldrich	739955-5G
PLLA-PCL (70 : 30)	Evonik Industries AG	65053
Rapamycin	LC Laboratories	R-5000
2. Animal surgery
Wire brush	Mill-Rose Company	320101
3. For immunohistochemistry staining
Antigen retrival buffer	Abcam	ab93678	Available from other vendors as well; acidic pH needed
DAPI	Cell Signaling	8961S
DMEM	ThermoFisher Scientific	11965-092	Available from other vendors as well.
FBS (Fetal Bovine Serum)	MilliporeSigma	F4135-500ML
Goat anti-rabbit-488 antibody	Lif technology	a11008
Goat anti-rat-633 antibody	Lif technology	a21094
Hydrophilic plus slide	BSB7028
PBS	ThermoFisher Scientific	100-10023	Available from other vendors as well.
Rabbit anti-CD3 antibody	Abcam	ab5690
Rat antiF4/80 antibody	Biolengend	123101
Zeiss LSM 510 Meta Confocal Microscope	Zeiss
4. For quantative PCR
0.5mm glass beads	OMNI International	19-645
Bead Mill Homoginizer	OMNI International
Gene Specific Forward/Reverse Primers	Genomic Resources Core Facility
Nanodrop 2000 spectrophotometer	Thermo Scientific
Power SYBR Green Mastermix	Life Technologies	4367659
RNeasy mini kit	Qiagen	80404
StepOnePlus Real Time PCR system	Life Technologies