עיצוב של משחררי ביוטינג לסמים ביולוגיים בעכברים עם היצרות לרינגוקנה

Summary

היצרות לרינגוקנה התוצאות מתוך התצהיר צלקת פתולוגית כי באופן ביקורתי מצמצמת את דרכי הנשימה הקנה וחסר טיפולים רפואיים יעילים. באמצעות PLLA-PCL (70% פולי-L-lactide ו-30% pvc) סטנט כמערכת שילוח סמים מקומי, טיפולים פוטנציאליים המיועדים להפחתת התפשטות הצלקת בקנה הנשימה ניתן ללמוד.

Abstract

היצרות לרינגוקנה (הארה ב) היא היצרות פתולוגית של תת-הבית וקנה הנשימה המוביל לחסימה מחוץ לבית החזה וקוצר נשימה משמעותי. התוצאות של המנהיג מפציעה מגוף זר בקנה הנשימה, המובילה לפגיעה ברקמות ותגובה דלקתית מקומית אשר משתבש, המובילה לתצהיר של רקמת צלקת פתולוגית. הטיפול עבור הארה הוא כירורגי עקב חוסר טיפולים רפואיים יעילים. מטרת שיטה זו היא לבנות סטנט תואם ביולוגי זה יכול להיות מיניאטורי למקום עכברים עם הארה. הדגמנו כי PLLA-PCL (70% פולי-L-lactide ו-30% polycaprolactone) בונה היה חוזק ביומכאני אופטימלי, היה ביולוגי תואם, מעשית עבור vivo מיקום סטנט, ומסוגל להתחמק תרופה. שיטה זו מספקת מערכת העברת תרופות לבדיקת סוכנים אימונומודולטוריים שונים כדי לעכב את הדלקת באופן מקומי ולהפחית פיברוזיס של דרכי הנשימה. ייצור סטנטים לוקח 28 שעות וניתן לשכפל בקלות ולאפשר ניסויים עם כנופיית גדולים. כאן אנו שילב את rapamycin התרופה בתוך סטנט כדי לבדוק את יעילותו בהפחתת פיברוזיס והתצהיר קולגן. התוצאות התגלו כי האוהלים PLLA-PCL הראו לשחרר rapamycin אמין, היו יציבים מכנית בתנאים פיסיולוגיים, היו תואמים ביולוגית, וגרימת תגובה דלקתית קטנה בקנה הנשימה. נוסף על כך, הפחתת הצלקת של היווצרות הצלקות בקנה הנשימה בvivo.

Introduction

היצרות לרינגוקנה (הארה ב) היא היצרות פתולוגית של קנה הנשימה לרוב בשל פציעה הפוסט-צנרור. השילוב של הקולוניזציה החיידקית, תגובת גוף זר למעי הגס או צינורית אנדוקנה, וגורמים ספציפיים למטופל מובילים לתגובה דלקתית חריגה. זה התגובה החיסונית מסתגלת מוביל התצהיר של קולגן בקנה הנשימה, וכתוצאה מכך היצרות הלומיאל של קנה הנשימה ואת היצרות הבאים^1,2. כמו הטיפול הנוכחי עבור מחלה זו היא כירורגית בעיקר, פיתוח אלטרנטיבה רפואית מבוססת טיפול הפרדיגמה מיקוד מסלולים דלקתיים והפרופיברוטיים להוביל התצהיר קולגן מוגזם נחקרו. Rapamycin, אשר מעכב את מתחם ה-mTOR איתות, הוכח כי יש אפקטים חיסוני מדכאים, כמו גם אפקט אנטיפיברוסט חזק. עם זאת, כאשר rapamycin הוא מנוהל באופן מערכתית, תופעות לוואי נפוצות (למשל, hyperlipidemia, אנמיה, תרומבוציטופניה) יכול להיות מבוטא³. מטרת המתודולוגיה שלנו היא לפתח רכב עבור משלוח סמים מקומי מעשית לשימוש בדרכי הנשימה כי היה להפחית את ההשפעות הללו מערכתית. ההערכות שלנו מתמקדות בחקירת התגובה החיסונית המקומית לבניית משלוח הסמים, כמו גם יכולתו לעכב את התפקוד הפיברוהפיצוץ ולשנות את הסביבה החיסונית המקומית. תוצאות ספציפיות למחלות כוללות בדיקות vivo כי הערכת סמנים של פיברוזיס.

סטנטים מתכלים לתרופות מתכלה שימשו במודלים של בעלי חיים של מחלות במערכות איברים מרובות, כולל נתיב האוויר⁴. לניהול היצרות בדרכי הנשימה או קריסה, החקירות הקודמות השתמשו סיליקון מצופה סמים וסטנטים מבוססי ניקל⁵. בניית PLLA-PCL נבחרה עבור שיטה זו מסוימת בגלל הפרופיל שלה משחרלי התרופה וחוזק מכני בתנאים פיסיולוגיים במשך תקופה של 3 שבועות, אשר הוכח במחקרים הקודמים שפורסמו⁶. PLLA-PCL הוא גם חומר ביולוגי תואם ומתכלה כבר אושרה על ידי ה-FDA⁴. משחררי סטנטים ביולוגיים ו-MMC נבדקו בדגמי בעלי חיים גדולים כגון ארנבים וכלבים. עם זאת, במודלים אלה של בעלי חיים, סטנטים לא הושמו במודל בעל חיים של מחלות והושתל השתלת עצמות. מחקר זה מספק שיטה ייחודית להערכת סטנט ביולוגי משחררי התרופות ממוקם transorally במודל העכבר של פציעה בדרכי הנשימה והיצרות לרינגוקנה. סטנט תואם ביולוגי המפריש תרופה חיסונית מקומית והוא יכול להיות מיניאטורי למחקר במודל murine הוא בעל ערך עבור מחקר טרום המחקר הקליני. נסיונות קודמים לניצול סטנט עם מבנה חומרים אחרים שנוצר תגובות גוף זר חזק החמרה הדלקת הבסיסית המבדיל את הארה ב⁷. מתודולוגיה זו, לידיעתנו, היא הראשונה מסוגו ללמוד את ההשפעות האימונומודולטיות והאנטי פיברופטיים של מערכת העברת תרופות מבוססת-סטנט במודל של מורטין. המודל המורין עצמו מציע מספר יתרונות לחקר ההשפעות של סם אימונומודוללי על קנה הנשימה. עכברים מהונדסים גנטית וגדודים ניסיוני של עכברים בריאים וחולים ניתן ללמוד, אשר יכול להוביל לשינוי ניסיוני ולשפר עלות יעילות. יתר על כן, המסירה של סטנט העברת לתוך קנה הנשימה של העכבר מחקה משלוח קליני של סטנט כזה בבני אדם, אשר עוד מדגיש את היתרון הטרנסלייתי של שיטה זו. לבסוף, הקלות היחסית שבה הסטנט PLLA-PCL עם התרופה ניתן לייצר מאפשר שינויים כדי לספק טיפולי סמים חלופיים מכוון להפחתת צלקת היווצרות בקנה הנשימה.

Protocol

הערה: כל השיטות המתוארות כאן אושרו על ידי הוועדה לטיפול בבעלי חיים של אוניברסיטת ג'ונס הופקינס (MO12M354).

1. הכנת רפצין ב-PLLA-PCL

1. הכינו שתי בקבוקים מזכוכית (עם כמוסות) של 70:30 PLLA-PCL פולימר פתרונות (צמיגות הגלום 1.3 כ 1.8 DL/G; רשימת חומרים) פתרונות, עם בקבוקון אחד המכיל 1.0% rapamycin והשני ללא rapamycin.
   1. לעשות 1.0% rapamycin המכיל פתרון פולימרי על ידי הוספת 6 מ"ג rapamycin ל 600 מ"ג של 70:30 PLLA-PCL בבקבוקון זכוכית.
   2. עבור פתרון פולימרי ללא rapamycin (שליטה), רק להוסיף 600 mg של 70:30 PLLA-PCL לבקבוקון זכוכית.
2. מתחת למכסה המנוע, הוסיפו 6 מ ג של דילורומתאן לכל בקבוקון זכוכית.
   התראה: Diלורומתאן הוא חומר מאכל רק בפיפטות זכוכית יש להשתמש. אמצעי זהירות מתאימים לבטיחות כוללים הגנת עיניים אישית וכפפות.
3. הוסף 120 μL של גליצרול לכל בקבוקון זכוכית (עבור 2% גליצרול הפתרון).
   הערה: התוספת של גליצרול מאפשרת גמישות מוגברת ונוקשות מצומצמת במבנה סטנט.
4. לסכם את מבחנות זכוכית ולאפשר 70:30 PLLA-PCL עם וללא rapamycin להתמוסס המגון עבור 6-12 h.
   הערה: ניתן להניח מבחנות זכוכית גם על פלטפורמת טלטול מסתובבת לפירוק מהיר יותר.

2. בדיקת הימנעות rapamycin

1. פיפטה 1 מ ל של 70:30 התמיסה PLLA-PCL המכילה 1% rapamycin לתוך צלחת פטרי זכוכית.
   הערה: נפח זה של 70:30 PLLA-PCL פתרון המכיל 1% rapamycin יכיל 120 μg של rapamycin ומייצג את הסכום הכולל של rapamycin בכל מבנה. ניתן להשתמש באמצעי אחסון חלופיים ובריכוזים.
2. אפשר 70:30 PLLA-PCL עם 1% rapamycin להתקשות לתוך דיסק שטוח בצלחת פטרי זכוכית.
3. מוקשח פעם, מניחים את הדיסק ב 2 מ ל של פוספט מלוחים באגירה (PBS, pH 7.4) ו דגירה ב-37 מעלות צלזיוס בחדר.
4. לאסוף ולהחליף את PBS (2 מ ל) כל 24 h ולהשתמש אסף PBS עבור ביצועים גבוהים נוזלי כרומטוגרפיה (בדיקות) ניתוח של התוכן rapamycin.
5. השתמש בדוגם אוטומטי ובעמודת כיול של C₁₈ 4.6 ס"מ x 250 מ"מ כדי להפעיל דגימות באמצעות מזרק לדוגמה אוטומטית יחד עם דילול סדרתי של rapamycin כדי ליצור עקומת סטנדרטי מכויל. הפעל כל דוגמה בטרילקטה.
   הערה: דילול סדרתי של rapamycin להיבדק כוללים 10%, 1%, 0.1%, ו 0.01%.
6. השתמש בשלב נייד של המים בכיתות ובאמצעות מערכת השמע וה10/90 עם נפח הזרימה של 2.0 mL/min. הגדרת ספיגת במהלך השימוש במיניצין ל-280 nm.
   הערה: איור 1 מציג את הימנעות rapamycin במשך 14 יום.

3. יצירת rapamycin-משחררי PLLA-PCL מורטין סטנטים לדרכי הנשימה

הערה: בצע את השלבים 3.2-3.9 באמצעות חומרים סטריליים וטכניקה סטרילית כדי למנוע זיהום שישפיע בvivo וביישומים החוץ-גופית.

1. הכינו פתרונות PLLA-PCL המכילים rapamycin כפי שמתואר בסעיף 1.
2. באמצעות זכוכית פסטר הצינורות עם בלון גומי, להחיל 1 מ ל של הפתרון PLLA-PCL המכיל 1% rapamycin על צינורית ורידים של 22 פרופילן G fluorinated המבוסס על אתילן הקטטר (טבלת חומרים). החזיקו את הקטטר ביד אחת והשתמשו בפיפטה זכוכית כדי להוריד את התמיסה PLLA-PCL על הקטטר. סובב לאט את הקטטר כדי להבטיח כיסוי הומוגנית של הקטטר עם פתרון PLLA-PCL.
   הערה: בהתחלה, הפתרון PLLA-PCL יהיה דק, אבל כמו diלורומתאן מתאדה במהלך היישום על הקטטר האנגיו, הפתרון יהיה יותר צמיל עובש על ה-אנגיוצנתר. באופן רציף מפנה את הקטטר במהלך היישום הוא מועיל. שלב זה חייב להיעשות לאט ובקפדנות כדי להבטיח את עובי עקבי של סטנט.
3. השען את הקטטר היצוק עם קצה הקטטר הפונה כלפי מטה והניצב בקצה צלחת פטרי מזכוכית לייבוש.
4. אפשר סטנטים לייבוש במשך 24 שעות במכסה ואקום בטמפרטורת החדר (איור 2א).
5. להסיר את המבנה סטנט מתוך הקטטר הבסיסי הבסיס ידי פיתול בעדינות את הקטטר הבסיסי חינם והחלקת אותו מתוך סטנט יצוק (איור 2ב).
6. בדוק את הסטנט בדרך לפגמים שאולי הביאו במהלך תהליך הליהוק. אם יש פגם בסטנט הקיים, מחק אותו.
7. חתוך כל קצה של סטנט באמצעות מספריים ישרים דקים כך הקצוות הם צירית.
8. באמצעות מספריים ישרים משובחים, גזור 3 מקטעי ציר מילימטר של סטנט יצוק לשימוש במודל העכבר של הארה (איור 2ג).
   הערה: כ-8 סטנטים ניתן לעשות מקטטר אחד של אנגיוסטד, עם כל סטנט 3 מ"מ המכיל 120 μg של rapamycin.
9. לטעון את הסטנט 3 מ"מ על צנתר חדש 22 ורידי לשימוש במודל העכבר של הארה (איור 1).

4. לרינגוקנה היצרות אינדוקציה של עכברים

1. לפני ניצוח בvivo העכברים לקבל אישור הוועדה לטיפול בבעלי חיים והשתמש.
2. הC57BL זכר בן 9 שבועות על ידי מתן הזרקה תוך-הצפק של קטמין (80-100 מ"ג/ק"ג) ו-xylazine (5-10 מ"ג/ק"ג).
   הערה: זנים אחרים של עכברים ניתן להחליף, אבל מומלץ כי משקל עכברים להיות בין 20-27 g.
3. אקראי עכברים לתוך קבוצה ניסיונית (פציעה כימית עם מיקום של 1% rapamycin המכילים סטנט PLLA-PCL) ושתי קבוצות שליטה: 1) פציעה כימית עם מיקום של סטנט PLLA-PCL, 2) פציעה כימית ללא יקום של סטנט.
4. מניחים עכבר על מצע כירורגי במצב פרקדן. השתמש לולאה קטנה של חוט המוצמדת לחלק העליון של הפלטפורמה כדי להאריך את עמוד השדרה הצווארי על ידי לולאה אותו סביב חותכות המרכזי.
5. לצרף את הידיים והרגליים של העכבר על השולחן באמצעות 2 אינץ ' חתיכות של קלטת. צביטה כף העכבר כדי להבטיח כי יש לו הרדמה נאותה.
6. . האתר הכירורגי מוכן את הפרווה שמעליה יש להסיר את העור יש לנקות (יוד לסירוגין או לקרצף כלוראידין עם אלכוהול או חיטוי העור מדולל) שלוש פעמים. האזור צריך להיות עטוף כפפות סטרילי להיות שחוקים. הכלים הסטריליים יש לשכב על משטח סטרילי כאשר לא בשימוש.
7. הפוך 1.5 ס מ לחיתוך אנכי באמצע הדרך בצוואר של העכבר באמצעות מספריים מעוקל קשתית עדין. לחלק את התימוס מעל ולאחד את שתי האונות וכתוצאה מכך לדמיין את קנה הנשימה. חלק את לשון הלשון ואת סטרנותריס (רצועה) השרירים בבקיעים המצורף העליון.
   הערה: מתחם האנדוסקופי כולו צריך להיחשף לחלוטין לאחר מכן.
8. העבירו צנתר באורך 22 גר'. דרך הגרון לתוך קנה הנשימה השתמש מלקחיים קטנים כדי להחיל לחץ על הגרון הקדמי של העכבר כדי לסייע במיקום הנכון של הקטטר אנגיו. דמיינו את הצנתר הלבן אנגיוקטטר דרך קנה הנשימה כדי להבטיח מיקום נכון (לא הוושט).
   הערה: קנה הנשימה של העכבר הוא דק מאוד והקטטר לבנה אנגיוזה יהיה לדמיין דרך קנה הנשימה שקוף.
9. להעביר מברשת חוט מצופה ליאומיצין באמצעות הקטטר שנוספו האנגיו.
10. לסגת לאט באיטיות את הקטטר כך שרק מברשת התיל תישאר בקנה הנשימה.
11. להחיל לחץ מונה באמצעות מלקחיים עדינים על קנה הנשימה כדי לשבש מכנית את הקנה לומן עם מברשת התיל.
12. הכנס את הקטטר לקנה הנשימה. מעל מברשת התיל
13. הסר את מברשת התיל והחלה מחדש ליאומיצין.
14. חזור על שלבים 4.8-4.12 סך של 5x. החל ליאומיצין על המברשת בין כל יישום.
    הערה: ניתן למצוא את האימות והתיאור של מודל זה בהלל ואח '⁸.
15. הסירו את הקטטר. מקנה הנשימה של העכבר
    הערה: אם אין סטנט להציב, החתך יכול להיות סגור עם דבק רקמות.

5. מיקום סטנט בעכברים

1. טען אחד 3מילימטרהקשד הסטנט אל מרוקן 22 G אנגיוצנתר (איור 3א).
   הערה: הסטנט צריך לנוח 5 מ"מ מקצה הקטטר.
2. לצייר קו דק שחור אנכי על סטנט 3 מ"מ הקשד.
   הערה: קו זה מאפשר ויזואליזציה משופרת של סטנט בקנה הנשימה.
3. Transorally העכבר עם הצנתר אנגיוזה כבר טעונה מטעון עם סטנט.
4. המחש את הסטנט על הקטטר בקנה הנשימה דרך החתך החוצה (איור 3ב).
   הערה: קנה הנשימה הוא דק מאוד, ומאפשר לצבוע שחור על סטנט להיות מדמיין דרך קנה הנשימה. השתמש באפשרות זו כדי לאשר את מיקום הקנה הנכון.
5. להחזיק את הסטנט במקום על ידי מחזיק את קנה הנשימה דרך החתך החוצה עם מלקחיים עדינים.
6. הסר את ההמרה אנגיוקטטר בעוד שמירה על אחיזה על סטנט עם מלקחיים עדינים.
   הערה: חשוב מאוד לא להחיל כוח רב מדי כדי סטנט לא למחוץ את לומן כאשר הקטטר אנגיול מוסר. עם זאת, מספיק כוח נדרש כדי להבטיח סטנט לא מוסר עם הקטטר אנגיו. Sialendoscope 0.8 mm יכול לשמש כדי להמחיש את המיקום ואת המיקום של סטנט בקנה הנשימה.
7. סגור את החתך החוצה. עם דבק רקמות
8. אפשר לכל עכבר להתאושש לרמת הפעילות המקורית שלו לפני שתמקם אותו חזרה בכלוב שלו.

6. הכנה היסטולוגית של דגימות

1. עכברים מורדם עם שאיפה הרדמה ועכברים להקריב עם פריקה צוואר הרחם לכל פרוטוקול בעלי חיים לאחר 7, 14, או 21 ימים.
   הערה: מבוסס על המתעד של המחקר, מרווחי זמן שונים ניתן להשתמש (למשל, 28, 30 ימים, וכו ').
2. הצב עכבר על הפלטפורמה כירורגית כפי שמתואר בשלבים 4.4 ו 4.5.
3. פתח מחדש את החתך הצוואר על העכבר באמצעות מספריים מעוקל קשתית עדין.
4. לחשוף את קנה הנשימה לשלב 4.6.
5. לחלק את קנה הנשימה המרוחק מתחת לרמה של סטנט באמצעות מספריים מעוקל קשתית עדינה.
6. לחלק את קנה הנשימה הקודם מתחת לגרון ומעל סטנט באמצעות מספריים קשתית עדין מעוקל.
   הערה: חשוב לחלק תחילה את קנה הנשימה המרוחק כדי למנוע את המשך הנשימה לתוך החזה.
7. הפרד את קנה הנשימה מחולק מן הוושט פוקטילי ולהסיר את קנה הנשימה מהעכבר.
   הערה: סטנטים יישמרו עדיין בתוך קנה הנשימה של העכבר.
8. להסיר סטנט מקנה הנשימה ולתקן 10% פורמלין עבור 24 h.
9. הטמע formalin-קנה הנשימה של העכבר קבוע בתוך פרפין עם הקצה המרוחק מונחה מוכוונת כך חתכים צירית של קנה הנשימה ניתן לעשות בשלב הבא.
10. גזור 5 יקרומטר סעיפים של קנה הנשימה פרפין עכבר מוטבע באמצעות microtome.
    הערה: יש לגזור את הדגימות באופן שמתחיל מקנה הנשימה המרוחק.
11. להשיג מקטע מייצג 5 יקרומטר כל 250 יקרומטר לאורך הדגימה.
12. השלם H & E כתם על כל סעיף נציג.
    1. לחלק את השקופיות על ידי הצבת ב-קסילן 2x לכל שקופית עבור 3 דקות.
    2. מניחים את השקופיות ב 100% אתנול עבור 2 דקות, 95% אתנול עבור 2 דקות, ו 70% אתנול עבור 2 דקות כדי לשחזר.
    3. שטוף את השקופיות עם מי ברז זורמים עבור 2 דקות.
    4. הכתם את השקפים במטאוקסילין במשך 3 עד 5 דקות.
    5. שטוף את השקופיות עם מי ברז זורמים עבור 5 דקות.
    6. מניחים את השקופיות ב 1% חומצת אלכוהול במשך 1 דקות.
    7. שטוף את השקופיות עם מי ברז זורמים עבור 1 דקות.
    8. לשטוף ב 0.2% אמוניה מים עבור 30 s.
    9. לשטוף את השקופיות בריצה מי ברז עבור 5 דקות. לטבול ב 95% אתנול 10x.
    10. אאוזין כתם על ידי הצבת שקופית ב אאוזין phloxine עבור 30 s.
    11. מייבשים את השקופיות על ידי הצבת 95% אתנול עבור 5 דקות, ואחריו אתנול מוחלט 2x עבור 5 דקות.
    12. מקום ב קסילן 2x עבור 5 דקות.
    13. טעינת השקופיות באמצעות מדיום הרכבה מבוסס קסילן.
13. למדוד את העובי של האמינה כמתואר בהלל ואח '^.8.

7. התאמה ביולוגית סטנט בvivo

1. הכינו חתכי רקמה בשלבים 6.1-6.4. אין להסיר סטנט מתוך אלה מקטעי הקנה כדי להמחיש את השינויים בדלקת ביחס למיקום של סטנט בתוך לומן של קנה הנשימה.
   1. כדי לקבוע את תגובת גוף זר חריפה סטנט, להתבונן מקרופאג ו-T פעילות התא באמצעות CD3 ו F4/80 סמנים.
      הערה: סמנים אחרים יכולים לשמש גם כדי לקבוע תגובה דלקתית חריפה סטנט.
   2. השג 5 יקרומטר לגזור סעיפים של הפרפין מוטבע קנה הנשימה על הידרופילי זמין מסחרית בתוספתשקופיות (טבלת חומרים). מקם שני מקטעים בכל שקופית.
      הערה: מקטעים אלה צריכים להיות מאזור קנה הנשימה שבו הוצב סטנט PLLA-PCL.
2. מקם את השקופיות ב-קסילן 2x עבור 5 דקות כל אחת.
3. מניחים את השקופיות ב 100% אתנול 2x עבור 3 דקות כל אחד.
4. מניחים את השקופיות ב 95% אתנול עבור 1 דקות.
5. מניחים את השקופיות בארון כתמים היסטולוגיה כך שהם שקועים מאגר אחזור אנטיגן (טבלת חומרים) ולאחר מכן מניחים בסיר ירקות עם מים רותחים במשך 20 דקות.
6. להסיר את המדפים מכתים מן הקיטור ולמחוק את מאגר אחזור אנטיגן.
7. החלף את המאגר באמצעות 1 mL של PBS.
8. מקם את השקופיות בתיבה מכתימה רטובה עבור 1 דקות.
9. התעלם מערוץ ה-PBS והעבר את השקופיות עם מדיום הנשר השונה של Dulbecco (DMEM) עם 10% FBS במשך 30 דקות.
10. השמט את DMEM והוסף תערובת של שני נוגדנים עיקריים שהועלו במינים שונים. כסו את השקופיות עם סרט פרפין והמשך הלילה ב -4 ° c בחדר חשוך.
    הערה: בפרוטוקול זה הארנב anti-CD3 ועכבר anti-F4/80 (טבלת חומרים) שימשו.
11. שוטפים את השקופיות ב-PBS 3x עבור 5 דקות.
12. מודלת את השקופיות עם נוגדנים משני ספציפיים מינים הנוגדן העיקרי (טבלת חומרים) מדולל ב-dmem עם 10% fbs עבור 0.5-1 h בטמפרטורת החדר בחושך.
13. שוטפים את השקופיות ב-PBS 3x עבור 5 דקות בחושך.
14. הר את השקופיות על כיסוי עם טיפה של בינוני הרכבה עם 4 ' 6-diamidino-2-פניינילידול (DAPI). אחסן את השקופיות בחשיכה ב-20 ° צ' או 4 ° c.
15. שימו לב לשקופיות המוכתמות על מיקרוסקופ וצילום של סריקת לייזר.
16. לכמת את המספר הכולל של תאים מכתים עם DAPI ונוגדנים של עניין להשוואה לקנה הנשימה לא נפגע.

8. קנה הנשימה כמותי ניתוח ביטוי גנים

1. לאסוף את קנה הנשימה של העכבר כפי שמתואר בשלבים 6.1-6.7 ו להסיר סטנט.
   הערה: שנקטפו קנה הנשימה של העכבר כפי שניתן לאחסן במקפיא של 80 ° c עד 2 שנים.
2. התייבשות רקמת הקנה שנקטפו בשלב 8.1 באמצעות מספריים עדינים ועוד הומוגון באמצעות מטחנת חרוז הומוגניצר עם 1.4 מ"מ חרוזים קרמיקה (טבלה של חומרים) כחלק מסחרית זמין טור מבוסס מערכת החילוץ של RNA (טבלת חומרים).
   הערה: חרוז במיל הגדרות הגדרה = 1 40 s מחזור ב 6 מטרים לשנייה.
3. לחלץ RNA מן הקנה אל ליפוסט באמצעות החילוץ מבוסס עמודה ערכת טיהור (טבלת חומרים) בעקבות הוראות היצרן.
4. לכמת RNA מכל מדגם באמצעות ספקטרוסקופיה (טבלת חומרים).
   הערה: הטוהר RNA מוערך באמצעות היחס 260/230 ננומטר עם מדגם RNA טהור הקריאה 2.0.
5. יצירת דנ א משלים מ-RNA מופק באמצעות היפוך הטרנסקריפטאז (שולחן חומרים) והציקלניה עם ההגדרות הבאות: 5 דקות ב -25 ° צ' (הטרמה), 46 ° c עבור 30 דקות (שעתוק הפוך), ולאחר מכן 95 ° c עבור 1 דקות (הפעלה של היפוך הטרנסקריפטאז).
6. לדלל דגימות DNA משלימים עם RNase מים ללא תשלום לריכוז של 10-25 ng/mL לשימוש כמותי בזמן אמת-PCR.
7. מערבבים 1 μL של ה-DNA המשלים (10/25 ng/mL) עם 10 μL של שילוב מאסטר של ה-PCR (טבלת חומרים), 8 Μl של ddh₂O ו-0.5 Μl של 10 μm קדימה והפוך התחל עבור הגן של עניין אחד טוב של הצלחת 96-היטב PCR (טבלת חומרים).
   הערה: הנפח הכולל בכל טוב צריך להיות 20 μL. כל טוב על 96 צלחת הבאר צריך להכיל רק דוגמה אחת גן אחד של עניין.
8. חזור על שלבים 8.1 – 8.7 עבור כל הגנים של עניין ולהפעיל כל מדגם עבור כל גן בטרילקאט.
   הערה: היסוד הגנטי הקדמי והפוך (טבלה של חומרים) עבור קולגן 1, קולגן 3, ואת הגן התייחסות β-actin משמשים בדרך כלל כדי לחקור סמנים של פיברוזיס.
9. מניחים את הצלחת 96 על מכונת ה-PCR כמותי בזמן אמת וליזום את הפרוטוקול הבא: השעה 95 ° צ' עבור 15 s ו-להאריך ב 60 ° צ' עבור 60 s עבור 40 מחזורים.
10. לנרמל את ערך הסף של המחזור (CT) עבור זיהוי מוצר גנטי של כל גן של עניין (הגוי) לערך ה-CT עבור הגן ההפניה β-actin עבור כל הדגימות כדי לקבל ΔCT עבור כל האלה. לאחר מכן, השווה את ערכי ΔCT עבור כל הגוי עבור דגימות מטופלים ולא מטופלים כדי ליצור ΔΔCT.
    הערה: סף המחזור הוא הנקודה בעקומת הגברה כאשר כמות קבועה מראש של מוצר גנטי קיים (ΔRn). הערך ΔRn עבור כל תגובה צריך להיקבע עבור כל גן של עניין, צריך ליפול על החלק הליניארי של עקומת הגברה.
    הערה: ΔCT (CT) – CT (גן התייחסות); ΔΔCT = ΔCT (מטופל) – ΔCT (לא מטופל).
11. חשב את השינוי היחסי בביטוי הגנים בין דגימות שטופלו ללא טיפול כביטוי של שינוי קיפול על-ידי חישוב 2^ΔΔCT.

תוצאות

מתכלה PLLA-PCL סטנט לבנות טעון עם rapamycin בשימוש במחקר זה היה מסוגל להתחמק rapamycin בצורה עקבית וצפויה בתנאים פיסיולוגיים (איור 1). איור 2 מראה את הסטנט של plla-PCL בסביבות 22 G אנגיוקטטר לשימוש במודל murine של הארה. כדי לקבוע אם ההשפעות של הימנעות rapamycin בקנה הנשימה היא יעילה פי...

Discussion

הצעדים הקריטיים ביותר עבור בהצלחה בנייה ושימוש סטנט משחררי התרופה ב vivo הם 1) קביעת היחס האופטימלי של PLLA-PCL עבור שיעור התרופה הרצוי, 2) קביעת הריכוז המתאים של התרופה כדי להיות משתמט, 3) ליציקת סטנטים סביב הקטטר לשימוש vivo, ו 4) מעביר את הסטנט לתוך העכברים לאחר האינדוקציה של הארה ב מבלי לגרום לחסימ...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
1. For stent
22-gauge angiocatheter	Jelco	4050
Dichloromethane	Sigma Aldrich	270997-100ML
Glycerol	Fisher Scientific	56-81-5	Available from other vendors as well.
PDLGA	Sigma Aldrich	739955-5G
PLLA-PCL (70 : 30)	Evonik Industries AG	65053
Rapamycin	LC Laboratories	R-5000
2. Animal surgery
Wire brush	Mill-Rose Company	320101
3. For immunohistochemistry staining
Antigen retrival buffer	Abcam	ab93678	Available from other vendors as well; acidic pH needed
DAPI	Cell Signaling	8961S
DMEM	ThermoFisher Scientific	11965-092	Available from other vendors as well.
FBS (Fetal Bovine Serum)	MilliporeSigma	F4135-500ML
Goat anti-rabbit-488 antibody	Lif technology	a11008
Goat anti-rat-633 antibody	Lif technology	a21094
Hydrophilic plus slide	BSB7028
PBS	ThermoFisher Scientific	100-10023	Available from other vendors as well.
Rabbit anti-CD3 antibody	Abcam	ab5690
Rat antiF4/80 antibody	Biolengend	123101
Zeiss LSM 510 Meta Confocal Microscope	Zeiss
4. For quantative PCR
0.5mm glass beads	OMNI International	19-645
Bead Mill Homoginizer	OMNI International
Gene Specific Forward/Reverse Primers	Genomic Resources Core Facility
Nanodrop 2000 spectrophotometer	Thermo Scientific
Power SYBR Green Mastermix	Life Technologies	4367659
RNeasy mini kit	Qiagen	80404
StepOnePlus Real Time PCR system	Life Technologies