In-vivo-Mausmodell für Wirbelsäulenimplantatinfektionen

Zusammenfassung

Das Protokoll beschreibt ein neuartiges In-vivo-Mausmodell für Wirbelsäulenimplantatinfektionen, bei dem ein K-Draht-Implantat aus Edelstahl mit biolumineszierendem Staphylococcus aureus Xen36 infiziert ist. Die bakterielle Belastung wird longitudinal mit biolumineszierender Bildgebung überwacht und mit koloniebildenden Einheitenzählungen nach Euthanasie bestätigt.

Zusammenfassung

Infektionen mit Wirbelsäulenimplantaten deuten auf schlechte Ergebnisse hin, da die Diagnose schwierig ist und die chirurgische Eradikation im Widerspruch zur mechanischen Stabilität der Wirbelsäule steht. Der Zweck dieser Methode ist es, ein neuartiges Mausmodell für spinale Implantatinfektionen (SII) zu beschreiben, das entwickelt wurde, um ein kostengünstiges, schnelles und genaues In-vivo-Werkzeug zum Testen potenzieller Therapeutika und Behandlungsstrategien für Wirbelsäulenimplantatinfektionen bereitzustellen.

In dieser Methode stellen wir ein Modell der posterioren Wirbelsäulenchirurgie vor, bei dem ein K-Draht aus Edelstahl in den Dornfortsatz L4 von 12 Wochen alten C57BL/6J-Wildtyp-Mäusen eingedrungen und mit 1 x 10³ KBE eines biolumineszierenden Stammes des Staphylococcus aureus Xen36-Bakteriums inokuliert wird. Die Mäuse werden dann an den postoperativen Tagen 0, 1, 3, 5, 7, 10, 14, 18, 21, 25, 28 und 35 in vivo longitudinal für Biolumineszenz abgebildet. Biolumineszenz-Bildgebungssignale (BLI) aus einem standardisierten Sichtfeld werden quantifiziert, um die bakterielle Belastung in vivo zu messen.

Um Bakterien zu quantifizieren, die an Implantaten und periimplantärem Gewebe haften, werden Mäuse euthanasiert und das Implantat und das umgebende Weichgewebe entnommen. Die Bakterien werden durch Beschallung vom Implantat gelöst, über Nacht kultiviert und dann werden koloniebildende Einheiten (KBE) gezählt. Zu den Ergebnissen, die mit dieser Methode gewonnen werden, gehören longitudinale Bakterienzahlen, gemessen durch in vivo S. aureus-Biolumineszenz (mittlerer maximaler Fluss) und KBE-Zählungen nach Euthanasie.

Während frühere Tiermodelle für instrumentierte Wirbelsäuleninfektionen eine invasive Ex-vivo-Gewebeanalyse beinhalteten, nutzt das in dieser Arbeit vorgestellte Mausmodell der SII die nicht-invasive, optische Echtzeit-In-vivo-Bildgebung von biolumineszierenden Bakterien, um statische Gewebeuntersuchungen zu ersetzen. Die Anwendungen des Modells sind breit gefächert und können die Verwendung alternativer biolumineszierender Bakterienstämme, die Einbeziehung anderer Arten von gentechnisch veränderten Mäusen zur gleichzeitigen Untersuchung der Immunantwort des Wirts und die Bewertung aktueller oder die Untersuchung neuer diagnostischer und therapeutischer Modalitäten wie Antibiotika oder Implantatbeschichtungen umfassen.

Einleitung

Das Ziel dieser Methode ist es, ein neuartiges Mausmodell der spinalen Implantatinfektion (SII) zu beschreiben. Dieses Modell wurde entwickelt, um ein kostengünstiges und genaues Werkzeug zur flexiblen Bewertung der Wirkung von Wirts-, Erreger- und/oder Implantatvariablen in vivo bereitzustellen. Die Erprobung potenzieller Therapeutika und Behandlungsstrategien für Wirbelsäulenimplantatinfektionen in diesem Modell zielt darauf ab, die Forschungsentwicklung vor der Anwendung in größeren Tiermodellen und klinischen Studien zu steuern.

Implantatbedingte Infektionen nach Wirbelsäulenoperationen sind eine verheerende Komplikation und treten leider bei etwa 3–8 % der Patienten auf, die sich einer elektiven Wirbelsäulenoperation unterziehen 1,2,3,4,5 und bis zu 65 % der Patienten, die sich einer Mehrebenen- oder Revisionsoperation unterziehen ⁶. Die Behandlung von Wirbelsäulenimplantatinfektionen erfordert oft mehrere Krankenhausaufenthalte, mehrere Operationen und eine längere Antibiotikatherapie. SIIs deuten auf schlechte Patientenergebnisse hin, einschließlich neurologischer Beeinträchtigungen, Behinderungen und eines erhöhten Mortalitätsrisikos. Die Behandlung von SII ist extrem teuer und kostet mehr als 900.000 US-Dollar pro Patient⁷.

Staphylococcus aureus ist der häufigste virulente Erreger von SII 8,9,10,11. Bakterien können die Hardware direkt während der Operation, durch die Wunde während der postoperativen Phase oder später durch hämatogene Ausbreitung aussäen. In Gegenwart von Metallimplantaten bildet S. aureus einen Biofilm, der die Bakterien vor einer Antibiotikatherapie und Immunzellen schützt. Während die Entfernung infizierter Hardware dazu beitragen kann, eine Infektion effektiv auszurotten, ist dies in der Wirbelsäule häufig nicht möglich, ohne eine Destabilisierung zu verursachen und eine neurologische Beeinträchtigung zu riskieren¹².

Da infizierte Hardware nicht explantiert werden kann, sind neue Ansätze zur Vorbeugung, Erkennung und Behandlung von SII erforderlich. In der Vergangenheit gab es nur begrenzte Tiermodelle für SII, um die Sicherheit und Wirksamkeit neuartiger Therapien effizient zu bewerten. Bisherige Tiermodelle der SII erfordern eine große Anzahl von Tieren und die Erfassung von Datenpunkten, die Euthanasie erfordern, einschließlich Koloniezählung, Histologie und Kultur^13,14,15. Da es keine longitudinale In-vivo-Überwachung gibt, liefern diese Modelle nur einen Datenpunkt pro Tier und sind daher teuer und ineffizient.

Frühere Arbeiten zur Untersuchung eines Mausmodells für Knieendoprothetikinfektionen erwiesen den Wert und die Genauigkeit der nicht-invasiven optischen In-vivo-Bildgebung zur longitudinalen Überwachung der Infektionslast¹⁶. Der Nachweis von Biolumineszenz ermöglicht es, die bakterielle Belastung über einen longitudinalen Zeitverlauf in einem einzelnen Tier human, genau und effizient zu quantifizieren. Darüber hinaus haben frühere Studien eine hohe Korrelation zwischen In-vivo-Biolumineszenz und an Implantaten haftenden KBE gezeigt¹⁷. Die Fähigkeit, Infektionen im Laufe der Zeit zu verfolgen, hat zu einem nuancierteren Verständnis von implantatbedingten Infektionen geführt. Darüber hinaus hat die Überwachung der longitudinalen Infektion auf diese Weise eine genaue Bewertung der Wirksamkeit der Antibiotikatherapie und neuartiger antimikrobieller Mittel ermöglicht^16,17,18.

Mit Hilfe dieser Werkzeuge haben wir ein Modell der postoperativen Wirbelsäulenimplantatinfektion entwickelt und validiert. In der vorgestellten Methode verwenden wir ein Inokulum von biolumineszierendem S. aureus Xen36, um ein in vivo Mausmodell der SII zu etablieren, um die bakterielle Belastung longitudinal zu überwachen^16,17,18. Dieses neuartige Modell bietet ein wertvolles Werkzeug, um potenzielle Erkennungs-, Präventions- und Behandlungsstrategien für SII effizient zu testen, bevor sie in größeren Tiermodellen und klinischen Studien angewendet werden.

Protokoll

Alle Tiere wurden in strikter Übereinstimmung mit der guten Tierpraxis behandelt, wie sie in den Bundesvorschriften definiert ist, wie sie im Tierschutzgesetz (AWA), dem Leitfaden für die Pflege und Verwendung von Labortieren von 1996, der PHS-Richtlinie für die humane Pflege und Verwendung von Labortieren sowie in den Richtlinien und Verfahren der Einrichtung festgelegt sind, wie sie im Schulungshandbuch für die Pflege und Verwendung von Tieren festgelegt sind. und alle Tierarbeiten wurden vom Animal Research Committee (ARC) des Kanzlers der University of California in Los Angeles genehmigt.

1. Wahl des biolumineszierenden Stamms S. aureus

1. Verwenden Sie den biolumineszierenden S. aureus-Stamm Xen36 als Inokulum von Interesse.
   HINWEIS: Dieser Stamm wurde vom Elternstamm S. aureus ATCC-49525 abgeleitet, einem klinischen Isolat eines septischen Patienten. S. aureus Xen36 nutzt auf einzigartige Weise ein Lux-ABCDE-Operon, das optimiert und in das native Plasmid des Wirts integriert ist. ¹⁹ Infolgedessen ist der Xen36-Stamm in der Lage, ein blau-grünes biolumineszierendes Licht mit einer Spitzenwellenlänge von 490 nm zu erzeugen. Dieses Emissionssignal wird nur von lebenden stoffwechselaktiven Bakterien erzeugt.

2. Zubereitung von S. aureus zur Inokulation

1. Zugabe von 200 μg/ml Kanamycin zu Luria-Bouillon plus 1,5%igem Agar, um S. aureus Xen36 aus potenziellen Verunreinigungen zu isolieren, wobei das Kanamycin-Resistenzgen, das mit dem Lux-Operon ¹⁹ verbunden ist, verwendet wird.
2. S. aureus Xen36-Bakterien auf tryptische Soja-Agarplatten (tryptische Sojabrühe [TSB] plus 1,5 % Agar) auftragen und bei 37 °C für 12-16 h inkubieren.
3. Einzelne Kolonien von S. aureus Xen36 isolieren und einzeln in TSB für 12-16 h bei 37 °C in einem Schüttelinkubator (200 U/min) kultivieren.
4. Die resultierende Kultur wird im Verhältnis 1:50 verdünnt.
5. Weitere 2 h bei 37 °C kultivieren, um Bakterien in der mittleren logarithmischen Phase zu isolieren.
6. Pelletieren, resuspendieren und waschen Sie Bakterien dreimal in phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS).
7. Messen Sie die Absorption bei 600 nm. Der ideale OD600 liegt zwischen 0,700 und 0,750, was 4x10⁵ KBE/ml entspricht. Führen Sie serielle Verdünnungen durch, um das gewünschte bakterielle Inokulum (1 x 10³ KBE/2 μl) zu erreichen.
   HINWEIS: Die optimale Konzentration von Xen36 für die Etablierung einer chronischen Infektion betrug 1 x 10³ KBE. Eine niedrigere Dosierung der Bakterien wurde vom Immunsystem des Wirts beseitigt und eine höhere Dosierung führte zu einem Wundabbau. Der Wundabbau unterscheidet nicht zwischen einer tiefen Implantatinfektion und einer oberflächlichen Wundinfektion und wird daher in diesem Modell vermieden (Abbildung 1)²⁰.

3. Mäuse

1. Verwenden Sie 12 Wochen alte männliche C57BL/6J-Wildtyp-Mäuse.
2. Hausmäuse in Käfigen mit maximal 4 auf einmal.
3. Halten Sie jederzeit Wasser bereit. Halten Sie einen 12-stündigen Hell-Dunkel-Zyklus ein und führen Sie während der Dunkelphase des Zyklus keine Experimente durch.
4. Verwenden Sie luzernefreies Futter für die Fütterung, da es zu Interferenzen mit der Fluoreszenzsignalisierung kommen kann.
5. Lassen Sie die Mäuse täglich von Forschungs- oder Veterinärpersonal untersuchen, um das Wohlergehen der Tiere während des gesamten Versuchs zu gewährleisten.

4. Chirurgische Eingriffe bei Mäusen

1. Induzieren Sie eine Anästhesie, indem Sie Mäuse für etwa 5 Minuten in eine Isofluran-Kammer (2 %) legen. Bestätigen Sie eine angemessene Anästhesietiefe, indem Sie die Atmung so überwachen, dass sie rhythmisch und langsamer bleibt als im Wachzustand und sich nicht als Reaktion auf schädliche Reize (z. B. chirurgische Manipulation, Zehenkneifen) verändert.
2. Bringen Sie betäubte Mäuse in eine Vorbereitungsstation und entfernen Sie die Haare vom Kreuzbein bis zur oberen Brustwirbelsäule mit einer Nagetierschere.
3. Reinigen und sterilisieren Sie die Haut mit dreifachen Waschungen mit abwechselnder Betadinlösung und Isopropylalkohol.
4. Übertragen Sie anästhesierte und sterilisierte Mäuse in Bauchlage auf ein steriles Operationsbett unter Aufrechterhaltung der Anästhesie mit Verabreichung von inhalativem Isofluran (2%) über den Nasenkegel.
5. Beugen Sie die Hüften maximal und identifizieren Sie die Position des Knies auf Höhe der Wirbelsäule, um sich dem Wirbelkörper der Lendenwirbelsäule 4 anzunähern.
6. Machen Sie einen 2 cm langen Längsschnitt durch die Haut mit einem chirurgischen Skalpell mit 15 Klingen.
7. Abtasten Sie die Dornfortsätze, um die Mittellinie zu bestätigen, und setzen Sie den Schnitt bis zum Knochen fort.
8. Subperiostal auf der rechten Seite des Dornfortsatzes L4 sezieren, der sich lateral zum Querfortsatz erstreckt.
9. Eine resorbierbare geflochtene Naht der Größe 5-0 Cephalad und Caudad durch die Faszie an den L4-Körper führen und offen lassen, um einen zukünftigen Verschluss vorzubereiten.
10. Mit einer 25-G-Wirbelsäulennadel den Dornfortsatz von L4 mit einer 25-G-Wirbelsäulennadel einreiben und ein 1 cm langes, "L-förmiges" chirurgisches Edelstahlimplantat mit 0,1 mm Durchmesser entlang der Lamina einsetzen, wobei der lange Arm auf Cephalad liegt.
11. Beimpfen Sie das Implantat mit 1 x 10³ KBE/2 μl biolumineszierendem S. aureus Xen36 und achten Sie darauf, dass die gesamte Lösung mit dem Implantat in Kontakt kommt.
12. Warten Sie ca. 10 Sekunden, bevor Sie die zuvor durchgeführte resorbierbare Naht nach der Inokulation abbinden, um sicherzustellen, dass das Inokulum auf dem Implantat eingeschlossen ist.
13. Schließen Sie die Haut laufend mit resorbierbarem Nahtmaterial.
14. Verabreichen Sie Schmerzmittel durch subkutane Injektion von Buprenorphin (0,1 mg/kg) sofort nach und danach alle 12 Stunden für 3 Tage.
15. Erholen Sie Mäuse auf einem Heizkissen und überwachen Sie sie, um zur normalen Aktivität zurückzukehren.
16. Postoperative Röntgenaufnahmen anfertigen, um die richtige Platzierung des Implantats zu bestätigen.

5. Longitudinale In-vivo-Biolumineszenz-Bildgebung zur Messung der Bakterienbelastung

1. Mäuse mit inhalativem Isofluran anästhesieren (2%). Bestätigen Sie eine angemessene Anästhesietiefe, indem Sie die Atmung so überwachen, dass sie rhythmisch und langsamer bleibt als im Wachzustand und sich nicht als Reaktion auf schädliche Reize (z. B. chirurgische Manipulation, Zehenkneifen) verändert.
2. Entfernen Sie die Haare vom Kreuzbein bis zur oberen Brustwirbelsäule mit einer Nagetierschere.
3. Laden Sie Mäuse in das Sichtfeld der biolumineszierenden Bildgebungsplattform, um In-vivo-Biolumineszenz-Bildgebung (BLI) ^{durchzuführen19}.
4. Erfassen Sie biolumineszierende Signale über eine Aufnahmezeit von 5 Minuten. Verwende große Binning-Einstellungen mit einem Sichtfeld von 15 cm (B).
5. Wiederholen Sie die Schritte 5.1-5.4 an den postoperativen Tagen 0, 1, 3, 5, 7, 10, 14, 18, 21, 25, 28 und 35 (oder an anderen Tagen, die auf einem bestimmten Versuchsdesign basieren), um die Bakterienlast zu überwachen.
6. Präsentieren Sie BLI-Daten über Farbskala und Überlagerung auf einem Graustufenfoto. Isolieren Sie eine standardmäßige eiförmige Region of Interest (ROI) mit BLI-Software, um BLI im Gesamtfluss (Photonen pro Sekunde) oder im mittleren maximalen Fluss (Photonen/Sekunde/Zentimeter²/Steradian) zu quantifizieren.

6. Quantifizierung von Bakterien, die an Implantaten und umgebendem Gewebe haften

1. Euthanasieren Sie Mäuse am POD 35 oder zu einem alternativen postoperativen Zeitpunkt Ihrer Wahl mit Kohlendioxid-Exposition gemäß den AVMA-Richtlinien. Euthanasie mit sekundärer Zervixluxation bestätigen.
2. Sterilisieren Sie die Rückenhaut gemäß Schritt 4.3 und positionieren Sie die Maus in Bauchlage auf einem sterilen Operationsfeld.
3. Schneiden Sie den vorherigen Schnitt mit einem chirurgischen Skalpell mit 15 Klingen scharf ein.
4. Verwenden Sie eine sterile Schere, um den Dornfortsatz L4 stumpf zu präparieren und das chirurgische Implantat zu identifizieren.
5. Verwenden Sie einen Nadeltreiber, um das Implantat vorsichtig zu drehen und aus seiner Position im Dornfortsatz L4 zu entfernen.
6. Entnehmen Sie mit einer sterilen Pinzette und Schere ca. 0,1 g Dornfortsatzknochen und Weichgewebe unmittelbar um das chirurgische Implantat herum und geben Sie 1 ml PBS in ein kleines konisches Nashornröhrchen mit 4 scharfen Homogenisierungskügelchen.
7. Erfassen Sie das Gewicht des Weichgewebes, indem Sie das konische Röhrchen vor und nach der Ernte wiegen.
8. Platzieren Sie das Implantat in 0,5 ml 0,3 % Tween-80 in TSB und beschallen Sie es 15 Minuten lang.
9. Die resultierende Implantatsuspension wird 2 min vortex und über Nacht 12-16 h kultiviert.
10. Homogenisieren Sie das Weichgewebe und die Dornfortsätze, die zuvor in 1 ml PBS um das Implantat herum platziert wurden, mit einem Homogenisator.
11. Die resultierende Weichteilsuspension wird 5 min vortex und über Nacht 12-16 h kultiviert.
12. Zählen Sie nach der Kultur über Nacht KBE aus dem Implantat bzw. aus dem umliegenden Gewebe. Geben Sie den Wert als Gesamtmenge KBE/g für Weichgewebe und KBE/ml für beschallte Implantate an.

Ergebnisse

Das hier vorgestellte Verfahren wurde verwendet, um die Wirksamkeit von Antibiotikatherapien in einem in vivo Mausmodell der SII zu bewerten. Insbesondere wurde die Wirksamkeit einer kombinierten Antibiotikatherapie mit Vancomycin und Rifampicin mit einer Vancomycin-Monotherapie und unbehandelten infizierten Kontrollen verglichen.

Vor der Operation wurden die Mäuse entweder einer Kombinationstherapie, einer Monotherapie oder einer infizierten Kontrolle zugeteilt. Eine statistische Poweranalys...

Diskussion

Implantatbedingte Infektionen in der Wirbelsäule deuten auf schlechte Ergebnisse für die Patienten hin 1,2,3,4,5. Im Gegensatz zu vielen anderen Bereichen im Körper kann infizierte Hardware in der Wirbelsäule aufgrund des Risikos von Instabilität und neurologischer Beeinträchtigung häufig nicht entfernt werden. Diese einzigartige Herausforderung im Umfe...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Analytical Balance ME104	Mettler Toledo	30029067	120 g capacity, 0.1 mg readability, backlit LCD, internal adjustment, metal base
BD Bacto Tryptic Soy Broth	Becton Dickinson (BD)	BD 211825	BD Bacto Tryptic Soy Broth (Soybean-Casein Digest Medium)
Biomate 3S UV-VIS Spectrophotometer	Thermo Scientific	840-208300	Spectrophotometer; Thermo Scientific; BioMate 3S; Six-position cell holder; Spectral bandwidth: 1.8nm; Long-life xenon lamp; Store up to 40 test methods; 16L x 13W x 9 in. H; 19 lb.; 100/240V US line cord
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