في الجسم الحي نموذج الماوس من عدوى زرع العمود الفقري

Summary

يصف البروتوكول نموذجا جديدا في الجسم الحي لعدوى زرع العمود الفقري حيث تصاب غرسة الأسلاك الكورية المصنوعة من الفولاذ المقاوم للصدأ بالمكورات العنقودية الذهبية Xen36 ذات الإضاءة الحيوية. تتم مراقبة العبء البكتيري طوليا باستخدام التصوير الحيوي وتأكيده بتعداد وحدات تشكيل المستعمرات بعد القتل الرحيم.

Abstract

تنذر التهابات زرع العمود الفقري بنتائج سيئة حيث أن التشخيص يمثل تحديا والاستئصال الجراحي يتعارض مع استقرار العمود الفقري الميكانيكي. الغرض من هذه الطريقة هو وصف نموذج فأر جديد لعدوى زرع العمود الفقري (SII) تم إنشاؤه لتوفير أداة غير مكلفة وسريعة ودقيقة في الجسم الحي لاختبار العلاجات المحتملة واستراتيجيات العلاج لعدوى زرع العمود الفقري.

في هذه الطريقة ، نقدم نموذجا لجراحة العمود الفقري ذات النهج الخلفي حيث يتم نقل سلك K من الفولاذ المقاوم للصدأ إلى العملية الشائكة L4 للفئران البرية C57BL / 6J البالغة من العمر 12 أسبوعا وتلقيحها ب 1 × 10³ CFU من سلالة مضيئة بيولوجيا من بكتيريا المكورات العنقودية الذهبية Xen36. ثم يتم تصوير الفئران طوليا للتلألؤ البيولوجي في الجسم الحي في أيام ما بعد الجراحة 0 و 1 و 3 و 5 و 7 و 10 و 14 و 18 و 21 و 25 و 28 و 35. يتم قياس إشارات تصوير التلألؤ الحيوي (BLI) من مجال رؤية موحد لقياس العبء البكتيري في الجسم الحي.

لتحديد كمية البكتيريا الملتصقة بالغرسات والأنسجة المحيطة بالزرع ، يتم القتل الرحيم للفئران ويتم حصاد الغرسة والأنسجة الرخوة المحيطة. يتم فصل البكتيريا عن الزرع عن طريق صوتنة ، وزرعت بين عشية وضحاها ومن ثم يتم حساب وحدات تشكيل مستعمرة (CFUs). تشمل النتائج التي تم الحصول عليها من هذه الطريقة العد البكتيري الطولي كما تم قياسه بواسطة التلألؤ الحيوي في الجسم الحي S. aureus (متوسط التدفق الأقصى) وعدد CFU بعد القتل الرحيم.

في حين أن النماذج الحيوانية السابقة لعدوى العمود الفقري الآلية قد تضمنت تحليلا غازيا للأنسجة خارج الجسم الحي ، فإن نموذج الفئران ل SII المقدم في هذه الورقة يستفيد من التصوير البصري غير الجراحي في الوقت الفعلي في الجسم الحي للبكتيريا المضيئة بيولوجيا ليحل محل دراسة الأنسجة الثابتة. تطبيقات النموذج واسعة النطاق وقد تشمل استخدام سلالات بكتيرية بديلة ذات إضاءة حيوية ، ودمج أنواع أخرى من الفئران المعدلة وراثيا لدراسة الاستجابة المناعية للمضيف بشكل متزامن ، وتقييم الطرائق التشخيصية والعلاجية الحالية أو التحقيق في الطرائق التشخيصية والعلاجية الجديدة مثل المضادات الحيوية أو الطلاء المزروع.

Introduction

الغرض من هذه الطريقة هو وصف نموذج فأر جديد لعدوى زرع العمود الفقري (SII). تم تصميم هذا النموذج لتوفير أداة غير مكلفة ودقيقة لتقييم تأثير متغيرات المضيف و / أو الممرض و / أو الزرع في الجسم الحي بمرونة. يهدف اختبار العلاجات المحتملة واستراتيجيات العلاج لعدوى زرع العمود الفقري في هذا النموذج إلى توجيه تطوير البحث قبل التطبيق في النماذج الحيوانية الأكبر والتجارب السريرية.

تعد العدوى المرتبطة بالزرع بعد جراحة العمود الفقري من المضاعفات المدمرة وتحدث للأسف في حوالي 3-8٪ من المرضى الذين يخضعون لجراحة العمود الفقري الاختيارية¹،²،³،^4،5 وما يصل إلى 65٪ من المرضى الذين يخضعون لجراحة متعددة المستويات أو مراجعة⁶. غالبا ما يتطلب علاج التهابات زرع العمود الفقري دخول المستشفى عدة مرات ، وعمليات جراحية متعددة ، وعلاج بالمضادات الحيوية لفترات طويلة. تنذر SIIs بنتائج سيئة للمرضى بما في ذلك التسوية العصبية والإعاقة وزيادة خطر الوفاة. إدارة SII مكلفة للغاية ، حيث تكلف ما يزيد عن 900,000 دولار لكل مريض⁷.

المكورات العنقودية الذهبية هي أكثر مسببات الأمراض الخبيثة شيوعا في SII⁸،^9،10،11. يمكن للبكتيريا أن تزرع الأعضاء مباشرة أثناء الجراحة ، أو من خلال الجرح خلال فترة ما بعد الجراحة ، أو لاحقا عن طريق انتشار الدم. في وجود غرسات معدنية ، تشكل المكورات العنقودية الذهبية غشاء حيويا يحمي البكتيريا من العلاج بالمضادات الحيوية والخلايا المناعية. في حين أن إزالة الأجهزة المصابة قد تساعد في القضاء على العدوى بشكل فعال ، إلا أن هذا غالبا ما يكون غير ممكن في العمود الفقري دون التسبب في زعزعة الاستقرار والمخاطرة بالتسوية العصبية¹².

في غياب زرع الأجهزة المصابة ، هناك حاجة إلى أساليب جديدة لمنع SII واكتشافه وعلاجه. تاريخيا ، كانت هناك نماذج حيوانية محدودة من SII لتقييم سلامة وفعالية العلاجات الجديدة بكفاءة. تتطلب النماذج الحيوانية السابقة ل SII أعدادا كبيرة من الحيوانات وجمع نقاط البيانات التي تتطلب القتل الرحيم بما في ذلك عد المستعمرات والأنسجة والثقافة¹³،^14،15. تفتقر هذه النماذج إلى المراقبة الطولية في الجسم الحي ، وتوفر نقطة بيانات واحدة فقط لكل ، وبالتالي فهي باهظة الثمن وغير فعالة.

أثبت العمل السابق الذي يدرس نموذج فأر لعدوى رأب مفاصل الركبة قيمة ودقة التصوير البصري غير الباضع في الجسم الحي لمراقبة عبء العدوى طوليا¹⁶. يسمح الكشف عن التلألؤ الحيوي بقياس العبء البكتيري على مدار زمني طولي في واحد بشكل إنساني ودقيق وفعال. علاوة على ذلك ، أظهرت الدراسات السابقة وجود علاقة عالية بين التلألؤ الحيوي في الجسم الحي ووحدات CFU الملتصقة بالغرسات¹⁷. أدت القدرة على تتبع العدوى بمرور الوقت إلى فهم أكثر دقة للعدوى المرتبطة بالزرع. بالإضافة إلى ذلك ، فإن مراقبة العدوى الطولية بهذه الطريقة ، سمحت بتقييم فعالية العلاج بالمضادات الحيوية ومضادات الميكروبات الجديدة بدقة¹⁶،^17،18.

بالاستفادة من هذه الأدوات ، قمنا بتطوير نموذج لعدوى زرع العمود الفقري بعد العملية الجراحية والتحقق من صحته. في الطريقة المقدمة ، نستخدم لقاحا من S. aureus Xen36 المضيئة بيولوجيا لإنشاء نموذج فأر في الجسم الحي من SII لمراقبة الحمل البكتيري طوليا¹⁶،^17،18. يوفر هذا النموذج الجديد أداة قيمة لاختبار استراتيجيات الكشف والوقاية والعلاج المحتملة بكفاءة ل SII قبل تطبيقها في النماذج الحيوانية الأكبر والتجارب السريرية.

Protocol

تم التعامل مع جميع الحيوانات بما يتفق بدقة مع الممارسات الحيوانية الجيدة على النحو المحدد في اللوائح الفيدرالية على النحو المنصوص عليه في قانون رعاية الحيوان (AWA) ، ودليل عام 1996 لرعاية واستخدام المختبر ، وسياسة PHS للرعاية الإنسانية واستخدام المختبر ، وكذلك سياسات وإجراءات المؤسسة على النحو المنصوص عليه في دليل التدريب على رعاية الحيوان واستخدامه ، وتمت الموافقة على جميع الأعمال الحيوانية من قبل لجنة أبحاث الحيوان بجامعة كاليفورنيا في لوس أنجلوس (ARC).

1. اختيار سلالة S. aureus bioluminescent

1. استخدم سلالة S. aureus Xen36 ذات الإضاءة الحيوية كلقاح مهم.
   ملاحظة: تم اشتقاق هذه السلالة من السلالة الأبوية S. aureus ATCC-49525 ، وهي عزلة سريرية من مريض إنتاني. المكورات العنقودية الذهبية يستخدم Xen36 بشكل فريد أوبرون ABCDE lux، والذي تم تحسينه ودمجه في البلازميد الأصلي للمضيف. ¹⁹ نتيجة لذلك ، فإن سلالة Xen36 قادرة على إنتاج ضوء إضاءة بيولوجي أزرق أخضر مع انبعاث ذروة الطول الموجي 490 نانومتر. يتم إنتاج إشارة الانبعاث هذه فقط بواسطة الكائنات البكتيرية الحية النشطة في التمثيل الغذائي.

2. إعداد S. أوريوس للتلقيح

1. أضف 200 ميكروغرام / مل كاناميسين إلى مرق لوريا بالإضافة إلى 1.5٪ أجار لعزل S. aureus Xen36 عن الملوثات المحتملة ، باستخدام جين مقاومة الكانامايسين المرتبط بلوكس أوبرون¹⁹.
2. قم بتجميع بكتيريا S. aureus Xen36 على ألواح أجار الصويا التربتيك (مرق الصويا التربتي [TSB] بالإضافة إلى 1.5٪ أجار) واحتضانها عند 37 درجة مئوية لمدة 12-16 ساعة.
3. عزل المستعمرات المفردة للمكورات العنقودية الذهبية Xen36 والاستزراع الفردي في مكتب تقييس الاتصالات لمدة 12-16 ساعة عند 37 درجة مئوية في حاضنة اهتزازية (200 دورة في الدقيقة).
4. تمييع الثقافة الناتجة بنسبة 1:50.
5. استزراع لمدة 2 ساعة إضافية عند 37 درجة مئوية لعزل بكتيريا الطور اللوغاريتمي المتوسط.
6. حبيبات ، إنعاش ، وغسل البكتيريا في محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS) ثلاث مرات.
7. قياس الامتصاص عند 600 نانومتر. يتراوح OD600 المثالي بين 0.700 و 0.750 وهو ما يتوافق مع 4x10⁵ CFU / mL. إجراء التخفيفات التسلسلية لتحقيق اللقاح البكتيري المطلوب (1 × 10³ CFU / 2 ميكرولتر).
   ملاحظة: تم العثور على التركيز الأمثل ل Xen36 لإنشاء عدوى مزمنة ليكون 1 × 10³ CFU. تم إزالة جرعات أقل من البكتيريا من قبل الجهاز المناعي المضيف وتسببت الجرعات العالية في انهيار الجرح. لا يفرق انهيار الجرح بين عدوى الزرع العميق وعدوى الجرح السطحي ، وبالتالي يتم تجنبه في هذا النموذج (الشكل 1)²⁰.

3. الفئران

1. استخدم ذكور الفئران من النوع البري C57BL / 6J البالغة من العمر 12 أسبوعا.
2. الفئران المنزلية في أقفاص بحد أقصى 4 في وقت واحد.
3. حافظ على توفر المياه في جميع الأوقات. حافظ على دورة الضوء / الظلام لمدة 12 ساعة ولا تقم بإجراء التجارب خلال المرحلة المظلمة من الدورة.
4. استخدم الطعام الخالي من البرسيم للتغذية بسبب التداخل المحتمل مع إشارات الفلورسنت.
5. اطلب من موظفي البحث أو الطب البيطري تقييم الفئران يوميا لضمان رفاهية الحيوانات طوال فترة التجربة.

4. العمليات الجراحية للفأر

1. حث التخدير عن طريق وضع الفئران في غرفة إيزوفلوران (2٪) لمدة 5 دقائق تقريبا. تأكد من عمق التخدير المناسب من خلال مراقبة التنفس ليظل إيقاعيا وأبطأ مما كان عليه عند الاستيقاظ ولا يتغير استجابة للمنبهات الضارة (على سبيل المثال ، التلاعب الجراحي ، قرصة إصبع القدم).
2. نقل الفئران المخدرة إلى محطة التحضير وإزالة الشعر من العجز إلى العمود الفقري الصدري العلوي مع كليبرز القوارض.
3. تنظيف وتعقيم الجلد مع يغسل ثلاثة من محلول بيتادين بالتناوب وكحول الأيزوبروبيل.
4. نقل الفئران المخدرة والمعقمة في وضعية الانبطاح إلى سرير جراحي معقم مع الحفاظ على التخدير مع إعطاء الأيزوفلوران المستنشق (2٪) عبر مخروط الأنف.
5. قم بثني الوركين إلى أقصى حد وحدد موضع الركبة على مستوى العمود الفقري لتقريب الجسم الفقري القطني 4.
6. قم بعمل شق طولي 2 سم عبر الجلد باستخدام مشرط جراحي مكون من 15 شفرة.
7. جس العمليات الشائكة لتأكيد خط الوسط واستمر في الشق وصولا إلى العظام.
8. تشريح تحت السمحاق على الجانب الأيمن من عملية L4 الشائكة ، وتمتد أفقيا إلى العملية المستعرضة.
9. مرر خياطة مضفرة قابلة للامتصاص بحجم 5-0 سيفالاد وذيول إلى جسم L4 من خلال اللفافة واتركها مفتوحة ، استعدادا للإغلاق في المستقبل.
10. باستخدام إبرة شوكية 25 G ، أعد العملية الشائكة ل L4 باستخدام إبرة شوكية 25 G وأدخل غرسة من الفولاذ المقاوم للصدأ بقطر 0.1 مم وطول 1 سم "على شكل حرف L" على طول الصفيحة مع وضع الذراع الطويل الرأس.
11. قم بتلقيح الغرسة ب 1 × 10³ CFUs / 2 ميكرولتر من التوهج الحيوي S. aureus Xen36 ، مع الحرص على التأكد من ملامسة جميع المحلول للزرع.
12. انتظر حوالي 10 ثوان قبل ربط الخيط القابل للامتصاص الذي تم تمريره مسبقا بعد التلقيح لضمان احتواء اللقاح على الغرسة.
13. أغلق الجلد بطريقة الجري مع خياطة قابلة للامتصاص.
14. تطبيق دواء الألم عن طريق حقن البوبرينورفين تحت الجلد (0.1 ملغ/كغ) فورا ثم كل 12 ساعة لمدة 3 أيام بعد ذلك.
15. استعادة الفئران على وسادة التدفئة ومراقبة للعودة إلى النشاط الطبيعي.
16. الحصول على الصور الشعاعية بعد العملية الجراحية لتأكيد الموضع المناسب للزرع.

5. التصوير الطولي في الجسم الحي لقياس العبء البكتيري

1. تخدير الفئران مع استنشاق الأيزوفلوران (2 ٪). تأكد من عمق التخدير المناسب من خلال مراقبة التنفس ليظل إيقاعيا وأبطأ مما كان عليه عند الاستيقاظ ولا يتغير استجابة للمنبهات الضارة (على سبيل المثال ، التلاعب الجراحي ، قرصة إصبع القدم).
2. إزالة الشعر من العجز إلى العمود الفقري الصدري العلوي مع كليبرز القوارض.
3. قم بتحميل الفئران على مجال رؤية منصة التصوير الحيوي لإجراء تصوير التلألؤ الحيوي في الجسم الحي (BLI) ¹⁹.
4. التقط إشارة التوهج الحيوي على مدى 5 دقائق من وقت الاستحواذ. استخدم إعدادات التجميع الكبيرة مع مجال رؤية 15 سم (B).
5. كرر الخطوات 5.1-5.4 في أيام ما بعد الجراحة 0 و 1 و 3 و 5 و 7 و 10 و 14 و 18 و 21 و 25 و 28 و 35 (أو أيام أخرى بناء على تصميم تجريبي محدد) لمراقبة العبء البكتيري.
6. اعرض بيانات BLI عبر مقياس الألوان والتراكب على صورة فوتوغرافية بتدرج الرمادي. عزل منطقة بيضاوية قياسية ذات أهمية (ROI) باستخدام برنامج BLI لتحديد BLI في التدفق الكلي (الفوتونات في الثانية) أو متوسط التدفق الأقصى (الفوتونات / الثانية / السنتيمتر² / الاستراديان).

6. تحديد كمية البكتيريا الملتصقة بالغرسات والأنسجة المحيطة بها

1. القتل الرحيم للفئران على POD 35 أو تاريخ بديل بعد الجراحة مع التعرض لثاني أكسيد الكربون وفقا لإرشادات AVMA. تأكيد القتل الرحيم مع خلع عنق الرحم الثانوي.
2. تعقيم الجلد الظهري وفقا للخطوة 4.3 ووضع الماوس عرضة في مجال جراحي معقم.
3. شق الشق السابق بحدة باستخدام مشرط جراحي مكون من 15 شفرة.
4. استخدم مقصا معقما لتشريح العملية الشائكة L4 بصراحة وتحديد الغرسة الجراحية.
5. استخدم محرك إبرة للف الغرسة وإزالتها برفق من موضعها في عملية L4 الشائكة.
6. باستخدام ملقط ومقص معقم ، احصد ما يقرب من 0.1 جرام من عظم العملية الشوكية والأنسجة الرخوة المحيطة مباشرة بالزرع الجراحي وضعه في 1 مل من PBS في أنبوب وحيد القرن المخروطي الصغير مع 4 حبات متجانسة حادة.
7. سجل وزن الأنسجة الرخوة عن طريق وزن الأنبوب المخروطي قبل وبعد الحصاد.
8. ضع الغرسة في 0.5 مل من 0.3٪ Tween-80 في TSB وصوتنيكات لمدة 15 دقيقة.
9. دوامة تعليق الزرع الناتج لمدة 2 دقيقة والثقافة بين عشية وضحاها لمدة 12-16 ساعة.
10. تجانس الأنسجة الرخوة والعمليات الشائكة التي سبق وضعها في 1 مل PBS المحيطة بالزرع باستخدام الخالط.
11. دوامة تعليق الأنسجة الرخوة الناتجة لمدة 5 دقائق والثقافة بين عشية وضحاها لمدة 12-16 ساعة.
12. بعد الثقافة بين عشية وضحاها ، عد CFU من الزرع والأنسجة المحيطة ، على التوالي. قيمة صريحة كإجمالي CFU / g التي تم حصادها للأنسجة الرخوة و CFU / mL للزرع الصوتي.

النتائج

تم استخدام الإجراء المقدم هنا لتقييم فعالية أنظمة المضادات الحيوية في نموذج فأر في الجسم الحي من SII. على وجه التحديد ، تمت مقارنة فعالية الجمع بين العلاج بالمضادات الحيوية للفانكومايسين والريفامبين مع العلاج الأحادي للفانكومايسين والضوابط المصابة غير المعالجة.

قبل الجراح...

Discussion

تنذر الالتهابات المرتبطة بالزرع في العمود الفقري بنتائج سيئة للمرضى¹،²،³،^4،5. على عكس العديد من المناطق الأخرى في الجسم ، لا يمكن إزالة الأجهزة المصابة في العمود الفقري بشكل متكرر بسبب خطر عدم الاستقر...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Analytical Balance ME104	Mettler Toledo	30029067	120 g capacity, 0.1 mg readability, backlit LCD, internal adjustment, metal base
BD Bacto Tryptic Soy Broth	Becton Dickinson (BD)	BD 211825	BD Bacto Tryptic Soy Broth (Soybean-Casein Digest Medium)
Biomate 3S UV-VIS Spectrophotometer	Thermo Scientific	840-208300	Spectrophotometer; Thermo Scientific; BioMate 3S; Six-position cell holder; Spectral bandwidth: 1.8nm; Long-life xenon lamp; Store up to 40 test methods; 16L x 13W x 9 in. H; 19 lb.; 100/240V US line cord
Bioshield 720+ swinging bucket rotor	Thermo Scientific	75003183	Rotor, Swinging bucket; Thermo Scientific; BIOShield 720 high speed; Capacity: 4 x 180mL (0.72L); Angle: 90 deg. ; Max. speed/RCF: 6300rpm/7188 x g; Max. radius: 16.2cm
Branson Ultrasonics 2510R-MTH (Sonicator)	Branson Ultrasonics	CPX952217R	*similar model, our model is discontinued* Branson Ultrasonics MH Series Heated Ultrasonic Cleaning Bath, 120V, 0.75 gal
Bullet Blender Storm Homogenizer	Next Advance	BBY24M	The Bullet Blender Storm is the most powerful member of the Bullet Blender family. Homogenize up to 24 of your toughest samples (mouse femur, skin, cartilage, tumor, etc.) in just minutes. Air cooling™ minimizes sample heat up. Uses 1.5ml screw-cap RINO® tubes or snap-cap Eppendorf® Safe-lock™ tubes.
Germinator 500	Electron Microscopy Sciences	66118-10	The Germinator 500 is designed to decontaminate metal micro-dissecting instruments only. It is to be used exclusively for research purposes. The Germinator 500 should not be used as a substitute for traditional methods of terminal sterilization. Effective sterilization cannot be assured due to lack of routine sterilization-efficacy monitoring methods for glass bead sterilization. The Germinator 500 has been designed and built to pass the Validation of Dry Sterilizer Spore Suspension Test: USP XXIII, Part 1211.
Heracell 150i CO2 Incubator	Thermo Scientific	51026282	Single 150L
IVIS Lumina X5 Imaging System	Perkin Elmer	CLS148590	The IVIS Lumina X5 high-throughput 2D optical imaging system combines high-sensitivity bioluminescence and fluorescence with high-resolution x-ray into a compact system that fits on your benchtop. With an expanded 5 mouse field of view for 2D optical imaging plus our unique line of accessories to accelerate setup and labeling, it has never been easier or faster to get robust data—and answers—on anatomical and molecular aspects of disease.
MAXQ 4450 Digtial Incubating Bench Shaker	Thermo Scientific	SHKE4450	Shaker, Incubated; Thermo Scientific; Digital; MaxQ 4450; Speed 15 to 500rpm +/-1rpm; 5 deg. C above ambient to 80 deg. C; 120V 50/60Hz
PBS, Phosphate Buffered Saline	Fisher Bioreagents	BP24384	PBS, Phosphate Buffered Saline, 1X Solution, pH 7.4
Sorvall Legend Micro 21 Centrifuge, Ventilated	Thermo Scientific	75002436	24 x 1.5/2.0mL rotor with ClickSeal biocontainment lid
SORVALL LEGEND X1R 120V Centrifuge	Thermo Scientific	75004261	Centrifuge, Benchtop; Thermo Scientific; Sorvall Legend X1R (Refrigerated), 1L capacity; Max. Speed/RCF 15,200rpm/25,830 x g; CFC-free cooling -10C to +40C; 120V 60Hz
Staphylococcus aureus - Xen36	Perkin Elmer	119243	Staphylococcus aureus - Xen36 bioluminescent pathogenic bacteria for in vivo and in vitro drug discovery. This product was derived from a parental strain from the American Type Culture Collection, used under license. Staph. aureus-Xen36 possesses a stable copy of the Photorhabdus luminescens lux operon on the native plasmid.
TUTTNAUER AUTOCLAVE 2540E 120V	Heidolph Tuttnauer	23210401	Sterilizer, Benchtop; Heidolph; Tuttnauer; Model 2540E; Self-contained design with refillable reservoir controls water purity for sterilization; 120V 50/60Hz; 1400w. With electronic controls
Tween 80	Fisher Bioreagents	BP338-500	Tween 80, Fisher BioReagents, Non-ionic detergent for selective protein extraction
Vortex mixer VX-200	Labnet Internation	S0200	120V touch or continuous mixer, 230V: 0 - 2,850 rpm,120V: 0 - 3,400 rpm
0.9% Sodium Chloride	Pfizer Injectables/Hospira	00409-4888-10	0.9% Sodium Chloride Injection, USP