Spinal İmplant Enfeksiyonunun İn Vivo Fare Modeli

Özet

Protokol, paslanmaz çelik bir k-tel implantının biyolüminesan Staphylococcus aureus Xen36 ile enfekte olduğu yeni bir in vivo spinal implant enfeksiyonu fare modelini açıklar. Bakteri yükü biyolüminesan görüntüleme ile uzunlamasına izlenir ve ötenazi sonrası koloni oluşturan birim sayıları ile doğrulanır.

Özet

Omurga implantı enfeksiyonları, tanının zor olması ve cerrahi eradikasyonun mekanik spinal stabilite ile çelişmesi nedeniyle kötü sonuçlara işaret eder. Bu yöntemin amacı, spinal implant enfeksiyonları için potansiyel terapötikleri ve tedavi stratejilerini test etmek için ucuz, hızlı ve doğru bir in vivo araç sağlamak üzere oluşturulmuş yeni bir spinal implant enfeksiyonu (SII) fare modelini tanımlamaktır.

Bu yöntemde, paslanmaz çelik bir k-telinin 12 haftalık C57BL/6J vahşi tip farelerin L4 spinöz sürecine transfikse edildiği ve 1 x 10³ CFU biyolüminesan bir Staphylococcus aureus Xen36 bakteri suşu ile aşılandığı bir posterior yaklaşım omurga cerrahisi modeli sunuyoruz. Fareler daha sonra ameliyat sonrası 0, 1, 3, 5, 7, 10, 14, 18, 21, 25, 28 ve 35. günlerde in vivo biyolüminesans için uzunlamasına görüntülenir. Standartlaştırılmış bir görüş alanından alınan biyolüminesans görüntüleme (BLI) sinyalleri, in vivo bakteri yükünü ölçmek için ölçülür.

İmplantlara ve implant çevresi dokuya yapışan bakterileri ölçmek için farelere ötenazi yapılır ve implant ve çevresindeki yumuşak doku hasat edilir. Bakteriler sonikasyon ile implanttan ayrılır, gece boyunca kültürlenir ve daha sonra koloni oluşturan birimler (CFU'lar) sayılır. Bu yöntemden elde edilen sonuçlar, in vivo S. aureus biyolüminesans (ortalama maksimum akı) ve ötenazi sonrası CFU sayıları ile ölçülen uzunlamasına bakteri sayımlarını içerir.

Aletli omurga enfeksiyonunun önceki hayvan modelleri invaziv, ex vivo doku analizini içerirken, bu yazıda sunulan SII'nin fare modeli, statik doku çalışmasının yerini almak için biyolüminesan bakterilerin invaziv olmayan, gerçek zamanlı in vivo optik görüntülemesinden yararlanır. Modelin uygulamaları geniştir ve alternatif biyolüminesan bakteri suşlarının kullanılmasını, konakçı bağışıklık tepkisini eşzamanlı olarak incelemek için diğer genetik olarak tasarlanmış fare türlerini dahil etmeyi ve antibiyotikler veya implant kaplamaları gibi mevcut veya yeni tanı ve tedavi yöntemlerini değerlendirmeyi içerebilir.

Giriş

Bu yöntemin amacı, spinal implant enfeksiyonunun (SII) yeni bir fare modelini tanımlamaktır. Bu model, konakçı, patojen ve/veya implant değişkenlerinin etkisini in vivo olarak esnek bir şekilde değerlendirmek için ucuz ve doğru bir araç sağlamak üzere tasarlanmıştır. Bu modelde spinal implant enfeksiyonları için potansiyel terapötiklerin ve tedavi stratejilerinin test edilmesi, daha büyük hayvan modellerinde ve klinik çalışmalarda uygulamadan önce araştırma geliştirmeye rehberlik etmeyi amaçlamaktadır.

Omurga cerrahisi sonrası implanta bağlı enfeksiyon yıkıcı bir komplikasyondur ve ne yazık ki elektif omurga cerrahisi geçiren hastaların yaklaşık %3-8'inde ^görülür 1,2,3,4,5 ve çok seviyeli veya revizyon cerrahisi geçiren hastaların %65'ine kadarı 6. Spinal implant enfeksiyonlarının tedavisi genellikle birden fazla hastaneye yatış, birden fazla ameliyat ve uzun süreli antibiyotik tedavisi gerektirir. SII'ler, nörolojik uzlaşma, sakatlık ve artmış mortalite riski dahil olmak üzere kötü hasta sonuçlarına işaret eder. SII'nin yönetimi son derece pahalıdır ve hasta başına 900.000 dolardan fazlaya mal olur⁷.

Staphylococcus aureus, SII 8,9,10,11'in en yaygın virülan patojenidir. Bakteriler donanımı doğrudan ameliyat sırasında, ameliyat sonrası dönemde yaradan veya daha sonra hematojen yayılma yoluyla tohumlayabilir. Metal implantların varlığında, S. aureus, bakterileri antibiyotik tedavisinden ve bağışıklık hücrelerinden koruyan biyofilm oluşturur. Enfekte olmuş donanımın çıkarılması bir enfeksiyonun etkili bir şekilde ortadan kaldırılmasına yardımcı olabilirken, bu genellikle omurgada istikrarsızlığa neden olmadan ve nörolojik uzlaşma riski taşımadan^{mümkün değildir 12}.

Enfekte olmuş donanımın ekstrüktüre edilmemesi durumunda, SII'yi önlemek, tespit etmek ve tedavi etmek için yeni yaklaşımlara ihtiyaç vardır. Tarihsel olarak, yeni tedavilerin güvenliğini ve etkinliğini etkin bir şekilde değerlendirmek için SII'nin sınırlı hayvan modelleri olmuştur. SII'nin önceki hayvan modelleri, çok sayıda hayvan ve koloni sayımı, histoloji ve kültür dahil olmak üzere ötenazi gerektiren veri noktalarının toplanmasını gerektirir^13,14,15. Uzunlamasına in vivo izlemeden yoksun olan bu modeller, hayvan başına yalnızca bir veri noktası sağlar ve bu nedenle pahalı ve verimsizdir.

Diz artroplastisi enfeksiyonunun bir fare modelini inceleyen önceki çalışma, enfeksiyon yükünü uzunlamasına izlemek için noninvaziv in vivo optik görüntülemenin değerini ve doğruluğunu ortaya koymuştur¹⁶. Biyolüminesansın tespiti, bakteri yükünün tek bir hayvanda uzunlamasına bir zaman boyunca insanca, doğru ve verimli bir şekilde ölçülmesini sağlar. Ayrıca, önceki çalışmalar, in vivo biyolüminesans ile implantlara bağlı CFU'lar arasında yüksek bir korelasyon olduğunu göstermiştir¹⁷. Zaman içinde enfeksiyonu takip etme kapasitesi, implantla ilişkili enfeksiyonun daha incelikli bir şekilde anlaşılmasına yol açmıştır. Ek olarak, boylamsal enfeksiyonun bu şekilde izlenmesi, antibiyotik tedavisinin ve yeni antimikrobiyallerin etkinliğinin doğru bir şekilde değerlendirilmesine olanak sağlamıştır^16,17,18.

Bu araçlardan yararlanarak, postoperatif spinal implant enfeksiyonu modelini geliştirdik ve doğruladık. Sunulan yöntemde, bakteri yükünü uzunlamasına izlemek için SII'nin in vivo fare modelini oluşturmak için bir biyolüminesan S. aureus Xen36 aşısı kullanıyoruz^16,17,18. Bu yeni model, daha büyük hayvan modellerinde ve klinik çalışmalarda uygulanmadan önce SII için potansiyel tespit, önleme ve tedavi stratejilerini verimli bir şekilde test etmek için değerli bir araç sağlar.

Protokol

Tüm hayvanlar, Hayvan Refahı Yasası (AWA), 1996 Laboratuvar Hayvanlarının Bakımı ve Kullanımı Kılavuzu, Laboratuvar Hayvanlarının İnsani Bakımı ve Kullanımı için PHS Politikası ve ayrıca Hayvan Bakımı ve Kullanımı Eğitim Kılavuzunda belirtilen kurumun politika ve prosedürlerinde belirtilen federal düzenlemelerde tanımlanan iyi hayvan uygulamalarına sıkı sıkıya bağlı olarak ele alınmıştır. ve tüm hayvan çalışmaları, California Üniversitesi Los Angeles Şansölyesi'nin Hayvan Araştırma Komitesi (ARC) tarafından onaylandı.

1. S. aureus biyolüminesan gerinim seçimi

1. İlgilenilen aşı olarak biyolüminesan S. aureus suşu Xen36'yı kullanın.
   NOT: Bu suş, septik bir hastadan alınan klinik bir izolat olan ebeveyn suşu S. aureus ATCC-49525'ten türetilmiştir. S. aureus ( S. aureus) Xen36, optimize edilmiş ve ana bilgisayarın doğal plazmidine entegre edilmiş bir luxABCDE operonunu benzersiz bir şekilde kullanır. ¹⁹ Sonuç olarak, Xen36 suşu, 490 nm'lik bir tepe dalga boyu emisyonuna sahip mavi-yeşil bir biyolüminesan ışık üretebilir. Bu emisyon sinyali sadece metabolik olarak aktif olan canlı bakteriyel organizmalar tarafından üretilir.

2. S'nin Hazırlanması. Aşılama için Aureus

1. S. aureus Xen36'yı potansiyel kirleticilerden izole etmek için Luria Broth'a 200 μg/mL kanamisin artı %1.5 agar ekleyin, lux operon^19'a bağlı kanamisin direnç genini kullanın.
2. S. aureus Xen36 bakterilerini triptik soya agar plakalarına (triptik soya suyu [TSB] artı %1.5 agar) yerleştirin ve 37 °C'de 12-16 saat inkübe edin.
3. S. aureus Xen36'nın tek kolonilerini izole edin ve TSB'de 12-16 saat boyunca 37 ° C'de çalkalayan bir inkübatörde (200 rpm) ayrı ayrı kültürleyin.
4. Elde edilen kültürü 1:50 oranında seyreltin.
5. Midlogaritmik faz bakterilerini izole etmek için 37 ° C'de 2 saat daha kültür.
6. Bakterileri fosfat tamponlu salin (PBS) içinde üç kez peletleyin, yeniden süspanse edin ve yıkayın.
7. Absorbansı 600 nm'de ölçün. İdeal OD600, 0.700 ile 0.750 arasındadır ve bu da 4x10⁵ CFU/mL'ye karşılık gelir. İstenilen bakteriyel aşılamayı (1 x 10³ CFU / 2 μL) elde etmek için seri seyreltmeler gerçekleştirin.
   NOT: Kronik bir enfeksiyonun kurulması için optimal Xen36 konsantrasyonunun 1 x 10³ CFU olduğu bulunmuştur. Daha düşük bakteri dozu, konakçı bağışıklık sistemi tarafından temizlendi ve daha yüksek dozlama, yara parçalanmasına neden oldu. Yara parçalanması, derin implant enfeksiyonu ile yüzeysel yara enfeksiyonu arasında ayrım yapmaz ve bu nedenle bu modelde önlenir (Şekil 1)²⁰.

3. Fareler

1. 12 haftalık erkek C57BL / 6J vahşi tip fareler kullanın.
2. Bir seferde en fazla 4 tane olan kafeslerdeki ev fareleri.
3. Suyu her zaman hazır bulundurun. 12 saatlik bir aydınlık/karanlık döngüsü sürdürün ve döngünün karanlık evresinde deney yapmayın.
4. Floresan sinyalizasyonu ile potansiyel parazit nedeniyle besleme için yonca içermeyen yem kullanın.
5. Deneyin tamamı boyunca hayvanların refahını sağlamak için araştırma veya veteriner personelinin fareleri günlük olarak değerlendirmesini sağlayın.

4. Fare cerrahi prosedürleri

1. Fareleri yaklaşık 5 dakika boyunca bir izofluran (% 2) odasına yerleştirerek anesteziyi indükleyin. Solunumun uyanık olduğundan daha ritmik ve daha yavaş kalmasını ve zararlı uyaranlara yanıt olarak değişmemesini izleyerek uygun anestezi derinliğini onaylayın (ör., cerrahi manipülasyon, ayak parmağı sıkışması).
2. Anestezi uygulanmış fareleri bir hazırlık istasyonuna aktarın ve kemirgen makası ile sakrumdan üst torasik omurgaya kadar tüyleri alın.
3. Cildi alternatif betadin çözeltisi ve izopropil alkolün üçlü yıkamasıyla temizleyin ve sterilize edin.
4. Yüzüstü pozisyonda anestezi uygulanmış ve sterilize edilmiş fareleri steril bir cerrahi yatağa aktarın, burun konisi yoluyla inhale izofluran (% 2) uygulanarak anesteziyi koruyun.
5. Kalçaları maksimum düzeyde esnetin ve lomber 4 vertebral gövdeye yaklaşmak için dizin omurga seviyesindeki konumunu belirleyin.
6. 15 bıçaklı cerrahi neşter ile deriden uzunlamasına 2 cm'lik bir kesi yapın.
7. Orta hattı doğrulamak için dikenli süreçleri palpe edin ve insizyonu kemiğe kadar devam ettirin.
8. L4 spinöz işleminin sağ tarafında subperiostal olarak diseksiyon yapın ve enine sürece lateral olarak uzanın.
9. 5-0 sefalad ve kaudad boyutunda, emilebilir örgülü bir sütürü fasyadan L4 gövdesine geçirin ve gelecekteki kapanmaya hazırlık olarak açık bırakın.
10. 25 G'lik bir spinal iğne kullanarak, 25 G'lik bir spinal iğne kullanarak L4'ün dikenli işlemini raybalayın ve uzun kol döşeme sefaladı ile lamina boyunca 0,1 mm çapında, 1 cm uzunluğunda "L-şekilli" cerrahi sınıf paslanmaz çelik bir implant yerleştirin.
11. İmplantı 1 x 10³ CFU/2 μL biyolüminesan S. aureus Xen36 ile aşılayın ve tüm solüsyonun implanta temas etmesine dikkat edin.
12. İmplant üzerinde aşı tutulmasını sağlamak için aşılamadan sonra daha önce geçirilen emilebilir sütürü bağlamadan önce yaklaşık 10 saniye bekleyin.
13. Emilebilir sütür ile cildi koşu tarzında kapatın.
14. Ağrı kesici ilaçları deri altı buprenorfin (0.1 mg / kg) enjeksiyonu yoluyla hemen postop ve daha sonra 3 gün boyunca her 12 saatte bir uygulayın.
15. Bir ısıtma yastığındaki fareleri kurtarın ve normal aktiviteye dönüş için izleyin.
16. İmplantın uygun yerleşimini doğrulamak için postoperatif radyografiler alın.

5. Bakteri yükünü ölçmek için uzunlamasına in vivo biyolüminesans görüntüleme

1. Fareleri inhale izofluran (% 2) ile uyuşturun. Solunumun uyanık olduğundan daha ritmik ve daha yavaş kalmasını ve zararlı uyaranlara yanıt olarak değişmemesini izleyerek uygun anestezi derinliğini onaylayın (ör., cerrahi manipülasyon, ayak parmağı sıkışması).
2. Kemirgen makası ile sakrumdan üst torasik omurgaya kadar kılları alın.
3. İn vivo biyolüminesans görüntüleme (BLI)¹⁹ gerçekleştirmek için fareleri biyolüminesans görüntüleme platformunun görüş alanına yükleyin.
4. Biyolüminesan sinyali 5 dakikalık bir çekim süresi boyunca yakalayın. 15 cm'lik görüş alanına (B) sahip büyük gruplama ayarlarını kullanın.
5. Bakteri yükünü izlemek için postoperatif 0, 1, 3, 5, 7, 10, 14, 18, 21, 25, 28 ve 35. günlerde (veya belirli deneysel tasarıma dayalı diğer günlerde) 5.1-5.4 adımlarını tekrarlayın.
6. BLI verilerini renk skalası aracılığıyla sunun ve gri tonlamalı bir fotoğrafın üzerine bindirin. BLI'yi toplam akı (saniyedeki fotonlar) veya ortalama maksimum akı (fotonlar/saniye/santimetre²/steradyan) cinsinden ölçmek için BLI yazılımını kullanarak standart bir oval ilgi bölgesini (ROI) izole edin.

6. İmplantlara ve çevresindeki dokuya yapışan bakterileri ölçün

1. Fareleri POD 35'te ötenazi yapın veya AVMA Yönergelerine uygun olarak karbondioksite maruz kalma ile alternatif bir ameliyat sonrası tercih tarihi. İkincil servikal çıkık ile ötenaziyi onaylayın.
2. Sırt derisini Adım 4.3'e göre sterilize edin ve fareyi steril bir cerrahi alana yüzüstü yerleştirin.
3. 15 bıçaklı bir cerrahi neşter kullanarak önceki kesiği keskin bir şekilde kesin.
4. L4 spinöz sürecini kör bir şekilde incelemek ve cerrahi implantı tanımlamak için steril makas kullanın.
5. L4 dikenli işlemde implantı nazikçe bükmek ve konumundan çıkarmak için bir iğne ucu kullanın.
6. Steril forseps ve makas kullanarak, cerrahi implantı hemen çevreleyen yaklaşık 0.1 g dikenli işlem kemiği ve yumuşak dokuyu toplayın ve 4 keskin homojenleştirici boncuklu küçük konik gergedan tüpüne 1 mL PBS'ye yerleştirin.
7. Hasattan önce ve sonra konik boruyu tartarak yumuşak dokunun ağırlığını kaydedin.
8. İmplantı TSB'de 0.5 mL% 0.3 Tween-80'e yerleştirin ve 15 dakika boyunca sonikasyon yapın.
9. Elde edilen implant süspansiyonunu 2 dakika vorteksleyin ve gece boyunca 12-16 saat boyunca kültürleyin.
10. Daha önce implantı çevreleyen 1 ml PBS'ye yerleştirilmiş yumuşak doku ve spinöz işlemleri homojenizatör kullanarak homojenize edin.
11. Elde edilen yumuşak doku süspansiyonunu 5 dakika boyunca vorteksleyin ve gece boyunca 12-16 saat boyunca kültürleyin.
12. Gece kültüründen sonra, sırasıyla implanttan ve çevresindeki dokulardan CFU sayın. Yumuşak doku için hasat edilen toplam CFU / g ve sonikasyonlu implant için CFU / mL olarak ifade edilen değer.

Sonuçlar

Burada sunulan prosedür, SII'nin in vivo fare modelinde antibiyotik rejimlerinin etkinliğini değerlendirmek için kullanıldı. Spesifik olarak, vankomisin ve rifampin antibiyotik kombinasyonunun etkinliği, vankomisin monoterapisi ve tedavi edilmemiş enfekte kontrollerle karşılaştırıldı.

Ameliyattan önce, fareler kombinasyon tedavisine, monoterapiye veya enfekte kontrole randomize edildi. Örneklem büyüklüğünü hesaplamak için istatistiksel güç analizi yapılmıştır. Örn...

Tartışmalar

Omurgadaki implantla ilişkili enfeksiyonlar, ^1,2,3,4,5 hastaları için kötü sonuçlara işaret eder. Vücuttaki diğer birçok bölgeden farklı olarak, omurgadaki enfekte donanım, instabilite ve nörolojik uzlaşma riski nedeniyle sıklıkla çıkarılamaz. Sistemik antibiyotik tedavisine dirençli biyofilm bakterileri ortamındaki bu benzersiz zorluk, t...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Analytical Balance ME104	Mettler Toledo	30029067	120 g capacity, 0.1 mg readability, backlit LCD, internal adjustment, metal base
BD Bacto Tryptic Soy Broth	Becton Dickinson (BD)	BD 211825	BD Bacto Tryptic Soy Broth (Soybean-Casein Digest Medium)
Biomate 3S UV-VIS Spectrophotometer	Thermo Scientific	840-208300	Spectrophotometer; Thermo Scientific; BioMate 3S; Six-position cell holder; Spectral bandwidth: 1.8nm; Long-life xenon lamp; Store up to 40 test methods; 16L x 13W x 9 in. H; 19 lb.; 100/240V US line cord
Bioshield 720+ swinging bucket rotor	Thermo Scientific	75003183	Rotor, Swinging bucket; Thermo Scientific; BIOShield 720 high speed; Capacity: 4 x 180mL (0.72L); Angle: 90 deg. ; Max. speed/RCF: 6300rpm/7188 x g; Max. radius: 16.2cm
Branson Ultrasonics 2510R-MTH (Sonicator)	Branson Ultrasonics	CPX952217R	*similar model, our model is discontinued* Branson Ultrasonics MH Series Heated Ultrasonic Cleaning Bath, 120V, 0.75 gal
Bullet Blender Storm Homogenizer	Next Advance	BBY24M	The Bullet Blender Storm is the most powerful member of the Bullet Blender family. Homogenize up to 24 of your toughest samples (mouse femur, skin, cartilage, tumor, etc.) in just minutes. Air cooling™ minimizes sample heat up. Uses 1.5ml screw-cap RINO® tubes or snap-cap Eppendorf® Safe-lock™ tubes.
Germinator 500	Electron Microscopy Sciences	66118-10	The Germinator 500 is designed to decontaminate metal micro-dissecting instruments only. It is to be used exclusively for research purposes. The Germinator 500 should not be used as a substitute for traditional methods of terminal sterilization. Effective sterilization cannot be assured due to lack of routine sterilization-efficacy monitoring methods for glass bead sterilization. The Germinator 500 has been designed and built to pass the Validation of Dry Sterilizer Spore Suspension Test: USP XXIII, Part 1211.
Heracell 150i CO2 Incubator	Thermo Scientific	51026282	Single 150L
IVIS Lumina X5 Imaging System	Perkin Elmer	CLS148590	The IVIS Lumina X5 high-throughput 2D optical imaging system combines high-sensitivity bioluminescence and fluorescence with high-resolution x-ray into a compact system that fits on your benchtop. With an expanded 5 mouse field of view for 2D optical imaging plus our unique line of accessories to accelerate setup and labeling, it has never been easier or faster to get robust data—and answers—on anatomical and molecular aspects of disease.
MAXQ 4450 Digtial Incubating Bench Shaker	Thermo Scientific	SHKE4450	Shaker, Incubated; Thermo Scientific; Digital; MaxQ 4450; Speed 15 to 500rpm +/-1rpm; 5 deg. C above ambient to 80 deg. C; 120V 50/60Hz
PBS, Phosphate Buffered Saline	Fisher Bioreagents	BP24384	PBS, Phosphate Buffered Saline, 1X Solution, pH 7.4
Sorvall Legend Micro 21 Centrifuge, Ventilated	Thermo Scientific	75002436	24 x 1.5/2.0mL rotor with ClickSeal biocontainment lid
SORVALL LEGEND X1R 120V Centrifuge	Thermo Scientific	75004261	Centrifuge, Benchtop; Thermo Scientific; Sorvall Legend X1R (Refrigerated), 1L capacity; Max. Speed/RCF 15,200rpm/25,830 x g; CFC-free cooling -10C to +40C; 120V 60Hz
Staphylococcus aureus - Xen36	Perkin Elmer	119243	Staphylococcus aureus - Xen36 bioluminescent pathogenic bacteria for in vivo and in vitro drug discovery. This product was derived from a parental strain from the American Type Culture Collection, used under license. Staph. aureus-Xen36 possesses a stable copy of the Photorhabdus luminescens lux operon on the native plasmid.
TUTTNAUER AUTOCLAVE 2540E 120V	Heidolph Tuttnauer	23210401	Sterilizer, Benchtop; Heidolph; Tuttnauer; Model 2540E; Self-contained design with refillable reservoir controls water purity for sterilization; 120V 50/60Hz; 1400w. With electronic controls
Tween 80	Fisher Bioreagents	BP338-500	Tween 80, Fisher BioReagents, Non-ionic detergent for selective protein extraction
Vortex mixer VX-200	Labnet Internation	S0200	120V touch or continuous mixer, 230V: 0 - 2,850 rpm,120V: 0 - 3,400 rpm
0.9% Sodium Chloride	Pfizer Injectables/Hospira	00409-4888-10	0.9% Sodium Chloride Injection, USP