척추 임플란트 감염의 In Vivo 마우스 모델

요약

이 프로토콜은 스테인리스강 k-와이어 임플란트가 생물 발광 황색포도상구균 Xen36에 감염된 척추 임플란트 감염의 새로운 생체 내 마우스 모델을 설명합니다. 박테리아 부담은 생물 발광 이미징으로 종단적으로 모니터링되고 안락사 후 콜로니 형성 단위 수로 확인됩니다.

초록

척추 임플란트 감염은 진단이 어렵고 외과적 박멸이 기계적 척추 안정성과 상충되기 때문에 좋지 않은 결과를 예고합니다. 이 방법의 목적은 척추 임플란트 감염에 대한 잠재적인 치료법 및 치료 전략을 테스트하기 위해 저렴하고 신속하며 정확한 생체 내 도구를 제공하기 위해 만들어진 척추 임플란트 감염(SII)의 새로운 마우스 모델을 설명하는 것입니다.

이 방법에서는 12주 된 C57BL/6J 야생형 마우스의 L4 가시 돌기에 스테인리스 스틸 k-와이어를 고정하고 황색포도상구균 Xen36 박테리아의 생물 발광 균주 1 x 10³ CFU를 접종하는 후방 접근 척추 수술 모델을 제시합니다. 그런 다음 마우스는 수술 후 0, 1, 3, 5, 7, 10, 14, 18, 21, 25, 28 및 35일에 생체 내 생물 발광을 위해 종방향으로 이미징됩니다. 표준화된 시야의 생물발광 이미징(BLI) 신호를 정량화하여 생체 내 박테리아 부담을 측정합니다.

임플란트 및 임플란트 주위 조직에 부착하는 박테리아를 정량화하기 위해 마우스를 안락사시키고 임플란트와 주변 연조직을 채취합니다. 박테리아는 초음파 처리에 의해 임플란트에서 분리되고 밤새 배양 된 다음 콜로니 형성 단위 (CFU)가 계산됩니다. 이 방법에서 얻은 결과에는 in vivo S. aureus bioluminescence(평균 최대 플럭스)로 측정한 종적 박테리아 수와 안락사 후 CFU 수가 포함됩니다.

기구 척추 감염의 이전 동물 모델에는 침습적 생체 외 조직 분석이 포함되었지만, 이 논문에서 제시된 SII의 마우스 모델은 정적 조직 연구를 대체하기 위해 생물 발광 박테리아의 비침습적 실시간 생체 내 광학 이미징을 활용합니다. 이 모델의 응용 분야는 광범위하며 대체 생물 발광 박테리아 균주를 활용하고, 숙주 면역 반응을 동시에 연구하기 위해 다른 유형의 유전자 조작 마우스를 통합하고, 항생제 또는 임플란트 코팅과 같은 현재 또는 새로운 진단 및 치료 방식을 평가하거나 조사하는 것이 포함될 수 있습니다.

서문

이 방법의 목적은 척추 임플란트 감염(SII)의 새로운 마우스 모델을 설명하는 것입니다. 이 모델은 생체 내에서 숙주, 병원체 및/또는 임플란트 변수의 영향을 유연하게 평가할 수 있는 저렴하고 정확한 도구를 제공하도록 설계되었습니다. 이 모델에서 척추 임플란트 감염에 대한 잠재적 치료법 및 치료 전략을 테스트하는 것은 대규모 동물 모델 및 임상 시험에 적용하기 전에 연구 개발을 안내하는 것을 목표로 합니다.

척추 수술 후 임플란트 관련 감염은 치명적인 합병증으로, 안타깝게도 선택적 척추 수술을 받은 환자의 약 3-8%에서 발생하며1,2,3,4,5 다 단계 또는^{재수술을 받은} 환자의 최대 65%에서 발생한다⁶. 척추 임플란트 감염을 치료하려면 여러 번의 입원, 여러 번의 수술 및 장기간의 항생제 치료가 필요한 경우가 많습니다. SII는 신경학적 손상, 장애 및 사망 위험 증가를 포함하여 좋지 않은 환자 결과를 예고합니다. SII의 관리는 환자 한 명당 $900,000 이상의 비용이 들 정도로 매우 비쌉니다⁷.

황색포도상구균은 SII 8,9,10,11의 가장 흔한 악성 병원체입니다. 박테리아는 수술 중에 직접 하드웨어를 파종할 수 있으며, 수술 후 기간 동안 상처를 통해 또는 나중에 혈액 확산을 통해 시드될 수 있습니다. 금속 임플란트가 있는 경우 S. aureus는 항생제 요법 및 면역 세포로부터 박테리아를 보호하는 생물막을 형성합니다. 감염된 하드웨어를 제거하는 것은 감염을 효과적으로 근절하는 데 도움이 될 수 있지만, 척추를 불안정하게 만들고 신경학적 손상을 초래하지 않고는 척추에서 감염을 제거할 수 없는 경우가 많다¹².

감염된 하드웨어를 이식하지 않는 경우 SII를 예방, 탐지 및 치료하기 위한 새로운 접근 방식이 필요합니다. 역사적으로 새로운 치료법의 안전성과 효능을 효율적으로 평가하기 위한 SII의 동물 모델은 제한적이었습니다. SII의 이전 동물 모델은 많은 수의 동물과 콜로니 카운팅, 조직학 및 배양을 포함하여 안락사를 필요로 하는 데이터 포인트의 수집을 필요로 한다^13,14,15. 종단적 in vivo 모니터링이 없는 이러한 모델은 동물당 하나의 데이터 포인트만 제공하므로 비용이 많이 들고 비효율적입니다.

무릎 인공관절 치환술 감염의 마우스 모델을 연구한 이전 연구는 감염 부담을 종단적으로 모니터링하기 위한 비침습적 생체 내 광학 영상의 가치와 정확도를 확립했다¹⁶. 생물 발광의 검출을 통해 박테리아 부담을 단일 동물의 종적 시간 과정에 걸쳐 인도적이고 정확하며 효율적으로 정량화할 수 있습니다. 더욱이, 선행 연구들은 생체 내 생물 발광과 임플란트에 부착된 CFU 사이에 높은 상관관계가 있음을 보여주었다¹⁷. 시간이 지남에 따라 감염을 추적할 수 있는 능력은 임플란트 관련 감염에 대한 보다 미묘한 이해로 이어졌습니다. 또한 이러한 방식으로 종단 감염을 모니터링하여 항생제 요법 및 새로운 항균제의 효과를 정확하게 평가할 수 있었습니다^16,17,18.

이러한 도구를 활용하여 수술 후 척추 임플란트 감염 모델을 개발하고 검증했습니다. 제시된 방법에서, 우리는 박테리아 부담 ^16,17,18을 종방향으로 모니터링하기 위해 SII의 생체 내 마우스 모델을 확립하기 위해 생물 발광 S. aureus ^Xen36의 접종물을 사용합니다. 이 새로운 모델은 대규모 동물 모델 및 임상 시험에 적용하기 전에 SII에 대한 잠재적 검출, 예방 및 치료 전략을 효율적으로 테스트할 수 있는 귀중한 도구를 제공합니다.

프로토콜

모든 동물은 동물 복지법(AWA), 1996년 실험 동물 관리 및 사용 가이드, 실험 동물의 인도적 관리 및 사용을 위한 PHS 정책, 동물 관리 및 사용 교육 매뉴얼에 명시된 기관의 정책 및 절차에 명시된 연방 규정에 정의된 모범 동물 관행에 따라 엄격하게 취급되었습니다. 모든 동물 연구는 캘리포니아 대학교 로스 앤젤레스 총장의 동물 연구위원회 (ARC)의 승인을 받았습니다.

1. S. aureus 생물 발광 균주 선택

1. 생물 발광 S. aureus 균주 Xen36을 관심 접종물로 사용하십시오.
   참고: 이 균주는 패혈증 환자로부터 임상적으로 분리된 부모 균주 S. aureus ATCC-49525에서 파생되었습니다. 황색포도상구균(S. aureus) Xen36은 luxABCDE 오페론을 고유하게 활용하며, 이는 숙주의 네이티브 플라스미드에 최적화되고 통합됩니다. ¹⁹ 결과적으로, Xen36 균주는 490nm의 피크 파장 방출을 갖는 청록색 생물 발광광을 생성할 수 있습니다. 이 방출 신호는 신진대사 활동을 하는 살아있는 박테리아 유기체에 의해서만 생성됩니다.

2. S의 준비 접종용 아우레우스

1. Luria Broth에 200μg/mL의 카나마이신과 1.5% 한천을 첨가하여 럭스 오페론¹⁹에 연결된 카나마이신 내성 유전자를 활용하여 잠재적인 오염 물질로부터 S. aureus Xen36을 분리합니다.
2. S. aureus Xen36 박테리아를 트립틱 대두 한천 플레이트(트립틱 대두 육수[TSB]에 1.5% 한천을 더한 값)에 줄무늬를 만들고 37°C에서 12-16시간 동안 배양합니다.
3. S. aureus Xen36의 단일 콜로니를 분리하고 진탕 인큐베이터(200rpm)에서 37°C에서 12-16시간 동안 TSB에서 개별적으로 배양합니다.
4. 결과 배양액을 1:50 비율로 희석합니다.
5. 37°C에서 추가로 2시간 동안 배양하여 중간대수상 박테리아를 분리합니다.
6. 박테리아를 펠렛화하고, 재현탁하고, 인산염 완충 식염수(PBS)에 세 번 세척합니다.
7. 600nm에서 흡광도를 측정합니다. 이상적인 OD600은 0.700에서 0.750 사이이며 4x10⁵ CFU/mL에 해당합니다. 원하는 박테리아 접종(1 x 10³ CFU/2 μL)을 얻기 위해 연속 희석을 수행합니다.
   참고: 만성 감염 확립을 위한 Xen36의 최적 농도는 1 x 10³ CFU인 것으로 밝혀졌습니다. 박테리아의 낮은 투여량은 숙주 면역 체계에 의해 제거되고 더 높은 투여량은 상처 파괴를 일으켰습니다. 상처 파괴는 심부 임플란트 감염과 표재성 상처 감염을 구별하지 않으므로 이 모델에서는 피할 수 있습니다(그림 1)²⁰.

3. 생쥐

1. 12주 된 수컷 C57BL/6J 야생형 마우스를 사용합니다.
2. 한 번에 최대 4마리의 새장에 있는 집 쥐.
3. 항상 물을 사용할 수 있도록 하십시오. 12시간의 밝음/어두움 주기를 유지하고 주기의 어두운 단계 동안에는 실험을 수행하지 마십시오.
4. 형광 신호에 대한 잠재적인 간섭으로 인해 먹이를 위해 알팔파가 없는 차우를 사용하십시오.
5. 연구 또는 수의사가 매일 쥐를 평가하여 실험 내내 동물의 웰빙을 보장하도록 합니다.

4. 마우스 수술 절차

1. 마우스를 이소플루란(2%) 챔버에 약 5분 동안 넣어 마취를 유도합니다. 호흡이 깨어 있을 때보다 리드미컬하고 느리게 유지되고 유해한 자극(예: 외과적 조작, 발가락 꼬집기)에 반응하여 변하지 않도록 모니터링하여 적절한 마취 깊이를 확인합니다.
2. 마취된 쥐를 준비 스테이션으로 옮기고 설치류 가위로 천골에서 상부 흉추로 털을 제거합니다.
3. 베타딘 용액과 이소프로필 알코올을 번갈아 가며 세 번 씻어 피부를 청소하고 살균합니다.
4. 엎드린 자세에서 마취 및 멸균된 마우스를 무균 수술 침대로 옮기고 노즈 콘을 통해 흡입된 이소플루란(2%)을 투여하여 마취를 유지합니다.
5. 엉덩이를 최대한 구부리고 척추 수준에서 무릎의 위치를 식별하여 요추 4 척추체에 근접합니다.
6. 15날 수술용 메스로 피부를 세로로 2cm 절개합니다.
7. 가시돌기를 촉진하여 정중선을 확인하고 뼈까지 절개를 계속합니다.
8. L4 가시돌기의 오른쪽에서 횡돌기까지 측면으로 확장되는 골막하를 절개합니다.
9. 흡수성 편조 봉합사 크기 5-0 두부 및 근막을 통해 L4 몸체에 통과시키고 향후 폐쇄를 준비하기 위해 열린 상태로 둡니다.
10. 25G 척추 바늘을 사용하여 25G 척추 바늘을 사용하여 L4의 가시 돌기를 넓히고 긴 팔이 두부를 놓은 얇은 판을 따라 직경 0.1mm, 길이 1cm "L자형" 수술용 스테인리스 스틸 임플란트를 삽입합니다.
11. 임플란트에 1 x 10³ CFU/2 μL 생물 발광 S. aureus Xen36을 접종하고 모든 용액이 임플란트에 닿도록 주의합니다.
12. 접종 후 이전에 통과된 흡수성 봉합사를 묶기 전에 약 10초 동안 기다렸다가 임플란트에 접종물이 포함되어 있는지 확인합니다.
13. 흡수성 봉합사로 달리는 방식으로 피부를 밀착시킵니다.
14. 진통제는 부프레노르핀(0.1mg/kg)을 즉시 피하주사로 투여한 후 3일간 12시간마다 투여한다.
15. 가열 패드에서 마우스를 회수하고 정상 활동으로 돌아가는지 모니터링합니다.
16. 임플란트의 적절한 배치를 확인하기 위해 수술 후 방사선 사진을 얻습니다.

5. 세균 부담을 측정하기 위한 종방향 생체 내 생물 발광 이미징

1. 흡입된 이소플루란(2%)으로 마우스를 마취합니다. 호흡이 깨어 있을 때보다 리드미컬하고 느리게 유지되고 유해한 자극(예: 외과적 조작, 발가락 꼬집기)에 반응하여 변하지 않도록 모니터링하여 적절한 마취 깊이를 확인합니다.
2. 설치류 가위로 천골에서 상부 흉추까지의 털을 제거합니다.
3. 생쥐를 생물 발광 이미징 플랫폼의 시야에 로드하여 생체 내 생물 발광 이미징(BLI)을 수행합니다¹⁹.
4. 획득 시간 5분 동안 생물 발광 신호를 캡처합니다. 15cm 시야각(B)의 큰 비닝 설정을 활용합니다.
5. 수술 후 0, 1, 3, 5, 7, 10, 14, 18, 21, 25, 28 및 35일(또는 특정 실험 설계에 따라 다른 날)에 5.1-5.4단계를 반복하여 박테리아 부담을 모니터링합니다.
6. 컬러 스케일을 통해 BLI 데이터를 표시하고 그레이스케일 사진에 오버레이합니다. BLI 소프트웨어를 사용하여 표준 난형 관심 영역(ROI)을 분리하여 BLI를 총 플럭스(초당 광자) 또는 평균 최대 플럭스(광자/초/센티미터²/스테라디안)로 정량화합니다.

6. 임플란트 및 주변 조직에 부착된 박테리아 정량화

1. AVMA 지침에 따라 POD 35 또는 이산화탄소에 노출된 대체 수술 후 날짜에 마우스를 안락사시킵니다. 이차성 자궁경부 탈구로 안락사를 확인합니다.
2. 4.3단계에 따라 등쪽 피부를 소독하고 멸균된 수술 부위에 엎드린 쥐를 놓습니다.
3. 15날 수술용 메스를 사용하여 이전 절개 부위를 날카롭게 절개합니다.
4. 멸균 가위를 사용하여 L4 가시돌기를 무뚝뚝하게 절개하고 수술용 임플란트를 식별합니다.
5. 니들 드라이버를 사용하여 L4 가시 돌기의 위치에서 임플란트를 부드럽게 비틀고 제거합니다.
6. 멸균 겸자와 가위를 사용하여 수술용 임플란트 바로 주변의 가시돌기 뼈와 연조직 약 0.1g을 채취하고 4개의 날카로운 균질화 구슬이 있는 작은 원뿔형 코뿔소 튜브에 PBS 1mL를 넣습니다.
7. 수확 전후에 원뿔형 튜브의 무게를 측정하여 연조직의 무게를 기록하십시오.
8. TSB의 0.3% Tween-80 0.5mL에 임플란트를 넣고 15분 동안 초음파 처리합니다.
9. 결과 임플란트 현탁액을 2분 동안 와류하고 12-16시간 동안 밤새 배양합니다.
10. 균질화기를 사용하여 임플란트를 둘러싼 1ml PBS에 이전에 배치된 연조직 및 가시 돌기를 균질화합니다.
11. 생성된 연조직 현탁액을 5분 동안 와류시키고 12-16시간 동안 밤새 배양합니다.
12. 하룻밤 배양 후 임플란트와 주변 조직에서 각각 CFU를 계산합니다. 연조직용으로 수확한 총 CFU/g과 초음파 임플란트용으로 수확한 CFU/mL로 값을 표현합니다.

결과

여기에 제시된 절차는 SII의 생체내 마우스 모델에서 항생제 요법의 효능을 평가하는 데 사용되었습니다. 구체적으로, 반코마이신과 리팜핀 항생제 병용요법의 효능을 반코마이신 단독요법 및 치료되지 않은 감염 대조군과 비교하였다.

수술 전에 마우스는 병용 요법, 단일 요법 또는 감염 대조군에 무작위 배정되었습니다. 표본 크기를 계산하기 위해 통계적 검정력 분석을 수...

토론

척추의 임플란트 관련 감염은 환자에게 좋지 않은 결과를 예고한다 1,2,3,4,5. 신체의 다른 많은 부위와 달리 척추의 감염된 하드웨어는 불안정성과 신경학적 손상의 위험으로 인해 제거할 수 없는 경우가 많습니다. 전신 항생제 치료에 내성이 있는 생물막 박테리아 설정에서 ...

자료

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BD Bacto Tryptic Soy Broth	Becton Dickinson (BD)	BD 211825	BD Bacto Tryptic Soy Broth (Soybean-Casein Digest Medium)
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