توليد المناظر الطبيعية الكيميائية الديناميكية الخاضعة للرقابة لدراسة السلوك الميكروبي

Summary

يتم تقديم بروتوكول لتوليد المناظر الطبيعية الكيميائية الديناميكية عن طريق الانحلال الضوئي داخل الاجهزة microfluidic وmillifluidic. هذه المنهجية مناسبة لدراسة العمليات البيولوجية المتنوعة ، بما في ذلك السلوك المتنوعة ، وامتصاص المغذيات ، أو التكيف مع المواد الكيميائية للكائنات الحية الدقيقة ، سواء على مستوى الخلية الواحدة أو السكان.

Abstract

نحن نُظهر طريقة لتوليد نبضات كيميائية ديناميكية خاضعة للرقابة - حيث يصبح attractant المترجم متاحًا فجأة على النطاق الصغير - لإنشاء بيئات صغيرة لتجارب chemotaxis الميكروبية. لإنشاء نبضات كيميائية ، قمنا بتطوير نظام لإدخال مصادر الأحماض الأمينية على الفور عن طريق التحليل الضوئي للأحماض الأمينية في قفص داخل غرفة microfluidic polydimethylsiloxane (PDMS) التي تحتوي على تعليق بكتيري. طبقنا هذه الطريقة على البكتيريا الكيميائية ، Vibrio ordalii، والتي يمكن أن تتسلق بنشاط هذه التدرجات الكيميائية الديناميكية في حين يتم تعقبها عن طريق المجهر الفيديو. الأحماض الأمينية، التي قدمت خاملة بيولوجيا ('caged') عن طريق التعديل الكيميائي مع مجموعة حماية قابلة للإزالة الضوئية، موجودة بشكل موحد في التعليق ولكنها غير متوفرة للاستهلاك حتى إطلاقها المفاجئ، والذي يحدث في النقاط التي يحددها المستخدم في الزمان والمكان عن طريق شعاع LED مركز بالقرب من الأشعة فوق البنفسجية A. يمكن تحديد عدد الجزيئات التي يتم إطلاقها في النبض من خلال علاقة معايرة بين وقت التعرض وكسر الكسر الغير مُقَدَّم، حيث يتميز طيف الامتصاص بعد التحليل الضوئي باستخدام التحليل الطيفي للأشعة فوق البنفسجية. يمكن دمج غشاء البولي المسامية النانوية (PCTE) في الجهاز الميكروسائلي للسماح بالإزالة المستمرة عن طريق تدفق المركبات غير المستقرة والوسائط المستهلكة. يتم تحقيق رابطة قوية لا رجعة فيها بين غشاء PCTE وبنية PDMS microfluidic عن طريق طلاء الغشاء مع محلول من 3-aminopropyltriethoxysilane (APTES) تليها تنشيط البلازما من الأسطح التي يتعين استعبادها. ويمكن للنظام الذي يتم التحكم فيه بالحاسوب أن يولد تسلسلات من النبضات يحددها المستخدم في مواقع مختلفة وبكثافة مختلفة، وذلك لخلق مناظر طبيعية للموارد ذات تغير مكاني وزمني مقرر. وفي كل مشهد كيميائي، يمكن الحصول على ديناميات الحركة البكتيرية على النطاق الفردي وتراكمها على مستوى السكان، مما يسمح بالقياس الكمي لأداء التكتيك الكيميائي وآثاره على التجمعات البكتيرية في البيئات ذات الصلة إيكولوجيا.

Introduction

تعتمد الميكروبات على chemotaxis ، وعملية الكشف عن التدرجات الكيميائية وتعديل الحركة في الاستجابة¹، للتنقل في المناظر الطبيعية الكيميائية ، والاقتراب من مصادر المغذيات والمضيفين ، والهروب من المواد الضارة. هذه العمليات على نطاق صغير تحديد الحركية على نطاق كلي من التفاعلات بين الميكروبات وبيئتها^2،3. وقد أحدثت التطورات الأخيرة في microfluidics وتقنيات microfabrication ، بما في ذلك الطباعة الحجرية لينة⁴، ثورة في قدرتنا على خلق البيئات الدقيقة التي تسيطر عليها لدراسة التفاعلات من الميكروبات. على سبيل المثال ، درست التجارب السابقة chemotaxis البكتيرية عن طريق توليد درجة عالية من التحكم ، وتدرجات مستقرة من تركيزات المغذيات المتوسطة إلى العالية^5،6. ومع ذلك ، في البيئات الطبيعية ، يمكن أن تكون التدرجات الكيميائية على نطاق صغير قصيرة الأجل - تبدد عن طريق الانتشار الجزيئي - وظروف الخلفية غالبا ما تكون مخففة للغاية^7. لقياس الاستجابة الكيميائية للمجموعات الميكروبية التي تعرضت لأول مرة لبيئات كيميائية غير مستقرة، ابتكرنا هنا ووصف طرقًا للجمع بين تقنية الموائع الدقيقة والتحلل الضوئي، وبالتالي محاكاة التدرجات التي تواجهها البكتيريا البرية في الطبيعة.

تستخدم تقنية Uncaging مسابر حساسة للضوء تغلف الجزيئات الحيوية وظيفياً في شكل غير نشط. التشعيع يطلق الجزيء في قفص، مما يسمح للاضطراب المستهدف من عملية بيولوجية^8. بسبب السيطرة السريعة والدقيقة للكيمياء الخلوية التي uncaging يوفر⁹، وقد تم تقليديا استخدام التدليل الضوئي من المركبات القفص من قبل علماء الأحياء وعلم وظائف الأعضاء وعلماء الأعصاب لدراسة تفعيل الجينات¹⁰، قنوات أيون¹¹، والخلايا العصبية¹². في الآونة الأخيرة ، استفاد العلماء من المزايا الهامة للانطال الضوئي لدراسة chemotaxis¹³، لتحديد ديناميات تبديل flagella من الخلايا البكتيرية الفردية المعرضة لتحفيز chemoattractant خطوة خطوة^14،15، والتحقيق في أنماط الحركة من الخلايا المنوية واحدة في ثلاثي الأبعاد (3D) التدرجات¹⁶.

في نهجنا ، نقوم بتنفيذ التحليل الضوئي للأحماض الأمينية في قفص داخل الأجهزة microfluidic لدراسة الاستجابة السلوكية للسكان البكتيرية للنبضات الكيميائية التي تسيطر عليها ، والتي تصبح متاحة على الفور تقريبا من خلال الإفراج عن الصور. استخدام هدف التكبير المنخفض (4x) (NA = 0.13، عمق التركيز حوالي 40 ميكرومتر) يسمح لكل من مراقبة الاستجابة التجميعية على مستوى السكان لآلاف البكتيريا على مجال رؤية كبير (3.2 مم × 3.2 مم)، وقياس الحركة على مستوى الخلية الواحدة. نقدم تطبيقين لهذه الطريقة: 1) إطلاق نبضة كيميائية واحدة لدراسة ديناميات التراكم البكتيري-تبديد بدءاً من ظروف موحدة، و2)إطلاق نبضات متعددة لتوصيف ديناميات التراكم البكتيري في ظل ظروف جذب كيميائي متفاوتة زمنياً وغير متجانسة مكانياً. وقد تم اختبار هذه الطريقة على البكتيريا البحرية Vibrio ordalii أداء chemotaxis نحو الغلوتامات الأحماض الأمينية¹⁷، ولكن هذه الطريقة قابلة للتطبيق على نطاق واسع على مجموعات مختلفة من الأنواع وchemoattractants ، وكذلك على العمليات البيولوجية وراء chemotaxis (على سبيل المثال ، امتصاص المواد الغذائية ، والتعرض للمضادات الحيوية ، واستشعار النصاب القانوني). يعد هذا النهج بالمساعدة في توضيح إيكولوجيا وسلوك الكائنات الحية الدقيقة في بيئات واقعية والكشف عن المفاضلات الخفية التي تواجهها البكتيريا الفردية عند التنقل في التدرجات الديناميكية الزائلة.

Protocol

1. تصنيع جهاز Microfluidic لتجربة النبض الكيميائي واحد

1. تصميم القناة باستخدام برامج التصميم بمساعدة الكمبيوتر (CAD) وطباعتها على فيلم شفافية لإنشاء قناع الصورة(الشكل 1A).
2. قم بتلفيق المعلم عن طريق الطباعة الحجرية الناعمة (في ظل ظروف غرفة نظيفة).
   1. تنظيف رقاقة السيليكون (4 بوصة) في تعاقب سريع مع الأسيتون والميثانول والأيزوبروبانول، ثم تجف باستخدام النيتروجين. خبز رقاقة في الفرن على 130 درجة مئوية لمدة 5 دقيقة.
   2. ضع الرقاقة في مركز مغطي الدوران واسكب SU-8 مقاوم للضوء على الرقاقة. منحدر سرعة الدوران معطف تصل إلى 500 دورة في الدقيقة أكثر من 5 s، والحفاظ على 500 دورة في الدقيقة لمدة 10 s. منحدر تصل إلى السرعة النهائية أكثر من 10 s والحفاظ على هذه السرعة لمدة 30 s.
      ملاحظة: تعتمد القيمة الدقيقة للسرعة النهائية على سمك الطلاء المستهدف وSU-8 المستخدم.
   3. بعد عملية طلاء الدوران، اخبز الرقاقة عند 65 درجة مئوية ثم عند درجة حرارة 95 درجة مئوية. اتركه يبرد في درجة حرارة الغرفة (RT) لمدة 5 دقيقة على الأقل.
      ملاحظة: يعتمد وقت الخبز على السماكة المستهدفة ونوع مقاومة للضوء المستخدمة. وكقاعدة عامة، لكل طبقة 100 ميكرومتر يجب خبز الرقاقة لمدة 5 دقيقة عند 65 درجة مئوية و 45 دقيقة عند 95 درجة مئوية.
   4. ضع قناع الصورة على الرقاقة لضمان تعرض المنطقة ذات الاهتمام فقط وبلمرة. تعرض للضوء فوق البنفسجي للمرة الموصى بها في دليل SU-8.
      ملاحظة: هنا، مع طاقة التعرض من 200 mJ سم^-2 في الطول الموجي من 350 نانومتر، وتعرض رقاقة لمدة 150 s.
   5. خبز رقاقة في 65 درجة مئوية و 95 درجة مئوية للوقت الموصى به في دليل SU-8.
      ملاحظة: كقاعدة عامة، لكل طبقة 100 ميكرومتر يجب خبز الرقاقة لمدة 5 دقيقة عند 65 درجة مئوية و45 دقيقة عند 95 درجة مئوية.
   6. تزج رقاقة في كوب مليئة بولي ميثيل ميثاكريلات (PMMA) المطور من أجل الحصول على سيد. يهز بلطف الكأس لضمان أن يتم غسلها مقاومة ضوئيا غير بوليمر. خبز سيد في 200 درجة مئوية لمزيد من عبر ربط طبقة SU-8.
3. إعداد خليط البوليديميثيلسيلوكسان (PDMS) عن طريق الجمع بين الإيلاتومي مع وكيل المعالجة(جدول المواد)بنسبة 10:1 في كوب (هنا، 40 مل). تخلط بقوة حتى السائل متجانسة.
   ملاحظة: سيبدو خليط PDMS معتمًا لأنه يتم إنشاء الفقاعات أثناء عملية الخلط.
   تنبيه: من أجل منع ملامسة الجلد للمواد الكيميائية أو البيولوجية التي يحتمل أن تكون خطرة، ارتدي دائمًا معطفالمختبر وقفازات بلاستيكية يمكن التخلص منها طوال البروتوكول واتبع أي بروتوكولات أمان محددة وفقًا للمادة ورقة بيانات السلامة (MSDS).
4. Degas خليط PDMS في غرفة فراغ لمدة 45 دقيقة في RT. لتسريع العملية ، والإفراج عن فراغ بشكل دوري من أجل انفجار الفقاعات التي تشكل في واجهة.
   ملاحظة: يجب إجراء عملية إزالة الغازات في غضون ساعة واحدة لمنع خليط PDMS من البدء في العلاج.
5. إزالة الغبار من سطح سيد مع منظف مضغوط، ثم صب خليط PDMS degassed على سيد وخبز في فرن في 80 درجة مئوية لمدة 2 ساعة.
   ملاحظة: بدلاً من ذلك، الخبز بين عشية وضحاها (أو لمدة 12 ساعة على الأقل) في 60 درجة مئوية من شأنه أن يحقق نفس PDMS تصلب.
6. قطع PDMS مع شفرة حول الهياكل الدقيقة (على مسافة 5 ملم تقريبا) ومن ثم قشر بعناية PDMS من سيد.
7. ثقوب لكمة لتكون بمثابة منفذ ومنفذ للmicrochannel (هنا، واحد ومنفذ واحد، انظر الشكل 1A). تأكد من عدم لمس أي شيء للوجه السفلي لـ PDMS حيث توجد الميزات.
   ملاحظة: يمكن إيقاف البروتوكول مؤقتاً هنا. يجب أن تكون القناة الدقيقة مختومة بشريط لاصق لمنع تراكم الغبار والجسيمات الأخرى أثناء التخزين.
8. قم باربط قناة PDMS الصغيرة بشريحة زجاجية.
   1. تنظيف تماما شريحة زجاجية مع الصابون والأيزوبروبانول والماء deionized. دع الشريحة الزجاجية تجف أو استخدم الهواء المضغوط لتسريع العملية.
   2. إزالة جزيئات الغبار عن طريق الدابل مع شريط لاصق. السندات microchannel PDMS على الشريحة الزجاجية النظيفة، مباشرة بعد علاج كلا السطحين مع البلازما (باستخدام نظام الهالة أو غرفة الأكسجين البلازما) لمدة 2 دقيقة.
   3. ضع جهاز microfluidic لتسخين على لوحة ساخنة عند 80 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة على الأقل لتقوية السندات الكيميائية مع الزجاج.

2. تصنيع جهاز ميليووسيك المطبوعة ثلاثية الأبعاد لتجربة نبضات متعددة

1. تصميم شكل 3D باستخدام برنامج التصميم 3D وطباعة ماجستير لقالب PDMS مع طابعة ثلاثية الأبعاد عالية الدقة(الشكل 1B).
   ملاحظة: راجع جدول المواد للطابعة ثلاثية الأبعاد ومواد العفن المستخدمة لإنشاء الرئيسي.
2. كرر الخطوات 1.3−1.4، ثم قم بتنظيف سطح المعلم عن طريق التداعب بشريط لاصق. وضع سيد على مقياس، ثم، مع تجنب المنطقة الوسطى من سيد التي سيتم شغلها من قبل الغشاء، صب على الكمية الدقيقة من خليط PDMS غير المعالجة (هنا، 23.4 غرام) من أجل الحصول على الارتفاع المطلوب من PDMS عن طريق مطابقة ارتفاع سيد (هنا، 0.5 ملم). إزالة أي فقاعات المتبقية مع مساعدة من الهواء المضغوط.
3. وضع PDMS يلقي على سيد في فرن في 45 درجة مئوية لخبز لمدة 12 ساعة على الأقل.
4. السندات قالب PDMS 3D إلى طبق بيتري.
   1. قشر بلطف قبالة طبقة PDMS تصلب وثقب فتحة ومنفذ ثقوب لحقن التعليق البكتيري(الشكل 1C).
   2. تنشيط كل من سطح طبق بيتري (90 ملم × 15 ملم) والعفن PDMS مع بلازما الأكسجين لمدة 2 دقيقة. السندات قالب PDMS على طبق بيتري. اضغط بلطف القالب إلى طبق بيتري، ولكن لا تضغط حيث توجد الميزات لأن هذا يمكن أن ينهار غرفة الاستجواب.
   3. ضع طبق بيتري المستعبدين إلى قالب PDMS 3D في فرن عند 45 درجة مئوية لمدة 12 ساعة على الأقل لتعزيز السندات الكيميائية.
      ملاحظة: يمكن إيقاف البروتوكول مؤقتاً هنا.
5. وظيفة سطح الغشاء¹⁸
   1. تنشيط غشاء البولي (PCTE) المسامية النانوية في غرفة بلازما الأكسجين لمدة 1 دقيقة في RT.
      تنبيه: تجنب استخدام نظام الهالة لتنشيط البلازما لأنه سيضر الغشاء.
   2. تحت غطاء محرك السيارة الكيميائية، تمييع محلول تجاري من 3-aminopropyltriethoxysilane (APTES) في المياه المؤينة إلى 1٪ من حيث الحجم (هنا، 40 مل)، وذلك باستخدام أنبوب البولي بروبلين.
      تنبيه: إن محلول APTES سام بشكل حاد (درجة المخاطر الصحية MSDS 3) ويجب التعامل معه بعناية فائقة حصريًا تحت غطاء كيميائي مع قفازات. تغيير القفازات مباشرة بعد التعامل مع حل APTES. أبخرة APTES مدمرة للأغشية المخاطية والجهاز التنفسي العلوي. الأجهزة المستهدفة من APTES هي الأعصاب والكبد والكلى. إذا كان غطاء الدخان غير متوفر، يجب تنفيذ درع الوجه والتنفس كامل الوجه.
   3. نقل حل APTES المخفف في طبق بيتري وتزج الغشاء المنشط في حل APTES لمدة 20 دقيقة.
   4. إزالة الغشاء من حل APTES مع ملاقط ووضعه على مسح غرفة نظيفة لتجف.
6. لتصنيع قنوات PDMS microfluidic التي سوف تقع على الغشاء والسماح بغسل الساحة البكتيرية، كرر الخطوات 1.1−1.7.
7. السندات قنوات غسل PDMS إلى الغشاء وظيفية.
   1. تنشيط كل من قناة غسل PDMS وغشاء PCTE مع غرفة بلازما الأكسجين لمدة 2 دقيقة.
      ملاحظة: يجب أن يكون الغشاء، الذي سيتم وضعبين طبقتين PDMS، أصغر من قناة غسيل PDMS.
   2. مباشرة بعد علاج البلازما، وجلب الغشاء الوظيفي وقناة الغسيل PDMS في اتصال عن طريق الضغط بلطف على قناة غسل PDMS على الغشاء.
      ملاحظة: لا تمارس ضغطًا مفرطًا في هذه المرحلة، لأنه قد يتسبب في إلحاق الغشاء (الذي لا رجعة فيه) بسقف القناة، مما يؤدي إلى سد القناة.
8. ساندويتش الغشاء بين طبقتين PDMS(الشكل 1E).
   1. قم بتنشيط كل من قناة غسيل PDMS المعصفة - غشاء PCTE والعفن PDMS ثلاثي الأبعاد الذي تم استعباده سابقًا بطبق Petri مع غرفة بلازما أكسجين لمدة دقيقتين.
   2. ضع طبق بيتري المستعبدين إلى هيكل شطيرة في فرن في 45 درجة مئوية لمدة 12 ساعة على الأقل لتعزيز السندات الكيميائية.
      ملاحظة: يمكن إيقاف البروتوكول مؤقتاً هنا.

3- ثقافة الخلايا

1. تنمو مجموعة من V. ordalii (سلالة 12B09 أو 12B09pGFP) بين عشية وضحاها لمدة 20 ساعة في 2216 المتوسطة¹⁹ على شاكر المداري (600 دورة في الدقيقة) في 30 درجة مئوية وخلايا الحصاد في مرحلة أواخر الأسي. لعزل pGFP، إضافة spectinomycin (50 ميكروغرام مل^-1)للحفاظ على البلازميد.
2. الطرد المركزي 1 مل aliquot من الخلايا في 2500 × ز لمدة 3 دقيقة، وإزالة supernatant وإعادة تعليق الخلايا في 1 مل من مياه البحر الاصطناعية المصفاة. كرر هذه الخطوة.
3. تجويع سكان V. ordalii على شاكر المداري (600 دورة في الدقيقة) في 30 درجة مئوية لمدة 3 ساعة.
4. إعداد محلول مياه البحر الاصطناعي للمخزون من 10 مM (هنا، 1 مل) من 4-ميثوكسي-7-نيترويندولينيل-قفص-L-الغلوتامات (MNI-caged-L-الغلوتامات) وتخزينها في -20 درجة مئوية.
   ملاحظة: حماية الحل MNI-قفص-L-الغلوتامات من الضوء المحيط لمنع تليسح ضوئي.
5. تمييع الخلايا 50x عن طريق إعادة تعليق الخلايا الجائعة في محلولمياه البحر الاصطناعي من 1 MNI-قفص- L-الغلوتامات.
   ملاحظة: هذا سيضمن تركيز بكتيري نهائي أقل من 5 × 10⁷ مل^-1 (تعتمد القيمة الدقيقة على التركيز الأولي للخلايا في أواخر الأسي ، والذي عادة ما يكون ~ 10⁹ مل^-1). وقُدِّر التركيز البكتيري باستخدام مقياس الطيف الضوئي عند الكثافة البصرية (OD) التي بلغت 600 نانومتر.

4 - معايرة بروتوكول التّهجية

1. ضع قطرة (20 ميكرولتر) من محلول مياه البحر الاصطناعي من MNI-caged-L-الغلوتامات²⁰ بتركيز C₀ = 10 mM على شريحة زجاجية. قم بتغليف القطرات بتغطيتها بغرفة PDMS دائرية (قطرها d = 5 مم ، ارتفاع h = 250 ميكرومتر).
2. ضع الشريحة الزجاجية على مرحلة المجهر واعرض الغرفة بأكملها لمدة 20 مللي ثانية لشعاع LED عند طول موجي 395 نانومتر (قوة 295 مليواط) باستخدام هدف 4x (الفتحة العددية [NA] = 0.13).
3. افتح غرفة PDMS واستخرج قطرة (1 ميكرولتر) للتحليل باستخدام مقياس الطيف الضوئي للأشعة فوق البنفسجية.
4. كرر الخطوات 4.1−4.3 لفترات مختلفة من إضاءة LED من 0.1 s و 0.5 s و 2.5 s و 25 s و 250 s (أو حتى تشبع التفاعل الكيميائي) و 0 s (للحصول على الخلفية). نسخ الخطوات الإجراء 4.1−4.4 على الأقل 3x (هنا، 4x).
5. من طيف الامتصاص ، استخرج القيمة عند 405 نانومتر ، والتي تمثل الذروة في طيف امتصاص جزيء القفص^21. لتحديد معدل k من التفاعل الكيميائي uncaging من قبل التعرض LED¹⁴، استخدم معادلة الحركية من الدرجة الأولى التالية للاحتواء العددي للبيانات التجريبية¹⁷
   
   حيث C(t)هو قيمة الطيف امتصاص الحل في 405 نانومتر (بعد إزالة الخلفية) مع وقت uncaging من t ثانية. لصغيرة uncaging الوقت ر مثل ذلك KT 1، Eq. 1 يمكن تبسيطها إلى صياغة خطية
   

5. تجربة نبض كيميائي واحد

1. الحفاظ على قناة microfluidic تحت فراغ لمدة 20 دقيقة للحد من تركيز الغاز داخل PDMS بحيث فقاعات أقل عرضة لتشكيل أثناء عملية التعبئة.
2. استخراج القناة من مضخة فراغ وإدخال فورا تعليق البكتيريا المخفف في 1MNI MNI-قفص-L-الغلوتامات في مياه البحر الاصطناعية في microchannel بلطف باستخدام micropipette لتجنب الضرر flagellar بواسطة قوات القص الميكانيكية (هنا، استغرق عملية ملء كامل 5-10 ق). بعد ملء القناة مع تعليق البكتيرية، تمتص الحل الزائد مع منشفة ورقية، وختم فتحة ومنفذ مع المقابس PDMS عن طريق الضغط عليها بلطف في الثقوب.
   ملاحظة: بهذه الطريقة، يتم منع تدفق السوائل في الغرفة.
3. ضع القناة الصغرى على مرحلة المجهر وحرك المسرح لتعيين مجال الرؤية في منتصف القناة. قم بإعداد المجهر لإجراء التصوير على تباين المرحلة (هدف 4x) بمعدل إطار 12 إطارًا في الثانية.
   ملاحظة: يمكن أن تختلف هذه القيمة ولكن لا ينبغي أن تكون أقل من 10 إطارا في الثانية للسماح بإعادة بناء المسارات البكتيرية من خلال تحليل الصور (انظر البروتوكول القسم 7).
4. تعيين الثقب من شعاع LED في فتحة الحد الأدنى. من خلال تعيين وقت التعرض للكاميرا إلى 5 s، سجل عدد قليل من الإطارات للحصول على قياسات دقيقة للموقع المكاني وحجم شعاع LED.
   ملاحظة: يتصل مصدر ضوء LED بمضيئة المجهر عبر اتصال دليل الضوء السائل. لا يؤثر شعاع LED على التقاط الفيديو ، لأن الحصول على الفيديو وتحفيز LED يتم أمرهما بشكل مستقل عبر البرامج.
5. إجراء التصوير المستمر لمدة إجمالية قدرها 10 دقيقة (20 دقيقة لأكبر نبض ة كيميائية)، وفي وقت واحد تنشيط شعاع LED المركز عند 395 نانومتر للفترة المطلوبة (في هذه التجربة، t = 20 مللي ثانية، 100 مللي ثانية، 500 مللي ثانية) في نقطة زمنية محددة من قبل المستخدم (هنا، 10 ثانية بعد بدء اقتناء الفيديو) عبر برنامج المجهر. للحصول على نسخ متعددة من نفس العملية ، حرك المرحلة لتسجيل الاستجابة البكتيرية على مواقع مختلفة من القناة microfluidic. تكرار هذا الإجراء لكل حجم نبضة باستخدام قناة صغيرة جديدة.
   ملاحظة: تولد عملية uncaging نبضأسطواني محوري ينشر الراديإلى الخارج في مستوى التصوير.
6. إجراء تجارب منفصلة دون uncaging الكيميائية في التكبير أعلى (20x الهدف، NA = 0.45) بمعدل إطار أعلى (50 إطارا في الثانية) لتسجيل حركة السباحة غير منحازة من البكتيريا.

6. تجربة متعددة النبض الكيميائي

1. الحفاظ على غرفة مالية تحت فراغ لمدة 20 دقيقة.
2. ضع طبق بيتري الذي يحتوي على غرفة المائع ة على خشبة المجهر. ملء الغرفة تحت الغشاء مع تعليق البكتيريا المخفف (هنا، استغرق عملية التعبئة بأكملها 10-15 ق) من GFP-الفلورسنت V. ordalii في 1 MM MNI-caged-L-الغلوتامات في مياه البحر الاصطناعية. بعد ملء القناة مع تعليق البكتيرية، تمتص الحل الزائد مع منشفة ورقية، وختم فتحة ومنفذ مع المقابس PDMS عن طريق الضغط عليها بلطف في الثقوب.
   ملاحظة: بهذه الطريقة، يتم منع تدفق السوائل في الغرفة. للسماح بتصور أفضل للبكتيريا في هذا الإعداد حيث يحدث التصوير من خلال الغشاء النانوي ، يوصى بشدة باستخدام سلالات الفلورسنت بدلاً من النوع البري (كما هو مستخدم في تجربة النبض الكيميائي الواحد).
3. ملء حقنة مع محلول مياه البحر الاصطناعية من 1MNI MNI-caged-L-الغلوتامات وإرفاق أنابيب إلى منفذ ومنفذ قناة الغسيل فوق الغشاء.
4. قم بتوصيل الأنابيب بخزان النفايات وتأكد من أن الأنابيب مغمورة بالكامل في خزان نفايات السوائل لتجنب تذبذبات الضغط.
5. تعيين معدل التدفق المناسب على مضخة الحقنة (هنا، 50 ميكرولتر دقيقة^-1)للحصول على متوسط معدل التدفق المطلوب في قناة الغسيل، والذي يعتمد على هندسة القناة.
6. بدء مضخة حقنة لإنشاء تدفق في قناة الغسيل فوق الغشاء.
7. تشغيل البرنامج الذي يتحكم في شعاع LED ومرحلة المجهر لتوليد تسلسل محدد من قبل المستخدم من النبضات في مواقع مختلفة وبكثافة مختلفة.
   ملاحظة: التدفق المستمر لمحلول مياه البحر الاصطناعية من 1MM MNI-caged-L-الغلوتامات في قناة الغسيل فوق الغشاء يجدد الحل المركب في قفص ويغسل المتوسط المستهلك من الساحة البكتيرية.
8. تسجيل الفيديو باستخدام هدف 4x على فترات زمنية منتظمة على مدى عدة ساعات وعلى مواقع متجاورة متعددة لتغطية سطح كبير (هنا، 1 سم × 1 سم، الشكل 1F).

7- تحليل الصور وتحليل البيانات

1. إعادة بناء المسارات البكتيرية
   1. من الأفلام المسجلة مع الهدف 4x، إعادة بناء المسارات البكتيرية باستخدام تتبع البرمجيات¹⁷.
      ملاحظة: تمثل هذه المسارات الإسقاطات 2D للحركة البكتيرية ثلاثية الأبعاد في القناة الدقيقة.
   2. من المسارات البكتيرية التي أعيد بناؤها ، حدد سرعة الانجراف الشعاعي لكل فرد سباحة من خلال إسقاط سرعة السباحة فوق الاتجاه نحو مركز النبض الكيميائي(الشكل 2D). لتصور الديناميات المكانية الزمانية لسرعة الانجراف الشعاعي، استخدم شبكة binning ذات الحجم المكاني 75 ميكرومتر × 75 ميكرومتر ونافذة زمنية من 5−10 s الفاصل الزمني(الشكل 2D،E).
      ملاحظة: بسبب التماثل الأسطواني للعملية، يمكن تحليل البيانات في إحداثيات قطبية ومتوسطها على البعد الزاوي(الشكل 3).
   3. من المسارات البكتيرية التي أعيد بناؤها ، وتحديد ديناميات المكانية والصدغية لتوزيع البكتيريا لأنها تستجيب للنبضات الكيميائية(الشكل 2هاء).
   4. من الأفلام عالية الدقة المسجلة مع هدف 20x خلال تجارب النبض الواحد ، استخراج توزيع سرعة السباحة ووقت التشغيل للسكان البكتيريين لأنها تستجيب للنبض الكيميائي(الشكل 4).
2. تقدير معامل انتشار البكتيريا من خلال النظر في ديناميات تبديد السكان البكتيرية بعد الانتهاء من chemotaxis¹⁷ (هنا ، لt > 300 s ؛ الشكل 3).
3. تقدير معامل انتشار الغلوتامات بتطبيق معادلة ستوكس-آينشتاين
   
   حيث يفترض أن جزيئات الأحماض الأمينية هي جزيئات كروية ذات نصف قطر هيدروديناميكي²²r_G، k_B هو ثابت بولتزمان (1.38 × 10 -²³ م² كجم s^-2 K^-1)، T هي درجة الحرارة (296 K) ، وهي اللزوجة الديناميكية لمياه البحر الاصطناعية (الملوحة 36^g-1)عند 23 درجة مئوية (10-3 باسكال ق)²³

النتائج

استخدمنا أجهزة الموائع الدقيقة والسائلة(الشكل 1)لدراسة ملامح التراكم البكتيري في ظل ظروف المغذيات الديناميكية. تم استخراج المسارات البكتيرية من مقاطع الفيديو المسجلة التي تم الحصول عليها بواسطة المجهر على تباين المرحلة لديناميكيات تبديد التراكم للسكان البكتيريين بعد ن?...

Discussion

تسمح هذه الطريقة للباحثين بدراسة الضريبة الكيميائية البكتيرية تحت التدرجات الديناميكية الخاضعة للرقابة في الأجهزة الدقيقة والسائلة، مما يتيح الحصول على بيانات قابلة للتكرار. يهدف الإنشاء شبه الفوري للنبضات الكيميائية على المقياس الدقيق عن طريق التحليل الضوئي إلى إعادة إنتاج أنواع الب...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
(3-Aminopropyl) triethoxysilane (APTES)	Sigma-Aldrich	A3648	>98% purity, highly toxic
CELLSTAR tube	Greiner Bio-One	210261	50 ml
Centrifuge	Eppendorf	5424R	to eliminate spent media from the bacterial culture
Digital Incubators Incu-Line	VWR-CH	390-0384	to bake 3D master
Duster	VWR-CH	16650-22	to clean the wafer and microchannels
Hot plate	VWR-CH	444-0601	to bond the microchannels
Isopropanol	Sigma-Aldrich	W292907
LightSafe micro centrifuge tubes	Sigma-Aldrich	Z688312	1.5 ml
MATLAB	Mathworks		for image analysis and bacterial tracking
Microcentrifuge tube	Eppendorf	30120086	1.5 ml
Microscope glass slide	VWR-CH	631-1552
Microscope Nikon Eclipse TiE	Nikon Instruments	MEA53100	with motorized stage
MNI-Glutamate	Tocris Bioscience	1490	>98 % purity, photosensitive
Mold printing equipment	Stratasys		Objet30 3D printer
Mold printing service	3D Printing Studios	Custom	https://www.3dprintingstudios.com/
Nanodrop One UV-Vis Spectrophotometer	Thermo Fisher Scientific	ND-ONE-W	to calibrate the uncaging
NIS Elements	Nikon Instruments		Microscope Imaging Software
Oven Venti-Line	VWR-CH	466-3516	to bake PDMS (with forced convection)
Photoresist SU-8-3050	MicroChem Corp.	SU8-3050
Plasma chamber Zepto	Diener Electronic	ZEPTO-1	to functionalize the surfaces before bonding
Polycarbonate membrane	Sterlitech	PCT0447100	0.4 µm pore size, 19 % open area, 24 µm thickness
Polyethylene microtubing	Scientific Commodities	BB31695-PE/2	I.D. x O.D.: 0.015" x 0.043" / 0.38mm x 1.09mm
Polystyrene Petri dish	VWR-CH	25373-100	bottom surface (90 mm x 15 mm) to bond the millifluidic device
Scale	VWR-CH	611-2605	to weight PDMS mixture
sCMOS camera Andor Zyla	Oxford Instruments		for phase contrast and fluorescence microscopy (max 100 fps)
Sea salt	Instant Ocean	Product No. SS1-160p
SolidWorks 2015	Dassault Systemes SolidWorks		Used to design the mold
Spectra X light engine	Lumencolor		for LED 395 nm
Sylgard 184	Dow Corning	110-41-155	PDMS Si Elastomer Kit; curing agent
Syringe (Luer-Lok)	B Braun Omnifix	4616308F
Syringe Needle	Agani	A228	from 10 to 30 ml
Syringe Pump 11 Pico Plus Elite	Harvard Apparatus	70-4506	Terumo Agani 23 gauge 5/8 inch (16mm)
VeroGrey	Stratasys		Dual Syringe Pump
Vortex-Genie	Scientific Industries	SI-0236	Mold Material