JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

פרוטוקול לדור של נופים כימיים דינמיים על ידי פוטוליזה בתוך microfluidic והגדרות מיליפלואידיג מוצג. מתודולוגיה זו מתאימה לחקר תהליכים ביולוגיים מגוונים, כולל התנהגות נעים, ספיגת מזינים, או הסתגלות לכימיקלים של מיקרואורגניזמים, הן בתא יחיד ברמת האוכלוסייה.

Abstract

אנו מדגימים שיטה עבור הדור של מבוקרת, פולסים כימיים דינאמיים-שם כימוסטנט מקומי הופך לפתע זמין במיקרוסקאלה – כדי ליצור מיקרו סביבות עבור ניסויים כימוקיים חיידקים. כדי ליצור פולסים כימיים, פיתחנו מערכת להחדיר מקורות חומצות אמינו בסמוך-מיידי על ידי פוטוליזה של חומצות אמינו בכלוב בתוך polydiמתיל siloxane (pdms) תא מיקרופלואידיג המכיל השעיה בקטריאלי. החלתי שיטה זו לחיידק כימוטקטקטיקה, Vibrio ordalii, אשר יכול באופן פעיל לטפס על מעברי הצבע הכימיים הדינאמיים האלה בעת במעקב על ידי וידאו מיקרוסקופ. חומצות אמינו, מעובד ביולוגית (' כלוב ') על ידי שינוי כימי עם הקבוצה הגנה photoremovable, הם באופן אחיד בהשעיה אך לא זמין עבור הצריכה עד שחרורו הפתאומי שלהם, אשר מתרחשת בנקודות מוגדרות על-ידי המשתמש בזמן ובמרחב באמצעות קרן LED ממוקדת כמעט-UV. מספר המולקולות שפורסמו בדופק יכול להיקבע על ידי קשר כיול בין זמן חשיפה ושבריר הזדקנות, שם ספקטרום הקליטה לאחר פוטוליזה מאופיין באמצעות ספקטרוסקופיה UV-Vis. פוליקרבונט nanפורטו (PCTE) קרום יכול להיות משולב לתוך המכשיר microflu, כדי לאפשר את ההסרה רציפה על ידי זרימה של תרכובות בכלוב ללא כלוב ואת התקשורת המושקע. הקשר חזק, בלתי הפיך בין קרום PCTE לבין מבנה מיקרופלואידיג PDMS מושגת על ידי ציפוי הקרום עם פתרון של 3-aminopropyltriethoxysilane (APTES) ואחריו הפעלה פלזמה של משטחים להיות מאוחדים. מערכת הנשלטת על-ידי מחשב יכולה ליצור רצפים מוגדרים על-ידי המשתמש במיקומים שונים ובעוצמות שונות, כדי ליצור נופי משאבים עם השתנות מרחבית ושינויים בזמן הזמני. בכל נוף כימי, הדינמיקה של התנועה החיידקית בקנה המידה הפרטני וההצטברות שלהם ברמת האוכלוסייה ניתן להשיג, ובכך לאפשר את הקוונפיקציה של ביצועי השיטה ואת השפעותיו על הצטברות חיידקים בסביבות רלוונטיות אקולוגית.

Introduction

חיידקים להסתמך על כימוטווניות, התהליך של זיהוי הדרגתיים כימיים ושינוי תנועתיות בתגובה1, כדי לנווט נופים כימיים, גישה מקורות מזינים ומארחים, ולברוח חומרים רעילים. תהליכי מיקרוסקאלה אלה קובעים את הקינטיקה המקרו-שלמה של אינטראקציות בין חיידקים לסביבתם2,3. ההתפתחויות האחרונות במיקרופלואידיקה וטכנולוגיות מיקרוייצור, כולל ליתוגרפיה רכה4, יש מהפכה היכולת שלנו ליצור מיקרו סביבות מבוקרת שבו ללמוד את האינטראקציות של חיידקים. לדוגמה, ניסויים בעבר למדו כימוטקיית בקטריאלי על ידי יצירת בשליטה גבוהה, מעברי צבע יציבים של ביניים ריכוז מזינים גבוה5,6. עם זאת, בסביבות טבעיות, מעברי צבע כימיים מיקרוסולם יכול להיות קצר חיים-התפוגג על ידי דיפוזיה מולקולרית-ואת תנאי הרקע הם לעיתים קרובות מדלל מאוד7. כדי למדוד באופן ישיר את תגובת כימוטקטקטיקה של אוכלוסיות חיידקים נחשף תחילה לסביבות כימיות בלתי יציבות, המציאו וכאן לתאר שיטות כדי לשלב טכנולוגיה microflu, עם photolysis, ובכך לחקות מעברי צבע כי חיידקים פראי המפגש בטבע.

טכנולוגיית הזדקנות מעסיקה בדיקה רגישה באור אשר מכמס פונקציונלית biomolecules בצורה לא פעילה. הקרנה משחררת את המולקולה הכלובית ומאפשרת את המיקוד המכוון של תהליך ביולוגי8. בשל השליטה המהירה והמדויקת של הכימיה התאית שההזדקנות מעניקה לה9, פוטוליזה של תרכובות בכלוב הועסק באופן מסורתי על ידי ביולוגים, פיזיקולוגים ומדענים נוירולוגים לחקור את הפעלת גנים10, יון ערוצים11, ונוירונים12. לאחרונה, מדענים יש מינוף את היתרונות המשמעותיים של פוטוליזה ללמוד כימותוניות13, כדי לקבוע את הדינמיקה החלפת הדגלים של תאים חיידקיים בודדים נחשף לגירוי ממושך של כימוסטנט14,15, ולחקור דפוסי תנועתיות של תאים זרע אחד בתלת מימדי (3d) מעברי צבע16.

בגישה שלנו, אנו מיישמים פוטוליזה של חומצות אמינו בכלוב בתוך התקנים microflu, כדי ללמוד את התגובה ההתנהגותית של אוכלוסיה חיידקית לפולסים כימיים מבוקרים, אשר הופכים כמעט מיידי זמין באמצעות photorהפצה. השימוש של מטרה בהגדלה נמוכה (4x) (NA = 0.13, עומק של מיקוד כ 40 μm) מאפשר הן את ההתבוננות של התגובה ברמת האוכלוסייה של אלפי חיידקים מעל שדה גדול של נוף (3.2 mm x 3.2 מ"מ), ואת מדידת התנועה ברמה של תא בודד. אנו מציגים שני יישומים של שיטה זו: 1) שחרורו של פעימה כימית אחת כדי ללמוד הצטברות חיידקי לפיזור הדינמיקה החל בתנאים אחיד, ו 2אני) שחרורו של פולסים מרובים כדי לאפיין את הדינמיקה הצטברות חיידקים תחת זמן שונים, הטרוגנית הטרוגניות התנאים כימוסטנט. שיטה זו נבדקה על החיידקים הימיים Vibrio כימוא ביצוע מוניות לכיוון גלוטמט חומצות אמינו17, אבל השיטה היא ישימה באופן כללי על שילובים שונים של מינים וכימורים, כמו גם תהליכים ביולוגיים מעבר כימוקווניות (למשל, ספיגת מזינים, חשיפה לאנטיביוטיקה, מקווחישה). גישה זו מבטיחה לעזור להבהיר את האקולוגיה ואת ההתנהגות של מיקרואורגניזמים בסביבות ריאליסטי ולחשוף את הסחר הנסתר כי חיידקים בודדים הפנים בעת ניווט מעברי צבע דינמי ארעי.

Protocol

1. ייצור מכשיר מיקרופלואידיג לניסוי הפולס הכימי היחיד

  1. עצב את הערוץ באמצעות תוכנת עיצוב בעזרת מחשב (CAD) והדפס אותו על סרט שקיפות כדי ליצור את מסיכת הצילום (איור 1א).
  2. הרכיבו את המאסטר באמצעות ליתוגרפיה רכה (תחת תנאי החדר הנקי).
    1. נקו וופל סיליקון (4 אינץ ') ברצף מהיר עם אצטון, מתנול ו איזופנול, ואז יבש באמצעות חנקן. אופים את הפרוסת וופל בתנור ב-130 ° c עבור 5 דקות.
    2. מניחים את הפרוסת וופל במרכז של ספין-coater ויוצקים SU-8 photoresist על הפרוסת. השיפוע את המהירות של ספין-coater עד 500 סל ד על 5 s, ולשמור ב 500 rpm עבור 10 s. כבש עד המהירות הסופית מעל 10 s ולתחזק במהירות זו עבור 30 s.
      הערה: הערך המדויק של המהירות הסופית תלוי בעובי הציפוי הייעודי ובשימוש ב-SU-8.
    3. לאחר תהליך ציפוי הסחרור אופים את הפרוסת וופל ב-65 ° c ולאחר מכן ב-95 ° c. תנו לרקיק להתקרר בטמפרטורת החדר (RT) למשך 5 דקות לפחות.
      הערה: זמן האפייה תלוי בעובי היעד ובסוג הphotoresist שבשימוש. ככלל, עבור כל שכבה 100 יקרומטר הופל צריך להיות אפוי 5 דקות ב 65 ° צ' ו 45 דקות ב 95 ° c.
    4. הניחו את מסיכת התמונה על הפרוסת והקפידו לוודא שאזור העניין נחשף ומלא. לחשוף לאור UV עבור הזמן המומלץ במדריך SU-8.
      הערה: כאן, עם אנרגיה חשיפה של 200 mJ ס"מ-2 באורך הגל של 350 nm, וופל נחשף עבור 150 s.
    5. אופים את הפרוסת וופל ב-65 ° c ו-95 ° c עבור הזמן המומלץ במדריך SU-8.
      הערה: ככלל, עבור כל שכבת 100 יקרומטר יש לאפות את הפרוסת וופל במשך 5 דקות ב 65 ° c ו-45 דקות ב-95 ° c.
    6. לטבול את וופל בגביע מלא עם מפתח פולימתיל מתיונין (PMMA) כדי להשיג את המאסטר. טלטל בעדינות את הגביע כדי לוודא שphotoresist הבלתי-פולימלתי נשטף החוצה. אופים את המאסטר ב 200 ° צ' כדי להצליב את הקישור לשכבת ה-SU-8.
  3. להכין תערובת polydiמתיל siloxane (PDMS) על ידי שילוב של אלסטומר עם סוכן הריפוי שלה (טבלת חומרים) ביחס 10:1 בגביע (כאן, 40 mL). מערבבים במרץ עד הנוזל הוא הומוגנית.
    הערה: התערובת PDMS תיראה אטומה, משום שהבועות נוצרות במהלך תהליך הערבוב.
    התראה: כדי למנוע מעור לבוא במגע עם חומרים כימיים או חומר ביולוגי שעלולים להיות מסוכנים, הפעל תמיד חלוק מעבדה וכפפות פלסטיק חד פעמיות לאורך כל הפרוטוקול ועקוב אחר פרוטוקולי בטיחות ספציפיים בהתאם לחומר גליון נתוני בטיחות (MSDS).
  4. דגה את התערובת PDMS בחדר ואקום עבור 45 דקות ב RT. כדי לזרז את התהליך, לשחרר מעת לעת את הוואקום כדי לפוצץ את הבועות היוצרים בממשק.
    הערה: התהליך הניטרול חייב להתבצע בתוך 1 h כדי למנוע את התערובת PDMS מתחילתו לריפוי.
  5. להסיר אבק מפני השטח של המאסטר עם מנקה בלחץ, ולאחר מכן יוצקים את התערובת PDMS משפך על המאסטר ואופים בתנור ב 80 ° c עבור 2 h.
    הערה: לחלופין, אפייה לילה (או לפחות 12 h) ב 60 ° c היה להשיג את אותו PDMS קשיחה.
  6. גזור את PDMS עם להב סביב המיקרו מבנים (במרחק של כ 5 מ"מ) ולאחר מכן לקלף בזהירות את PDMS מן המאסטר.
  7. ניקוב חורים כדי לשמש כניסת ומשקע של המיקרוערוץ (כאן, אחד מפרץ ושקע אחד, ראה איור 1א). ודא ששום דבר לא נוגע בפנים התחתונות של PDMS שבו ממוקמות התכונות.
    הערה: ניתן להשהות את הפרוטוקול כאן. המיקרוערוץ צריך להיות אטום בסרט דביק כדי למנוע הצטברות של אבק וחלקיקים אחרים במהלך האחסון.
  8. בונד מיקרוערוץ PDMS לשקופית זכוכית.
    1. לנקות ביסודיות שקופית זכוכית עם סבון, אלכוהול איזופנול ומים. תן את הזכוכית להחליק יבש או להשתמש באוויר דחוס כדי להאיץ את התהליך.
    2. להסיר חלקיקי אבק על ידי מדבקה עם דבק. בונד מיקרוערוץ PDMS על שקופית זכוכית נקייה, מיד לאחר טיפול בשני המשטחים עם פלזמה (באמצעות מערכת קורונה או תא חמצן פלזמה) עבור 2 דקות.
    3. מניחים את המכשיר microflu, כדי לחמם על צלחת חמה ב 80 ° c עבור לפחות 1 h כדי לחזק את הקשר הכימי עם הזכוכית.

2. ייצור מתקן מיליפלואידיג תלת-ממדי לניסוי עם פולסים מרובים

  1. עצב את הצורה התלת-ממדית באמצעות תוכנת עיצוב תלת-ממד והדפס את המאסטר לתבנית PDMS עם מדפסת תלת-ממד ברזולוציה גבוהה (איור 1B).
    הערה: ראו טבלת חומרים למדפסת התלת-ממדית ולחומר העובש המשמש ליצירת המאסטר.
  2. חזור על שלבים 1.3-1.4, ולאחר מכן נקה את פני השטח של המאסטר באמצעות מדבקה עם דבק. לשים את המאסטר בקנה מידה, אז, תוך הימנעות האזור המרכזי של המאסטר כי יהיה מאוכלס על ידי הקרום, לשפוך על הכמות המדויקת של תערובת PDMS בלתי נרפא (כאן, 23.4 g) על מנת להשיג את הגובה הרצוי של PDMS על ידי התאמת גובה של המאסטר (כאן, 0.5 מ"מ). הסר את הבועות הנותרים בעזרת אוויר דחוס.
  3. מניחים את הגבס PDMS על המאסטר בתנור ב 45 ° c כדי לאפות לפחות 12 h.
  4. בונד בתבנית התלת-ממדית PDMS לצלחת פטרי.
    1. בעדינות לקלף את שכבת PDMS מוקשח ואת כניסת אגרוף וחורים לשקע להזרקה של הבולם החיידקי (איור 1ג).
    2. הפעל הן את המשטח של צלחת פטרי (90 מ"מ x 15 מ"מ) ואת העובש PDMS עם פלזמה חמצן עבור 2 דקות. בונד את תבנית PDMS על צלחת פטרי. לחצו בעדינות על התבנית לצלחת פטרי, אך אל תלחצו במקום שבו התכונות ממוקמות בהתאם לקריסת תא החקירה.
    3. מניחים את צלחת פטרי בונדד לתבנית 3D של PDMS בתנור ב 45 ° c עבור לפחות 12 h כדי לחזק את הקשר הכימי.
      הערה: ניתן להשהות את הפרוטוקול כאן.
  5. פונקציונליזציה של פני ממברנה18
    1. הפעל את קרום הפוליקרבונט הננו (PCTE) בחדר פלזמה חמצן עבור 1 דקות בשעה RT.
      התראה: הימנע משימוש במערכת קורונה עבור הפעלת הפלזמה משום שהיא תגרום נזק לקרום.
    2. תחת כיסוי כימי, יש לדלל פתרון מסחרי של 3-aminopropyltriethoxysilane (APTES) במים מ לאחוז 1% על ידי נפח (כאן, 40 mL), באמצעות צינור פוליפרופילן.
      התראה: הפתרון APTES הוא רעיל בחריפות (הציון של מפגעי הבריאות של MSDS 3) ויש לטפל בטיפול הקיצוני באופן בלעדי תחת כיסוי כימי עם כפפות. שינוי כפפות מיד לאחר טיפול APTES פתרון. אדי אפטס הרסניים לקרומים הריריות ולמערכת הנשימה העליונה. איברי היעד של APTES הם עצבים, כבד, וכליות. אם העישון אינו זמין, יש ליישם מגן פנים ומסכת פנים-מלאה.
    3. להעביר את הפתרון APTES מדולל בצלחת פטרי לטבול את הקרום המופעל בפתרון APTES עבור 20 דקות.
    4. להסיר את הקרום מהפתרון APTES עם מלקחיים ולמקם אותו על חדר נקי לנגב להתייבש.
  6. לייצור ערוצי מיקרופלואידיג PDMS שישקרו על הקרום ולאפשר שטיפת הזירה החיידקית, חזור על שלבים 1.1-1.7.
  7. בונד בערוצי הכביסה של PDMS לממברנה הפונקציונליזציה.
    1. הפעל הן את ערוץ הכביסה PDMS ואת קרום PCTE עם תא פלזמה חמצן עבור 2 דקות.
      הערה: הקרום, אשר יהיה דחוקה בין שתי שכבות PDMS, צריך להיות קטן יותר מאשר ערוץ הכביסה PDMS.
    2. מיד לאחר הטיפול בפלסמה, הביאו את הקרום הפונקציונלי וערוץ הכביסה PDMS ליצירת קשר על ידי לחיצה עדינה על ערוץ הכביסה של PDMS על הקרום.
      הערה: אל תחיל לחץ מוגזם בשלב זה, משום שהוא עלול לגרום להחזקה (בלתי הפיכה) של הקרום אל גג הערוץ, חסימת הערוץ.
  8. כריך את הקרום בין שתי שכבות PDMS (איור 1E).
    1. הפעל הן את הערובה למינציה PDMS הערוץ לשטוף את קרום PCTE ממברנה ואת העובש PDMS 3D בעבר התחבר צלחת פטרי עם תא פלזמה חמצן עבור 2 דקות. להביא אותם במגע וללחוץ יחד.
    2. הניחו את צלחת הפטרי המוארכת למבנה הכריך בתנור ב-45 ° c לפחות 12 שעות כדי לחזק את הקשר הכימי.
      הערה: ניתן להשהות את הפרוטוקול כאן.

3. תרבית תאים

  1. לגדל אוכלוסייה של V. ordalii (להתאמץ 12b09 או 12B09pGFP) לילה עבור 20 h ב 2216 בינונית19 על שייקר מסלולית (600 Rpm) ב 30 ° צ' ותאי הקציר בשלב מאוחר מעריכי. לבודד מחסה pGFP, להוסיף spectinomycin (50 μg mL-1) כדי לשמור על הפלביניים.
  2. צנטריפוגה 1 mL מינימום של תאים ב 2500 x g עבור 3 דקות, להסיר את הסופרנטאנט ולהשעות מחדש את התאים ב 1 מ ל של מי ים מלאכותיים מסוננים. חזור על שלב זה.
  3. להרעיב את אוכלוסיית V. ordalii על שייקר מסלולית (600 rpm) ב 30 ° צ' עבור 3 h.
  4. להכין מלאי הפתרון של מי ים מלאכותיים של 10 מ"מ (כאן, 1 מ ל) של 4-מתיונין-7-ניטרואינוולאיל-כלוב-l-גלוטמט (mni-כלוב-L-גלוטמט) ולאחסן ב-20 ° c.
    הערה: להגן על הפתרון MNI-בכלוב-L-גלוטמט מפני אור הסביבה כדי למנוע photolysis.
  5. לדלל את התאים 50x על ידי השעיית מחדש את התאים מורעבים בפתרון מי ים מלאכותיים של 1 מ"מ MNI כלוב-L-גלוטמט.
    הערה: הדבר יבטיח ריכוז חיידקי אחרון נמוך יותר מ-5 x 107 mL-1 (הערך המדויק תלוי בריכוז הראשוני של תאים במעריך מאוחר, שהוא בדרך כלל~ 10 מ"ל -1). ריכוז חיידקי הוערך באמצעות ספקטרוסקופיה בצפיפות אופטית (OD) של 600 ננומטר.

4. כיול הפרוטוקול המזשל

  1. מניחים droplet (20 μL) של פתרון מי-ים מלאכותיים של MNI-כלוב-L-גלוטמט20 בריכוז C0 = 10 מ"מ על שקופית זכוכית. מכסים את ה-droplet על-ידי כיסוי החדר עם תא PDMS עגול (קוטר d = 5 מ"מ, גובה h = 250 μm).
  2. מניחים את שקופית הזכוכית על הבמה מיקרוסקופ לחשוף את החדר כולו עבור 20 ms קרן LED באורך הגל של 395 ננומטר (כוח 295 mW) באמצעות מטרה 4x (הצמצם המספרי [NA] = 0.13).
  3. פתח את תא PDMS וחלץ droplet (1 μL) לניתוח עם ספקטרוסקופיה UV-Vis.
  4. חזור על שלבים 4.1-4.3 עבור משכים שונים של התאורה LED של 0.1 s, 0.5 s, 2.5 s, 25 s, 250 s (או עד רוויה של התגובה הכימית) ו 0 s (כדי לקבל את הרקע). שכפל את שלבי הפרוצדורה 4.1-4.4 לפחות 3x (כאן, 4x).
  5. מספקטרום הקליטה, לחלץ את הערך ב 405 ננומטר, אשר מייצגים את השיא בספקטרום הקליטה של המולקולה כלוב21. כדי לקבוע את קצב ה- k של התגובה הכימית על ידי חשיפה LED14, השתמש במשוואה הבאה הראשונה בסדר הקינטיקה עבור התאמה מספרית של הנתונים ניסיוני17
    figure-protocol-9325
    כאשר C(t) הוא הערך של ספקטרום הקליטה של הפתרון ב 405 nm (לאחר הסרת הרקע) עם זמן ההזדקנות של t שניות. לזמן הזדקנות קטן שאינו כזה Kt 1, Eq .1 יכול להיות פשוט לניסוח ליניארי
    figure-protocol-9616

5. ניסוי הפולס הכימי היחיד

  1. שמור על ערוץ microflu, תחת ואקום עבור 20 דקות כדי להפחית את ריכוז הגז בתוך PDMS כך שבועות פחות סביר טופס במהלך תהליך המילוי.
  2. לחלץ את הערוץ ממשאבת ואקום ומיד להציג את ההשעיה בקטריאלי מדלל 1 mM-כלוב-L-גלוטמט ב מי ים מלאכותיים לתוך מיקרותעלת בעדינות באמצעות מיקרופיפטה כדי למנוע נזק הדגל על ידי כוחות ההטיה מכני (כאן, תהליך המילוי כולו לקח 5-10 s). לאחר מילוי הערוץ עם הבולם החיידקי, למצוץ את הפתרון עודף עם מגבת נייר, ו לאטום את השקע ולפרוק עם מצתים PDMS על ידי לחיצה עדינה אותם לתוך החורים.
    הערה: בדרך זו, זרימת הנוזלים בחדר נמנעת.
  3. מקם את המיקרו-ערוץ על במת מיקרוסקופ והעבר את השלב כדי להגדיר את שדה הראייה באמצע הערוץ. הגדר את המיקרוסקופ לבצע הדמיה בניגוד שלב (4x המטרה) בשיעור מסגרת של 12 fps.
    הערה: ערך זה יכול להיות מגוון, אך לא להיות פחות מ-10 fps כדי לאפשר שחזור של מסלולים חיידקיים באמצעות ניתוח תמונה (ראה פרוטוקול סעיף 7).
  4. הגדר את החור הפינתי של קרן LED בצמצם המינימלי. על ידי קביעת זמן חשיפה של המצלמה ל 5 s, להקליט כמה מסגרות כדי לקבל מדידות מדויקות של המיקום המרחבי גודל של קרן LED.
    הערה: מקור אור ה-LED מתחבר למאיר המיקרוסקופ מהיר באמצעות חיבור מדריך אור נוזלי. קרן LED אינה משפיעה על לכידת וידאו, כי רכישת וידאו וגירוי LED מצווים באופן עצמאי דרך התוכנה.
  5. לבצע הדמיה רציפה עבור משך כולל של 10 דקות (20 דקות עבור הדופק הכימי הגדול ביותר), ובמקביל להפעיל את קרן LED ממוקדת ב 395 ננומטר למשך הזמן הרצוי (בניסוי זה, t = 20 ms, 100 ms, 500 ms) בנקודת זמן המוגדרת על-ידי המשתמש (כאן, 10 s לאחר תחילת רכישת כדי לקבל מספר שכפול של אותו תהליך, הזז את השלב כדי לתעד את התגובה החיידקית על פני מיקומים שונים של ערוץ microflu, c. שכפל הליך זה עבור כל גודל פעימה, באמצעות מיקרוערוץ חדש.
    הערה: תהליך ההזדקנות מייצר פולס גלילי באמצעות הדמיה במישור ההדמיה.
  6. התנהלות ניסויים נפרדים ללא הזדקנות כימית בהגדלה גבוהה יותר (המטרה 20x, NA = 0.45) בקצב מסגרות גבוה יותר (50 fps) כדי להקליט את התנועה שחייה משוחדת של החיידקים.

6. ניסוי מרובה כימי-פולס

  1. שמרו על החדר מיליפלואידיג תחת ואקום במשך 20 דקות.
  2. מניחים את צלחת פטרי המכילה את החדר מיליפלואידיג על במת מיקרוסקופ. ממלאים את החדר מתחת לקרום עם ההשעיה חיידקים מדלל (כאן, תהליך המילוי כולו לקח 10-15 שנות) של GFP-פלורסנט V. גוראלי ב 1 מ"מ בכלוב-L-גלוטמט פתרון לתוך מי ים מלאכותיים. לאחר מילוי הערוץ עם הבולם החיידקי, למצוץ את הפתרון עודף עם מגבת נייר, ו לאטום את השקע ולפרוק עם מצתים PDMS על ידי לחיצה עדינה אותם לתוך החורים.
    הערה: בדרך זו, זרימת הנוזלים בחדר נמנעת. כדי לאפשר ויזואליזציה טובה יותר של חיידקים בכיוונון זה שבו ההדמיה מתרחשת דרך קרום nanפורטו, מומלץ מאוד להשתמש בזני פלורסנט במקום סוג פראי (כמו בשימוש בניסוי כימי יחיד הדופק).
  3. למלא מזרק עם פתרון מי ים מלאכותיים של 1 מ"מ-כלוב-L-גלוטמט ו לצרף אבובים לתוך השקע ואת הפורקן של הערוץ כביסה מעל קרום.
  4. לחבר את אבובים למאגר פסולת ולהבטיח כי אבובים הוא לחלוטין שקוע במאגר פסולת נוזלים כדי למנוע תנודות בלחץ.
  5. הגדר את קצב הזרימה המתאים על משאבת המזרק (כאן, 50 μL-1) כדי לקבל את קצב הזרימה הממוצע הרצוי בערוץ הכביסה, התלוי בגיאומטריה של הערוץ.
  6. הפעל את משאבת המזרק כדי ליצור את הזרימה בערוץ הכביסה מעל הקרום.
  7. הפעל את התוכנה שליטה על קרן LED ומיקרוסקופ הבמה כדי ליצור רצפים המוגדרים על ידי המשתמש של פולסים במיקומים שונים עם עוצמות שונות.
    הערה: הזרימה הרציפה של פתרון מי-ים מלאכותיים של 1 מ"מ-כלוב-L-גלוטמט בערוץ כביסה מעל הקרום משנה את הפתרון המורכב בכלוב ושוטף את המדיום המושקע מתוך הזירה החיידקית.
  8. הקלטת וידאו באמצעות מטרת 4x במרווחי זמן קבועים על פני תקופה של מספר שעות ומספר מיקומים רציפים מרובים כדי לכסות משטח גדול (כאן, 1 ס מ x 1 ס"מ, איור 1F).

7. ניתוח תמונה וניתוח נתונים

  1. שחזור מסלולים חיידקיים
    1. מתוך הסרטים שנרשמו עם המטרה 4x, לשחזר את מסלולים חיידקיים באמצעות תוכנת מעקב17.
      הערה: מסלולים אלה מייצגים את התחזיות הדו של התנועה בקטריאלי תלת-ממדית במיקרוערוץ.
    2. מתוך מסלולים חיידקיים משוחזרים, לקבוע את מהירות הסחף הרדיאלי של כל אדם שחייה על ידי הקרנת מהירות השחייה שלו על הכיוון לכיוון מרכז הדופק הכימי (איור 2ד). עבור ויזואליזציה של הדינמיקה הטמפורלית הזמני של מהירות סחיפה רדיאלי, השתמש רשת binning עם גודל מרחבי 75 יקרומטר x 75 יקרומטר וחלון הזמני של 5-10 מרווח s (איור 2D,E).
      הערה: בגלל הסימטריה הגליתית של התהליך, ניתן לנתח נתונים בקואורדינטות קוטביות ובממוצע על הממד הזוויתי (איור 3).
    3. מתוך מסלולים חיידקיים משוחזרים, לקבוע את הדינמיקה בזמן הזמני של התפלגות החיידקים כפי שהם מגיבים הפולסים הכימיים (איור 2E).
    4. מתוך סרטים ברזולוציה גבוהה יותר שנרשמו עם המטרה 20x במהלך ניסויים בפעימה אחת, לחלץ את התפלגות של מהירות שחייה וזמן ריצה עבור האוכלוסייה החיידקית כפי שהם מגיבים הדופק הכימי (איור 4).
  2. להעריך את מקדם דיפוזיה של חיידקים על ידי בהתחשב הדינמיקה הפיזור של האוכלוסייה החיידקית לאחר כימוטקאס הושלמה17 (כאן, עבור t > 300 s; איור 3).
  3. העריכו את מקדם הדיפוזיה של גלוטמט על ידי החלת משוואת סטוקס-איינשטיין
    figure-protocol-14980
    שבו מולקולות חומצות אמינו מניחים כי הם חלקיקים כדוריים עם רדיוס הידרודינמי22rG, kB הוא קבוע בולצמן (1.38 x 10-23 m2 ק"ג s-2 k-1), T הוא הטמפרטורה (296 k), ו η הוא צמיגות דינמית של מי הים המלאכותי (מליחות 36 G ק"ג-1) ב 23 ° צ' (10-3 אבא s)23

תוצאות

השתמשנו המכשירים microflu, ו מיליפלואידיג (איור 1) כדי ללמוד פרופילים הצטברות חיידקים תחת תנאי מזינים דינמיים. מסלולים חיידקיים חולצו מקטעי וידאו מוקלטים שנרכשו על ידי מיקרוסקופ ניגודיות פאזה של הדינמיקה הצטברות-פליטת של אוכלוסייה חיידקית בעקבות פעימה כימית שפורסמה על ידי פו...

Discussion

שיטה זו מאפשרת לחוקרים לחקור כימוטוניות חיידקי תחת נשלט, מעברי צבע דינמיים במכשירים מיקרו ו-מיליפלואידיג, המאפשר רכישת נתונים שאינם מפוקחים. היצירה הכמעט-מיידית של פולסים כימיים במיקרוסקאלה על ידי פוטוליזה שואפת לשכפל את סוגי פולסים תזונתיים כי חיידקים מפגש פראי מתוך מגוון של מקורות, למ?...

Disclosures

. למחברים אין מה לגלות

Acknowledgements

המחברים מודים למתקן המיקרוייצור הראשון ב-ETH ציריך. עבודה זו נתמכת על ידי מועצת המחקר האוסטרלי החוקר הקריירה הקדומה פרס DE180100911 (כדי D.R.B.), גורדון ובטי מור היוזמה הימית פרס החוקר GBMF3783 (כדי R.S.), ו שוויצרי קרן המדע הלאומי המענק 1-002745-000 (לR.S.).

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
(3-Aminopropyl) triethoxysilane (APTES)Sigma-AldrichA3648>98% purity, highly toxic
CELLSTAR tubeGreiner Bio-One21026150 ml
CentrifugeEppendorf5424Rto eliminate spent media from the bacterial culture
Digital Incubators Incu-LineVWR-CH390-0384to bake 3D master
DusterVWR-CH16650-22to clean the wafer and microchannels
Hot plateVWR-CH444-0601to bond the microchannels
IsopropanolSigma-AldrichW292907
LightSafe micro centrifuge tubesSigma-AldrichZ6883121.5 ml
MATLABMathworksfor image analysis and bacterial tracking
Microcentrifuge tubeEppendorf301200861.5 ml
Microscope glass slideVWR-CH631-1552
Microscope Nikon Eclipse TiENikon InstrumentsMEA53100with motorized stage
MNI-GlutamateTocris Bioscience1490>98 % purity, photosensitive
Mold printing equipmentStratasysObjet30 3D printer
Mold printing service3D Printing StudiosCustomhttps://www.3dprintingstudios.com/
Nanodrop One UV-Vis SpectrophotometerThermo Fisher ScientificND-ONE-Wto calibrate the uncaging
NIS ElementsNikon InstrumentsMicroscope Imaging Software
Oven Venti-LineVWR-CH466-3516to bake PDMS (with forced convection)
Photoresist SU-8-3050MicroChem Corp.SU8-3050
Plasma chamber ZeptoDiener ElectronicZEPTO-1to functionalize the surfaces before bonding
Polycarbonate membraneSterlitechPCT04471000.4 µm pore size, 19 % open area, 24 µm thickness
Polyethylene microtubingScientific CommoditiesBB31695-PE/2I.D. x O.D.: 0.015" x 0.043" / 0.38mm x 1.09mm
Polystyrene Petri dishVWR-CH25373-100bottom surface (90 mm x 15 mm) to bond the millifluidic device
ScaleVWR-CH611-2605to weight PDMS mixture
sCMOS camera Andor ZylaOxford Instrumentsfor phase contrast and fluorescence microscopy (max 100 fps)
Sea saltInstant OceanProduct No. SS1-160p
SolidWorks 2015Dassault Systemes SolidWorksUsed to design the mold
Spectra X light engineLumencolorfor LED 395 nm
Sylgard 184Dow Corning110-41-155PDMS Si Elastomer Kit; curing agent
Syringe (Luer-Lok)B Braun Omnifix4616308F
Syringe NeedleAganiA228from 10 to 30 ml
Syringe Pump 11 Pico Plus EliteHarvard Apparatus70-4506Terumo Agani 23 gauge 5/8 inch (16mm)
VeroGreyStratasysDual Syringe Pump
Vortex-GenieScientific IndustriesSI-0236Mold Material

References

  1. Armitage, J. P., Lackie, J. M. . The biology of the chemotactic response. , (1991).
  2. Azam, F., Malfatti, F. Microbial structuring of marine ecosystems. Nature Reviews Microbiology. 5 (10), 782-791 (2007).
  3. Buchan, A., LeCleir, G. R., Gulvik, C. A., González, J. M. Master recyclers: features and functions of bacteria associated with phytoplankton blooms. Nature Reviews Microbiology. 12 (10), 686-698 (2014).
  4. Whitesides, G. M., Ostuni, E., Takayama, S., Jiang, X., Ingber, D. E. Soft lithography in biology and biochemistry. Annual Review of Biomedical Engineering. 3, 335-373 (2001).
  5. Segall, J. E., Block, S. M., Berg, H. C. Temporal comparisons in bacterial chemotaxis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 83 (23), 8987-8991 (1986).
  6. Waite, A. J. Non-genetic diversity modulates population performance. Molecular Systems Biology. 12 (12), 895 (2016).
  7. Stocker, R. Marine Microbes See a sea of gradients. Science. 338 (6107), 628-633 (2012).
  8. Ellis-Davies, G. C. R. Caged compounds: photorelease technology for control of cellular chemistry and physiology. Nature Methods. 4 (8), 619-628 (2007).
  9. Kaplan, J. H., Somlyo, A. P. Flash photolysis of caged compounds: New tools for cellular physiology. Trends in Neurosciences. 12 (2), 54-59 (1989).
  10. Ando, H., Furuta, T., Tsien, R. Y., Okamoto, H. Photo-mediated gene activation using caged RNA/DNA in zebrafish embryos. Nature Genetics. 28 (4), 317-325 (2001).
  11. England, P. M., Lester, H. A., Davidson, N., Dougherty, D. A. Site-specific, photochemical proteolysis applied to ion channels in vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 94 (20), 11025-11030 (1997).
  12. Fino, E. RuBi-Glutamate: Two-photon and visible-light photoactivation of neurons and dendritic spines. Frontiers in Neural Circuits. 3, (2009).
  13. Khan, S., Spudich, J. L., McCray, J. A., Trentham, D. R. Chemotactic signal integration in bacteria. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 92 (21), 9757-9761 (1995).
  14. Sagawa, T. Single-Cell E. coli Response to an Instantaneously Applied Chemotactic Signal. Biophysical Journal. 107 (3), 730-739 (2014).
  15. Xie, L., Lu, C., Wu, X. L. Marine Bacterial Chemoresponse to a Stepwise Chemoattractant Stimulus. Biophysical Journal. 108 (3), 766-774 (2015).
  16. Jikeli, J. F., et al. Sperm navigation along helical paths in 3D chemoattractant landscapes. Nature Communications. 6, 7985 (2015).
  17. Brumley, D. R., et al. Bacteria push the limits of chemotactic precision to navigate dynamic chemical gradients. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (22), 10792-10797 (2019).
  18. Aran, K., Sasso, L. A., Kamdar, N., Zahn, J. D. Irreversible, direct bonding of nanoporous polymer membranes to PDMS or glass microdevices. Lab on a Chip. 10 (5), 548 (2010).
  19. ZoBell, C. E. The cultural requirements of heterotrophic aerobes. Journal of Marine Research. 4, 42-75 (1941).
  20. Canepari, M., Nelson, L., Papageorgiou, G., Corrie, J. E. T., Ogden, D. Photochemical and pharmacological evaluation of 7-nitroindolinyl-and 4-methoxy-7-nitroindolinyl-amino acids as novel, fast caged neurotransmitters. Journal of Neuroscience Methods. 112 (1), 29-42 (2001).
  21. Trigo, F. F., Corrie, J. E. T., Ogden, D. Laser photolysis of caged compounds at 405nm: Photochemical advantages, localisation, phototoxicity and methods for calibration. Journal of Neuroscience Methods. 180 (1), 9-21 (2009).
  22. Ribeiro, A. C. F. Mutual diffusion coefficients of L-glutamic acid and monosodium L-glutamate in aqueous solutions at T=298.15K. The Journal of Chemical Thermodynamics. 74, 133-137 (2014).
  23. Sharqawy, M. H., Lienhard, J. H., Zubair, S. M. Thermophysical properties of seawater: a review of existing correlations and data. Desalination and Water Treatment. 16 (1-3), 354-380 (2010).
  24. . Nikon depth of field calculator Available from: https://www.microscopyu.com/tutorials/depthoffield (2019)
  25. Kiørboe, T., Thygesen, U. H. Fluid motion and solute distribution around sinking aggregates: II. Implications for remote detection by colonizing zooplankters. Marine Ecology Progress Series. 211, 15-25 (2001).
  26. Blackburn, N., Fenchel, T., Mitchell, J. Microscale nutrient patches in planktonic habitats shown by chemotactic bacteria. Science. 282 (5397), 2254-2256 (1998).
  27. Stocker, R., Seymour, J. R., Samadani, A., Hunt, D. E., Polz, M. F. Rapid chemotactic response enables marine bacteria to exploit ephemeral microscale nutrient patches. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (11), 4209-4214 (2008).
  28. Altindal, T., Chattopadhyay, S., Wu, X. L. Bacterial chemotaxis in an optical trap. PLoS ONE. 6 (4), 18231 (2011).
  29. Zhu, X., et al. Frequency-Dependent Escherichia coli Chemotaxis behavior. Physical Review Letters. 108 (12), (2012).
  30. Baraban, L., Harazim, S. M., Sanchez, S., Schmidt, O. G. Chemotactic behavior of catalytic motors in microfluidic channels. Angewandte Chemie International Edition. 52 (21), 5552-5556 (2013).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

155

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved