Modello murino in vivo di infezione da impianto spinale

Riepilogo

Il protocollo descrive un nuovo modello murino in vivo di infezione da impianto spinale in cui un impianto k-wire in acciaio inossidabile è infettato da Staphylococcus aureus Xen36 bioluminescente. La carica batterica viene monitorata longitudinalmente con imaging bioluminescente e confermata con la conta delle unità formanti colonie dopo l'eutanasia.

Abstract

Le infezioni da impianti spinali fanno presagire scarsi risultati poiché la diagnosi è difficile e l'eradicazione chirurgica è in contrasto con la stabilità meccanica della colonna vertebrale. Lo scopo di questo metodo è quello di descrivere un nuovo modello murino di infezione da impianto spinale (SII) che è stato creato per fornire uno strumento in vivo economico, rapido e accurato per testare potenziali terapie e strategie di trattamento per le infezioni da impianti spinali.

In questo metodo, presentiamo un modello di chirurgia spinale con approccio posteriore in cui un filo k in acciaio inossidabile viene trafitto nel processo spinoso L4 di topi wild-type C57BL/6J di 12 settimane e inoculato con 1 x 10³ CFU di un ceppo bioluminescente di batteri Staphylococcus aureus Xen36. I topi vengono quindi sottoposti a imaging longitudinale per la bioluminescenza in vivo nei giorni post-operatori 0, 1, 3, 5, 7, 10, 14, 18, 21, 25, 28 e 35. I segnali di imaging a bioluminescenza (BLI) provenienti da un campo visivo standardizzato vengono quantificati per misurare la carica batterica in vivo.

Per quantificare i batteri che aderiscono agli impianti e al tessuto perimplantare, i topi vengono sottoposti a eutanasia e vengono raccolti l'impianto e i tessuti molli circostanti. I batteri vengono staccati dall'impianto mediante sonicazione, coltivati durante la notte e quindi vengono contate le unità formanti colonie (CFU). I risultati acquisiti da questo metodo includono la conta batterica longitudinale misurata dalla bioluminescenza in vivo di S. aureus (flusso massimo medio) e la conta delle CFU dopo eutanasia.

Mentre i precedenti modelli animali di infezione della colonna vertebrale strumentata hanno comportato un'analisi invasiva dei tessuti ex vivo, il modello murino di SII presentato in questo documento sfrutta l'imaging ottico in vivo non invasivo e in tempo reale di batteri bioluminescenti per sostituire lo studio statico dei tessuti. Le applicazioni del modello sono ampie e possono includere l'utilizzo di ceppi batterici bioluminescenti alternativi, l'incorporazione di altri tipi di topi geneticamente modificati per studiare contemporaneamente la risposta immunitaria dell'ospite e la valutazione di nuove modalità diagnostiche e terapeutiche come antibiotici o rivestimenti implantari.

Introduzione

Lo scopo di questo metodo è quello di descrivere un nuovo modello murino di infezione da impianto spinale (SII). Questo modello è stato progettato per fornire uno strumento economico e accurato per valutare in modo flessibile l'effetto delle variabili dell'ospite, dell'agente patogeno e/o dell'impianto in vivo. Il test di potenziali terapie e strategie di trattamento per le infezioni da impianti spinali in questo modello ha lo scopo di guidare lo sviluppo della ricerca prima dell'applicazione in modelli animali più grandi e studi clinici.

L'infezione correlata all'impianto dopo un intervento chirurgico alla colonna vertebrale è una complicanza devastante e purtroppo si verifica in circa il 3-8% dei pazienti sottoposti a chirurgia elettiva della colonna vertebrale 1,2,3,4,5 e fino al 65% dei pazienti sottoposti a chirurgia multilivello o di revisione 6. Il trattamento delle infezioni da impianti spinali spesso richiede più ricoveri, più interventi chirurgici e una terapia antibiotica prolungata. Le SII fanno presagire esiti negativi per i pazienti, tra cui compromissione neurologica, disabilità e un aumento del rischio di mortalità. La gestione della SII è estremamente costosa e costa fino a 900.000 dollari per paziente⁷.

Lo Staphylococcus aureus è il patogeno virulento più comune di SII 8,9,10,11. I batteri possono seminare l'hardware direttamente durante l'intervento chirurgico, attraverso la ferita durante il periodo postoperatorio o successivamente attraverso la diffusione ematogena. In presenza di impianti metallici, S. aureus forma un biofilm che protegge i batteri dalla terapia antibiotica e le cellule immunitarie. Sebbene la rimozione dell'hardware infetto possa aiutare a sradicare efficacemente un'infezione, ciò non è spesso fattibile nella colonna vertebrale senza causare destabilizzazione e rischiare una compromissione neurologica¹².

In assenza di espianto di hardware infetto, sono necessari nuovi approcci per prevenire, rilevare e trattare la SII. Storicamente, ci sono stati modelli animali limitati di SII per valutare in modo efficiente la sicurezza e l'efficacia di nuove terapie. I precedenti modelli animali di SII richiedevano un gran numero di animali e la raccolta di dati che richiedevano l'eutanasia, tra cui il conteggio delle colonie, l'istologia e la coltura^13,14,15. Mancando di un monitoraggio longitudinale in vivo, questi modelli forniscono solo un punto dati per animale e sono quindi costosi e inefficienti.

Un precedente lavoro che studiava un modello murino di infezione da artroplastica del ginocchio ha stabilito il valore e l'accuratezza dell'imaging ottico in vivo non invasivo per monitorare longitudinalmente il carico di infezione¹⁶. Il rilevamento della bioluminescenza consente di quantificare la carica batterica su un decorso temporale longitudinale in un singolo animale in modo umano, accurato ed efficiente. Inoltre, studi precedenti hanno dimostrato un'elevata correlazione tra la bioluminescenza in vivo e le CFU aderenti agli impianti¹⁷. La capacità di tracciare l'infezione nel tempo ha portato a una comprensione più sfumata dell'infezione correlata all'impianto. Inoltre, il monitoraggio longitudinale dell'infezione in questo modo ha permesso di valutare con precisione l'efficacia della terapia antibiotica e dei nuovi antimicrobici^16,17,18.

Sfruttando questi strumenti, abbiamo sviluppato e validato un modello di infezione postoperatoria dell'impianto spinale. Nel metodo presentato, utilizziamo un inoculo di S. aureus Xen36 bioluminescente per stabilire un modello murino in vivo di SII per monitorare longitudinalmente la carica batterica^16,17,18. Questo nuovo modello fornisce uno strumento prezioso per testare in modo efficiente le potenziali strategie di rilevamento, prevenzione e trattamento per la SII prima della loro applicazione in modelli animali più grandi e studi clinici.

Protocollo

Tutti gli animali sono stati trattati in stretta conformità con le buone pratiche animali, come definito nei regolamenti federali come stabilito nell'Animal Welfare Act (AWA), nella Guida del 1996 per la cura e l'uso degli animali da laboratorio, nella politica PHS per la cura e l'uso umano degli animali da laboratorio, nonché nelle politiche e procedure dell'istituzione come stabilito nel Manuale di formazione per la cura e l'uso degli animali. e tutto il lavoro sugli animali è stato approvato dal Comitato per la Ricerca Animale (ARC) del Cancelliere dell'Università della California di Los Angeles.

1. Scelta del ceppo bioluminescente di S. aureus

1. Utilizzare il ceppo bioluminescente di S. aureus Xen36 come inoculo di interesse.
   NOTA: Questo ceppo è stato derivato dal ceppo parentale S. aureus ATCC-49525, che è un isolato clinico di un paziente settico. S. aureus Xen36 utilizza in modo univoco un operone ABCDE lux, che è ottimizzato e integrato nel plasmide nativo dell'ospite. ¹⁹ Di conseguenza, il ceppo Xen36 è in grado di produrre una luce bioluminescente blu-verde con un'emissione di lunghezza d'onda di picco di 490 nm. Questo segnale di emissione è prodotto solo da organismi batterici metabolicamente attivi viventi.

2. Preparazione di S. aureo per inoculazione

1. Aggiungere 200 μg/mL di kanamicina al brodo di Luria più l'1,5% di agar per isolare S. aureus Xen36 da potenziali contaminanti, utilizzando il gene di resistenza alla kanamicina legato all'operone lux ¹⁹.
2. Versare i batteri S. aureus Xen36 su piastre di agar di soia triptica (brodo di soia triptico [TSB] più 1,5% di agar) e incubare a 37 °C per 12-16 ore.
3. Isolare singole colonie di S. aureus Xen36 e colcolare singolarmente in TSB per 12-16 ore a 37 °C in un incubatore ad agitazione (200 giri/min).
4. Diluire la coltura risultante in un rapporto 1:50.
5. Coltura per ulteriori 2 ore a 37 °C per isolare i batteri in fase mediologaritmica.
6. Pellettare, risospendere e lavare i batteri in soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) tre volte.
7. Misurare l'assorbanza a 600 nm. L'OD600 ideale è compreso tra 0,700 e 0,750 che corrisponde a 4x10⁵ CFU/mL. Eseguire diluizioni seriali per ottenere l'inoculo batterico desiderato (1 x 10³ CFU/2 μL).
   NOTA: La concentrazione ottimale di Xen36 per l'instaurarsi di un'infezione cronica è risultata essere 1 x 10³ CFU. Un dosaggio più basso di batteri è stato eliminato dal sistema immunitario dell'ospite e un dosaggio più elevato ha causato la rottura della ferita. La rottura della ferita non distingue tra un'infezione profonda dell'impianto e un'infezione superficiale della ferita e viene quindi evitata in questo modello (Figura 1)²⁰.

3. Topi

1. Utilizzare topi maschi di tipo selvatico C57BL/6J di 12 settimane.
2. Topi domestici in gabbie con un massimo di 4 alla volta.
3. Tenere sempre a disposizione l'acqua. Mantenere un ciclo luce/buio di 12 ore e non eseguire esperimenti durante la fase oscura del ciclo.
4. Utilizzare cibo privo di erba medica per l'alimentazione a causa della potenziale interferenza con la segnalazione fluorescente.
5. Chiedere al personale di ricerca o veterinario di valutare quotidianamente i topi per garantire il benessere degli animali durante l'intero esperimento.

4. Procedure chirurgiche del topo

1. Indurre l'anestesia mettendo i topi in una camera di isoflurano (2%) per circa 5 minuti. Confermare l'appropriata profondità dell'anestesia monitorando che la respirazione rimanga ritmica e più lenta rispetto a quando si è svegli e non cambi in risposta a stimoli nocivi (ad esempio, manipolazione chirurgica, pizzicamento delle dita dei piedi).
2. Trasferire i topi anestetizzati in una stazione di preparazione e rimuovere i peli dall'osso sacro alla colonna vertebrale toracica superiore con tosatrici per roditori.
3. Pulisci e sterilizza la pelle con tripli lavaggi di soluzione alternata di betadina e alcol isopropilico.
4. Trasferire topi anestetizzati e sterilizzati in posizione prona su un letto chirurgico sterile mantenendo l'anestesia con somministrazione di isoflurano per via inalatoria (2%) tramite cono nasale.
5. Flettere al massimo i fianchi e identificare la posizione del ginocchio a livello della colonna vertebrale per approssimare il corpo vertebrale lombare 4.
6. Praticare un'incisione longitudinale di 2 cm attraverso la pelle con un bisturi chirurgico a 15 lame.
7. Palpare i processi spinosi per confermare la linea mediana e continuare l'incisione fino all'osso.
8. Sezionare sottoperiostale sul lato destro del processo spinoso L4, estendendosi lateralmente al processo trasverso.
9. Passare una sutura intrecciata assorbibile di misura 5-0 cefalad e caudad al corpo L4 attraverso la fascia e lasciare aperta, in preparazione per la futura chiusura.
10. Utilizzando un ago spinale da 25 G, alesare il processo spinoso di L4 utilizzando un ago spinale da 25 G e inserire un impianto chirurgico in acciaio inossidabile di grado "L" di 0,1 mm di diametro, lungo 1 cm, lungo 1 cm lungo la lamina con il braccio lungo che posa cefalica.
11. Inoculare l'impianto con 1 x 10³ CFU/2 μL di S. aureus Xen36 bioluminescente, avendo cura di assicurarsi che tutta la soluzione entri in contatto con l'impianto.
12. Attendere circa 10 secondi prima di legare la sutura assorbibile precedentemente passata dopo l'inoculazione per garantire il contenimento dell'inoculo sull'impianto.
13. Chiudi la pelle in modo da corsa con sutura riassorbibile.
14. Somministrare farmaci antidolorifici tramite iniezione sottocutanea di buprenorfina (0,1 mg/kg) immediatamente dopo postop e poi ogni 12 ore per 3 giorni successivi.
15. Recupera i mouse su un termoforo e monitora il ritorno alla normale attività.
16. Ottenere radiografie postoperatorie per confermare il posizionamento appropriato dell'impianto.

5. Imaging longitudinale in bioluminescenza in vivo per misurare la carica batterica

1. Anestetizzare i topi con isoflurano per via inalatoria (2%). Confermare l'appropriata profondità dell'anestesia monitorando che la respirazione rimanga ritmica e più lenta rispetto a quando si è svegli e non cambi in risposta a stimoli nocivi (ad esempio, manipolazione chirurgica, pizzicamento delle dita dei piedi).
2. Rimuovere i peli dall'osso sacro alla parte superiore della colonna vertebrale toracica con un tagliarodi.
3. Caricare i topi sul campo visivo della piattaforma di imaging bioluminescente per eseguire l'imaging a bioluminescenza (BLI) in ^vivo19.
4. Cattura il segnale bioluminescente in un tempo di acquisizione di 5 minuti. Utilizzare impostazioni di binning di grandi dimensioni con un campo visivo di 15 cm (B).
5. Ripetere i passaggi 5.1-5.4 nei giorni postoperatori 0, 1, 3, 5, 7, 10, 14, 18, 21, 25, 28 e 35 (o altri giorni in base a un disegno sperimentale specifico) per monitorare la carica batterica.
6. Presenta i dati BLI tramite scala di colori e sovrapposizione su una fotografia in scala di grigi. Isolare una regione di interesse ovoidale (ROI) standard utilizzando il software BLI per quantificare il BLI nel flusso totale (fotoni al secondo) o nel flusso massimo medio (fotoni/secondo/centimetro²/steradiante).

6. Quantificare i batteri aderenti agli impianti e ai tessuti circostanti

1. Sopprimere i topi con POD 35 o una data post-operatoria alternativa a scelta con esposizione all'anidride carbonica in conformità con le linee guida AVMA. Confermare l'eutanasia con lussazione cervicale secondaria.
2. Sterilizzare la pelle dorsale secondo il passaggio 4.3 e posizionare il topo prono su un campo chirurgico sterile.
3. Incidere nettamente l'incisione precedente utilizzando un bisturi chirurgico a 15 lame.
4. Utilizzare forbici sterili per sezionare senza mezzi termini il processo spinoso L4 e identificare l'impianto chirurgico.
5. Utilizzare un cacciavite ad ago per ruotare delicatamente e rimuovere l'impianto dalla sua posizione nel processo spinoso L4.
6. Utilizzando pinze e forbici sterili, prelevare circa 0,1 g di osso spinoso e tessuto molle immediatamente circostante l'impianto chirurgico e posizionare 1 ml di PBS in un piccolo tubo conico di rinoceronte con 4 perline omogeneizzanti affilate.
7. Registrare il peso dei tessuti molli pesando una provetta conica prima e dopo il raccolto.
8. Posizionare l'impianto in 0,5 ml di Tween-80 allo 0,3% in TSB e sonicare per 15 minuti.
9. Vorticare la sospensione dell'impianto risultante per 2 minuti e coltura durante la notte per 12-16 ore.
10. Omogeneizzare i tessuti molli e i processi spinosi precedentemente inseriti in 1 ml di PBS che circonda l'impianto utilizzando l'omogeneizzatore.
11. Agitare la sospensione dei tessuti molli risultante per 5 minuti e coltura per una notte per 12-16 ore.
12. Dopo la coltura notturna, contare rispettivamente la CFU dall'impianto e dai tessuti circostanti. Esprimere il valore come CFU/g totali raccolti per i tessuti molli e CFU/mL per l'impianto sonicato.

Risultati

La procedura qui presentata è stata utilizzata per valutare l'efficacia dei regimi antibiotici in un modello murino in vivo di SII. In particolare, l'efficacia della terapia antibiotica combinata con vancomicina e rifampicina è stata confrontata con la monoterapia con vancomicina e con i controlli infetti non trattati.

Prima dell'intervento chirurgico, i topi sono stati randomizzati alla terapia di combinazione, alla monoterapia o al controllo infetto. È stata eseguita un'analisi statistica...

Discussione

Le infezioni correlate all'impianto nella colonna vertebrale fanno presagire esiti negativi per i pazienti 1,2,3,4,5. A differenza di molte altre aree del corpo, l'hardware infetto nella colonna vertebrale spesso non può essere rimosso a causa del rischio di instabilità e compromissione neurologica. Questa sfida unica nel contesto dei batteri a biofilm resis...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Analytical Balance ME104	Mettler Toledo	30029067	120 g capacity, 0.1 mg readability, backlit LCD, internal adjustment, metal base
BD Bacto Tryptic Soy Broth	Becton Dickinson (BD)	BD 211825	BD Bacto Tryptic Soy Broth (Soybean-Casein Digest Medium)
Biomate 3S UV-VIS Spectrophotometer	Thermo Scientific	840-208300	Spectrophotometer; Thermo Scientific; BioMate 3S; Six-position cell holder; Spectral bandwidth: 1.8nm; Long-life xenon lamp; Store up to 40 test methods; 16L x 13W x 9 in. H; 19 lb.; 100/240V US line cord
Bioshield 720+ swinging bucket rotor	Thermo Scientific	75003183	Rotor, Swinging bucket; Thermo Scientific; BIOShield 720 high speed; Capacity: 4 x 180mL (0.72L); Angle: 90 deg. ; Max. speed/RCF: 6300rpm/7188 x g; Max. radius: 16.2cm
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PBS, Phosphate Buffered Saline	Fisher Bioreagents	BP24384	PBS, Phosphate Buffered Saline, 1X Solution, pH 7.4
Sorvall Legend Micro 21 Centrifuge, Ventilated	Thermo Scientific	75002436	24 x 1.5/2.0mL rotor with ClickSeal biocontainment lid
SORVALL LEGEND X1R 120V Centrifuge	Thermo Scientific	75004261	Centrifuge, Benchtop; Thermo Scientific; Sorvall Legend X1R (Refrigerated), 1L capacity; Max. Speed/RCF 15,200rpm/25,830 x g; CFC-free cooling -10C to +40C; 120V 60Hz
Staphylococcus aureus - Xen36	Perkin Elmer	119243	Staphylococcus aureus - Xen36 bioluminescent pathogenic bacteria for in vivo and in vitro drug discovery. This product was derived from a parental strain from the American Type Culture Collection, used under license. Staph. aureus-Xen36 possesses a stable copy of the Photorhabdus luminescens lux operon on the native plasmid.
TUTTNAUER AUTOCLAVE 2540E 120V	Heidolph Tuttnauer	23210401	Sterilizer, Benchtop; Heidolph; Tuttnauer; Model 2540E; Self-contained design with refillable reservoir controls water purity for sterilization; 120V 50/60Hz; 1400w. With electronic controls
Tween 80	Fisher Bioreagents	BP338-500	Tween 80, Fisher BioReagents, Non-ionic detergent for selective protein extraction
Vortex mixer VX-200	Labnet Internation	S0200	120V touch or continuous mixer, 230V: 0 - 2,850 rpm,120V: 0 - 3,400 rpm
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