与拉林戈切尔·斯泰斯·斯泰斯特的小鼠中生物相容性药物-脱酸支架的设计

摘要

喉管狭窄狭窄源于病理性疤痕沉积，严重缩小气管气道，缺乏有效的医疗疗法。使用PLLA-PCL（70%多L-乳酸酯和30%多氯环）支架作为局部药物输送系统，可以研究旨在减少气管疤痕增殖的潜在疗法。

摘要

喉管狭窄狭窄 （LTS） 是一种病理性狭窄下眼底和气管，导致外胸阻塞和呼吸明显急促。LTS 的起因是气管中异物的粘膜损伤，导致组织损伤和局部炎症反应，导致病理疤痕组织的沉积。由于缺乏有效的医疗疗法，LTS的治疗是外科手术。这种方法的目的是构建一个生物相容的支架，可以小型化，放入带有LTS的小鼠中。我们证明，PLLA-PCL（70%多L-乳酸酯和30%多氯酰丙酮）结构具有最佳的生物力学强度，具有生物相容性，对体内放置支架可行，并且能够脱脂药物。该方法为测试各种免疫调节剂提供药物输送系统，以局部抑制炎症，减少气道纤维化。制造支架需要 28-30 小时，可轻松复制，允许对大型组组进行实验。在这里，我们结合药物雷帕霉素在支架中，以测试其有效性，以减少纤维化和胶原蛋白沉积。结果表明，PLLA-PCL帐篷具有可靠的拉帕霉素释放，在生理条件下机械稳定，且具有生物相容性，在气管中引起炎症反应小。此外，拉帕霉素-脱脂PLLA-PCL支架减少了体内气管的疤痕形成。

引言

喉管狭窄狭窄 （LTS） 是气管的病理性收缩，最常见的原因是异位后插管损伤。细菌殖民化、异体对气管切开术或内切管的反应，以及患者特异性因素的组合导致异常炎症反应。这种不适应的免疫反应导致胶原蛋白在气管沉积，导致气管的亮度变窄，随后的狭窄^1，2。由于目前治疗这种疾病主要是外科手术，开发一种替代的基于医学的治疗模式，针对导致过度胶原蛋白沉积的异常炎症和亲纤维化途径。拉帕霉素，抑制mTOR信号复合物，已被证明具有免疫抑制作用以及强大的抗纤维细胞效果。然而，当雷帕霉素是系统施用，常见的副作用（例如，高脂血症，贫血，血小板减少症）可以明显³。我们的方法的目的是开发一种本地药物输送工具，用于气道，以减轻这些系统影响。我们的评估侧重于调查药物输送结构的局部免疫反应及其抑制成纤维细胞功能和改变局部免疫微环境的能力。疾病特定结果包括评估纤维化标志物的体内测试。

生物降解药物脱毒支架已用于多种器官系统（包括气道^4）的疾病动物模型。为了管理气道狭窄或坍塌，以前的研究已经使用了药物涂层硅胶和镍基支架^5。PLLA-PCL结构被选择为这种特殊的方法，因为它的药物洗脱配置文件和机械强度在生理条件下在3周内，这已经证明在以前的出版研究^6。PLLA-PCL也是一种生物相容性和可生物降解的材料，已经获得^FDA4的批准。在大型动物模型（如兔子和狗）中研究了与生相容的支架，以驱除顺铂和MMC。然而，在这些动物模型中，支架没有被放置在动物疾病模型中，并且被植入转子。这项研究为评估一种生物相容性药物脱毒支架提供了一种独特的方法，该支架在小鼠模型中被横向放置，用于气道损伤和喉部狭窄。一种在局部免疫调节药物上洗脱，并可在鼠模型中小型化研究的生物相容性支架，对于临床前转化研究很有价值。以前尝试用支架与其他材料结构产生强大的异物反应恶化潜在的炎症，区分LTS^7。据我们所知，这种方法是首次在LTS的鼠模型中研究支架药物输送系统的免疫调节和抗纤维化效果。鼠模型本身为研究免疫调节药物对气管的影响提供了几个优点。可以研究转基因小鼠和健康及患病小鼠的实验组，从而产生实验性可重复性，提高成本效益。此外，将支架横向输送到小鼠气管中，模拟了这种支架在人类中的临床交付，进一步突出了这种方法的转化优势。最后，PLLA-PCL支架与药物的生产相对容易，允许修改，提供替代药物治疗，旨在减少气管的疤痕形成。

研究方案

注:此处描述的所有方法均获得约翰霍普金斯大学动物护理和使用委员会 （MO12M354） 的批准。

1. 在PLLA-PCL中制备拉帕霉素

1. 准备两个玻璃瓶（带盖）70:30 PLLA-PCL 聚合物溶液（固有粘度 1.3±1.8 DL/G;材料表）溶液，一个小瓶含有1.0%的拉帕霉素，另一个没有拉帕霉素。
   1. 在玻璃瓶中加入6毫克的拉帕霉素至600毫克70:30 PLLA-PCL，使含有1.0%的拉帕霉素含有聚合物溶液。
   2. 对于不含拉帕霉素（控制）的聚合物溶液，只需在玻璃瓶中加入600mg的70:30 PLLA-PCL。
2. 在烟罩下，在每个玻璃瓶中加入6 mL的二氯甲烷。
   注意:二氯甲烷是一种腐蚀性材料，只能使用玻璃移液器。适当的安全预防措施包括个人眼部保护和手套。
3. 在每个玻璃瓶中加入120μL的甘油（对于2%的甘油溶液）。
   注:添加甘油可提高支架结构的灵活性和刚度。
4. 回顾玻璃瓶，让 70:30 PLLA-PCL 与拉帕霉素和无雷帕霉素溶解和均质6~12小时。
   注:玻璃小瓶也可以放置在旋转摇动平台上，以加快溶解速度。

2. 拉帕霉素洗脱测试

1. 70:30 PLLA-PCL 溶液的移液器 1 mL，含有 1% 的拉帕霉素，放入玻璃培养皿中。
   注:此体积为 70:30 PLLA-PCL 溶液，含有 1% 的拉帕霉素，将包含 120 μg 的拉帕霉素，并代表每个结构中的拉帕霉素总量。可使用替代体积和浓度。
2. 让 70:30 PLLA-PCL 与 1% 的拉帕霉素硬化成玻璃培养皿中的平坦盘。
3. 硬化后，将磁盘放入 2 mL 的磷酸盐缓冲盐水（PBS，pH 7.4），并在 37°C 腔室中孵育。
4. 每 24 小时收集和更换 PBS （2 mL），并使用收集的 PBS 进行高性能液相色谱 （HPLC） 分析拉帕霉素含量。
5. 使用自动进样器和 C₁₈ 4.6 厘米 x 250 mm HPLC 柱通过自动进样器喷油器运行样品，以及雷帕霉素的连续稀释，以创建校准的标准曲线。以三元运行每个示例。
   注:要测试的拉帕霉素的连续稀释包括10%、1%、0.1%和0.01%。
6. 使用HPLC级水和醋酸酯的移动相，体积为10/90，流速为2.0 mL/min。
   注:图1显示了雷帕霉素在14天期间的洗脱。

3. 创建拉帕霉素-脱脂PLLA-PCL鼠风道支架

注:使用无菌材料和无菌技术执行步骤3.2-3.9，以避免影响体内和体外应用的污染。

1. 如第 1 节所述，制备含有拉帕霉素的 PLLA-PCL 溶液。
2. 使用带橡胶气球的玻璃巴斯德移液器，将含有1%拉帕霉素的PLLA-PCL溶液涂在22G氟化乙烯丙烯基气管（材料表）的静脉管上。一手握住血管器，并使用玻璃移液器将 PLLA-PCL 溶液滴到血管器上。缓慢旋转血管，确保使用 PLLA-PCL 溶液均匀覆盖血管。
   注:起初，PLLA-PCL溶液将很薄，但随着二氯甲烷在应用到血管导管过程中蒸发，该溶液将变得更加粘稠，以模制到血管内。在应用过程中持续转动血管导管是有益的。这一步骤必须缓慢和细致地完成，以确保支架的厚度一致。
3. 用血管的尖端朝下支撑模制的血管，在玻璃培养皿的边缘支撑，用于干燥。
4. 在室温下，让支架在真空罩中干燥 24 小时（图 2A）。
5. 通过轻轻拧动底层导管，将其从模制支架中滑出，从底层血管中去除支架结构（图 2B）。
6. 在铸造过程中检查支架是否有任何缺陷。如果铸支架存在缺陷，请丢弃它。
7. 用精细的直剪刀修剪铸支架的每一端，使边缘是轴向的。
8. 使用精细直剪刀，切割铸支架的 3 mm 轴向段，用于 LTS 的鼠标模型（图 2C）。
   注:大约8个支架可以由一个铸造的血管仪制成，每个3毫米支架含有120μg的拉帕霉素。
9. 将 3 mm 支架加载到新的 22 静脉导管上，用于 LTS 的鼠标型号（图 1）。

4. 小鼠拉林戈切斯特狭窄诱导

1. 在进行体内小鼠研究之前，获得动物护理和使用委员会的批准。
2. 通过注射氯胺酮（80~100毫克/千克）和木兰素（5~10毫克/千克）的腹内注射，麻醉9周大的雄性C57BL/6。
   注:其他菌株的小鼠可以替代，但建议小鼠重量在20-27克之间。
3. 将小鼠随机化为实验组（化学力学损伤，放置1%的含有拉帕霉素的PLLA-PCL支架）和两个对照组:1）化学机械损伤，放置PLLA-PCL支架，2）化学机械损伤，无支架的位置。
4. 将鼠标放在手术平台上，放在一个上等位置。使用贴在平台顶部的小螺纹循环，通过围绕中央切口循环来延长颈椎。
5. 使用 2 英寸胶带将鼠标的手和腿固定在桌子上。捏住鼠标爪，以确保其有足够的麻醉。
6. 手术部位随后做好了准备。应去除上覆毛皮，并清洁皮肤（用酒精或稀释的皮肤消毒剂交替碘或氯西丁磨砂）。三次。应覆盖区域并佩戴无菌手套。消毒仪器在不使用时应放在无菌表面上。
7. 使用精细的弯曲虹膜剪刀在鼠标颈部进行 1.5 厘米的中线垂直切口。分割上垂胸腺并横向化两个产生的叶，以可视化气管。在上部附着处双边划分上覆的肌体和甲状腺（带状）肌肉。
   注:在此之后，整个喉管复合物应完全暴露。
8. 通过喉部通过22G血管切开器进入气管。使用小钳子对小鼠的前喉施加压力，以帮助正确放置血管。通过气管可视化白色血管导管，以确保正确放置（非食管）。
   注:小鼠气管非常薄，白色气管将通过半透明气管进行可视化。
9. 通过插入的血管仪，通过博霉素涂层的线刷。
10. 慢慢取出血管，以便只有钢丝刷留在气管中。
11. 在气管上用细钳施加反压，用钢丝刷机械地破坏气管流明。
12. 将血管器重新插入钢丝刷的气管中。
13. 拆下钢丝刷并重新涂抹博霉素。
14. 重复步骤 4.8_4.12 共 5 倍。将霉素涂抹到每个应用程序之间的刷子上。
    注:此模型的验证和描述可在 Hillel 等人⁸中找到。
15. 从小鼠气管中取出血管导管。
    注:如果没有支架放置，切口可以使用组织胶水关闭。

5. 小鼠的跨口服PLLA-PCL支架放置

1. 将一个 3 mm 铸支架加载到空的 22 G 血管仪上（图 3A）。
   注:支架应从血管的顶端休息 5 mm。
2. 在 3 mm 铸支架上绘制一条细黑色垂直线。
   注: 此行可改进气管支架的可视化效果。
3. 将鼠标与预装支架的血管器进行外置插管。
4. 通过转颈切口将气管中的气管上的支架可视化（图3B）。
   注:气管非常薄，允许支架上的黑色染料通过气管可视化。使用此选项可确认正确的气管放置。
5. 用细钳夹住气管，通过跨颈椎切口将支架抓住到位。
6. 横向取下血管，同时用细钳保持支架的抓地力。
   注意:当去除血管导管时，不要对支架施加太大的力，不要压碎流明，这一点极为重要。然而，需要足够的力来确保支架不会用血管切除。0.8 mm 的 sialendoscope 可用于可视化支架在气管中的位置和位置。
7. 用组织胶水关闭跨颈椎切口。
8. 允许每只鼠标恢复到其原始活动级别，然后再将其放回笼子中。

6. 样品的形态学制备

1. 麻醉小鼠吸入麻醉和牺牲小鼠与宫颈错位每个动物协议后7，14或21天。
   注:根据研究的慢性，可以使用不同的时间间隔（例如，28、30 天等）。
2. 如步骤 4.4 和 4.5 所述，将鼠标放在手术平台上。
3. 使用精细的弯曲虹膜剪刀重新打开鼠标上的颈部切口。
4. 每个步骤 4.6 暴露气管。
5. 使用细弯曲的虹膜剪刀将远端气管分到支架的下方。
6. 使用细弯曲的虹膜剪刀将近端气管在喉部下方和支架上方分开。
   注:首先分割远端气管以防止气管缩回胸切。
7. 从后食道分离气管，从小鼠中取出气管。
   注:支架仍将保留在小鼠气管内。
8. 从气管中取出支架，在 10% 形式中固定 24 小时。
9. 将正式固定小鼠气管标本嵌入石蜡中，具有优越的远端定向，以便在下一步进行气管的轴向切割。
10. 使用微管切割石蜡嵌入小鼠气管的5μm部分。
    注:应从远端气管开始轴向切割试样。
11. 沿试样的长度每 250 μm 获得一个 5 μm 代表部分。
12. 在每个代表性部分完成 H&E 染色。
    1. 将每张幻灯片放入二甲苯 2x 3 分钟，对幻灯片进行脱胶处理。
    2. 将滑片放入 100% 乙醇中 2 分钟，将 95% 乙醇放置 2 分钟，将 70% 乙醇放入 2 分钟以补充水分。
    3. 用自来水清洗幻灯片2分钟。
    4. 将滑片在血氧林中染色 3⁄5 分钟。
    5. 用自来水清洗幻灯片 5 分钟。
    6. 将幻灯片放入 1% 酸酒精中 1 分钟。
    7. 用自来水清洗幻灯片1分钟。
    8. 用0.2%氨水冲洗30s。
    9. 在自来水中冲洗幻灯片 5 分钟，浸在 95% 乙醇 10 倍中。
    10. 叶辛染色，将滑轨置于欧辛芬西尼30s。
    11. 将 95% 乙醇放入 5 分钟，然后绝对乙醇 2x 5 分钟，使滑片脱水。
    12. 放入二甲苯2x5分钟
    13. 使用基于二甲苯的安装介质安装滑轨。
13. 测量层状的厚度，如希勒尔等人⁸所述。

7. 体内的支架生物相容性

1. 如步骤 6.1_6.4 中所述，准备组织部分。不要从这些气管部分取出支架，以可视化炎症相对于气管流明内支架位置的变化。
   1. 要确定急性异物对支架的反应，请使用CD3和F4/80标记观察巨噬细胞和T细胞活性。
      注:其他标记也可用于确定对支架的急性炎症反应。
   2. 在市售的亲水加幻灯片（材料表）上获取石蜡嵌入气管的5 μm切割部分。在每张幻灯片上放置两个部分。
      注:这些部分应来自放置 PLLA-PCL 支架的气管区域。
2. 将幻灯片放入二甲苯 2x 中，每次 5 分钟。
3. 将幻灯片放入 100% 乙醇 2x 中，每次 3 分钟。
4. 将幻灯片放入 95% 乙醇中 1 分钟。
5. 将幻灯片放入组织学染色架中，使其浸入抗原检索缓冲液（材料表），然后放入装有沸水的蔬菜蒸蒸机中 20 分钟。
6. 从蒸架上拆下染色架并丢弃抗原回收缓冲液。
7. 将缓冲液替换为 1 mL 的 PBS。
8. 将幻灯片放入湿染色盒中 1 分钟。
9. 丢弃 PBS，用 Dulbecco 的改性鹰介质 （DMEM） 孵育幻灯片 30 分钟。
10. 丢弃DMEM，加入不同物种中培养的两种原抗体的混合物。用石蜡薄膜覆盖幻灯片，在4°C的黑暗室中孵育过夜。
    注:在本协议中使用了兔子抗CD3和大鼠抗F4/80（材料表）。
11. 在 PBS 3 中清洗幻灯片 5 分钟。
12. 用与主要抗体物种（材料表）特有的二级抗体孵育幻灯片，在DMEM中，在室内温度下用10%FBS在0.5±1小时的黑暗下进行0.5±1小时。
13. 在黑暗中将幻灯片在 PBS 3 中洗涤 5 分钟。
14. 将滑轨安装在盖玻片上，用 4'6-二酰胺-2-phenylindole （DAPI） 安装一滴安装介质。将幻灯片存放在 20°C 或 4 °C 的黑暗中。
15. 在激光扫描共聚焦显微镜和照片上观察彩色幻灯片。
16. 量化与DAPI和感兴趣的抗体染色的细胞总数，以与未受伤的气管进行比较。

8. 小鼠气管定量基因表达分析

1. 如步骤 6.1_6.7 所述收集小鼠气管并取出支架。
   注:收获的小鼠气管可储存在-80°C冷冻室长达2年。
2. 使用精细剪刀将步骤 8.1 中收获的气管组织用于干燥，并使用带有 1.4 mm 陶瓷珠（材料表）的珠磨机均质器进一步均质化，作为市售的柱基RNA提取试剂盒（材料表）的一部分。
   注:珠磨机均质器设置 = 6 m/s 时一个 40 s 周期。
3. 根据制造商的说明，使用基于柱的提取和纯化试剂盒（材料表）从气管解糖中提取RNA。
4. 使用分光光度计（材料表）从每个样品中量化RNA。
   注:使用260/230nm比评估RNA纯度，纯RNA样本读数为2.0。
5. 使用逆转录酶（材料表）和热循环器从提取的RNA中创建补充DNA，具有以下设置:在25°C（注水）时5分钟，46°C30分钟（逆转录），然后95°C1分钟（逆转录酶失活）。
6. 用无RAse水稀释互补DNA样品，浓度为10~25纳克/mL，用于定量实时PCR。
7. 将1 μL的互补DNA（10~25纳克/mL）与10 μL的PCR主混合物（材料表）、8 μL的ddH₂O和0.5 μL的10μM正向和反向引物混合，用于96孔PCR板（材料表）的一口井中的感兴趣基因。
   注:每口井的总体积应为20μL。96孔板上的每口井应只包含一个样品和一个感兴趣的基因。
8. 对所有感兴趣的基因重复步骤8.1_8.7，并运行三重基因的每个样本。
   注:胶原蛋白1、胶原蛋白3和参考基因β-肌蛋白的基因特异性正向和反向引物（材料表）通常用于研究纤维化标记物。
9. 将 96 孔板放在实时定量 PCR 机器上，并启动以下协议:在 95°C 下变性 15 s，在 60°C 下扩展 60 s，40 个周期。
10. 将每个感兴趣的基因的基因产品检测的周期阈值 （CT） 标准化为所有样本的参考基因 β-actin 的 CT 值，以获得每个 GOI 的 μCT。然后，比较每个GOI的待处理和未经处理样本的Β值，以生成βCT。
    注: 当存在预定数量的基因产物 （μRn） 时，周期阈值是扩增曲线上的点。应为每个感兴趣的基因确定每个反应的μRn值，并应落在扩增曲线的线性部分。
    注:[CT] CT （GOI） = CT（参考基因）;[CT ] [CT] [CT]
11. 通过计算^2+CT，计算经过处理的样本和未经处理的样本之间的基因表达的相对变化，作为折叠变化的表达。

结果

本研究中使用的可生物降解PLLA-PCL支架结构中装有拉帕霉素，能够在生理条件下以一致和可预测的方式消除拉帕霉素（图1）。图 2显示了围绕 22 G 血管仪铸造的 PLLA-PCL 支架，用于 LTS 的鼠模型。为了确定气管中拉帕霉素洗脱对衰减纤维化是否有效，可以通过基因表达分析、流细胞测定、免疫荧光和ELISA来评估纤维化相关基因表达和急性炎症标记的测量变...

讨论

成功构建和使用体内药物脱脂支架最关键的步骤是:1） 确定理想药物洗脱率的最佳 PLLA-PCL 比率，2） 确定要洗脱的药物的适当浓度，3） 塑造支架在体内使用血管周围，在LTS感应后，在未造成致命气道阻塞的情况下，将支架横向输送到小鼠体内。

虽然在气道病的动物模型中使用支架进行药物输送的方法有多种，但在病害鼠模型中开发能够药物输送的生物相容支架是首次。在开...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
1. For stent
22-gauge angiocatheter	Jelco	4050
Dichloromethane	Sigma Aldrich	270997-100ML
Glycerol	Fisher Scientific	56-81-5	Available from other vendors as well.
PDLGA	Sigma Aldrich	739955-5G
PLLA-PCL (70 : 30)	Evonik Industries AG	65053
Rapamycin	LC Laboratories	R-5000
2. Animal surgery
Wire brush	Mill-Rose Company	320101
3. For immunohistochemistry staining
Antigen retrival buffer	Abcam	ab93678	Available from other vendors as well; acidic pH needed
DAPI	Cell Signaling	8961S
DMEM	ThermoFisher Scientific	11965-092	Available from other vendors as well.
FBS (Fetal Bovine Serum)	MilliporeSigma	F4135-500ML
Goat anti-rabbit-488 antibody	Lif technology	a11008
Goat anti-rat-633 antibody	Lif technology	a21094
Hydrophilic plus slide	BSB7028
PBS	ThermoFisher Scientific	100-10023	Available from other vendors as well.
Rabbit anti-CD3 antibody	Abcam	ab5690
Rat antiF4/80 antibody	Biolengend	123101
Zeiss LSM 510 Meta Confocal Microscope	Zeiss
4. For quantative PCR
0.5mm glass beads	OMNI International	19-645
Bead Mill Homoginizer	OMNI International
Gene Specific Forward/Reverse Primers	Genomic Resources Core Facility
Nanodrop 2000 spectrophotometer	Thermo Scientific
Power SYBR Green Mastermix	Life Technologies	4367659
RNeasy mini kit	Qiagen	80404
StepOnePlus Real Time PCR system	Life Technologies