Generieren kontrollierter, dynamischer chemischer Landschaften zur Untersuchung des mikrobiellen Verhaltens

Zusammenfassung

Ein Protokoll zur Erzeugung dynamischer chemischer Landschaften durch Photolyse in mikrofluidischen und millifluidischen Setups wird vorgestellt. Diese Methode eignet sich zur Untersuchung verschiedener biologischer Prozesse, einschließlich des Motilverhaltens, der Nährstoffaufnahme oder der Anpassung an Chemikalien von Mikroorganismen, sowohl auf Einzelzell- als auch auf Populationsebene.

Zusammenfassung

Wir demonstrieren eine Methode zur Erzeugung kontrollierter, dynamischer chemischer Impulse, bei denen lokalisiertes Chemoattractant plötzlich auf mikroscale verfügbar wird, um Mikroumgebungen für mikrobielle Chemotaxis-Experimente zu schaffen. Um chemische Impulse zu erzeugen, haben wir ein System entwickelt, um Aminosäurequellen nahezu augenblicklich durch Photolyse von Käfig-Aminosäuren in einer polydimethylsiloxanen (PDMS) Mikrofluidkammer einzuführen, die eine bakterielle Suspension enthält. Wir haben diese Methode auf das chemotaktische Bakterium Vibrio ordaliiangewendet, das diese dynamischen chemischen Gradienten aktiv erklimmen kann, während es durch Videomikroskopie verfolgt wird. Aminosäuren, die durch chemische Modifikation mit einer photoabnehmbaren Schutzgruppe biologisch inert ("käfig") gerendert werden, sind in der Suspension einheitlich vorhanden, können aber bis zu ihrer plötzlichen Freisetzung, die zu benutzerdefinierten Zeitpunkten in Zeit und Raum mit Hilfe eines nahezu UV-A fokussierten LED-Strahls erfolgt, nicht zum Verzehr stehen. Die Anzahl der im Puls freigesetzten Moleküle kann durch eine Kalibrierbeziehung zwischen Belichtungszeit und unkaging fraktion bestimmt werden, wobei das Absorptionsspektrum nach der Photolyse durch UV-Vis-Spektroskopie gekennzeichnet ist. Eine nanoporöse Polycarbonatmembran (PCTE) kann in das mikrofluidische Gerät integriert werden, um die kontinuierliche Entfernung der ungecaged Compounds und der verbrauchten Medien durch den Fluss zu ermöglichen. Eine starke, irreversible Verbindung zwischen der PCTE-Membran und der mikrofluidischen PdMS-Struktur wird durch Beschichtung der Membran mit einer Lösung aus 3-Aminopropyltriethoxysilan (APTES) und anschließender Plasmaaktivierung der zu verklebenden Oberflächen erreicht. Ein computergesteuertes System kann benutzerdefinierte Pulssequenzen an verschiedenen Stellen und mit unterschiedlichen Intensitäten erzeugen, um Ressourcenlandschaften mit vorgeschriebener räumlicher und zeitlicher Variabilität zu schaffen. In jeder chemischen Landschaft kann die Dynamik der bakteriellen Bewegung auf der individuellen Skala und ihre Akkumulation auf Populationsebene erreicht werden, wodurch die Quantifizierung der chemotaktischen Leistung und ihrer Auswirkungen auf bakterielle Aggregationen in ökologisch relevanten Umgebungen ermöglicht wird.

Einleitung

Mikroben verlassen sich auf Chemotaxis, den Prozess der Erkennung chemischer Gradienten und Modifizieren der Beweglichkeit in Reaktion¹, um chemische Landschaften zu navigieren, Nährstoffquellen und Wirte zu nähern und schädlichen Substanzen zu entkommen. Diese mikroskalen Prozesse bestimmen die makroskalige Kinetik der Wechselwirkungen zwischen Mikroben und ihrer Umgebung^2,3. Jüngste Fortschritte in der Mikrofluidik und Mikrofabrikationstechnologien, einschließlich der weichen Lithographie⁴, haben unsere Fähigkeit revolutioniert, kontrollierte Mikroumgebungen zu schaffen, in denen die Wechselwirkungen von Mikroben untersucht werden können. Zum Beispiel haben frühere Experimente bakterielle Chemotaxis untersucht, indem hochkontrollierte, stabile Gradienten von mittleren bis hohen Nährstoffkonzentrationen^5,6erzeugt wurden. In natürlichen Umgebungen können jedoch mikroskalige chemische Gradienten kurzlebig sein, die durch molekulare Diffusion abgeführt werden, und die Hintergrundbedingungen sind oft stark verdünnt⁷. Um die chemotaktische Reaktion von mikrobiellen Populationen, die zuerst in stabilen chemischen Umgebungen ausgesetzt waren, direkt zu messen, haben wir Methoden entwickelt und hier beschrieben, um mikrofluidische Technologie mit Photolyse zu kombinieren und dabei Gradienten nachzuahmen, denen wilde Bakterien in der Natur begegnen.

Die Unkaging-Technologie verwendet lichtempfindliche Sonden, die Biomoleküle funktionell in inaktiver Form verkapseln. Die Bestrahlung setzt das Käfigmolekül frei, wodurch die gezielte Störung eines biologischen Prozesses^{ermöglicht wird 8}. Aufgrund der schnellen und präzisen Kontrolle der zellulären Chemie, die die Unkaging bietet⁹, Photolyse von Käfigverbindungen wurde traditionell von Biologen, Physiologen und Neurowissenschaftlern verwendet, um die Aktivierung der Gene¹⁰, Ionenkanäle¹¹, und Neuronen¹²zu studieren. In jüngerer Zeit haben Wissenschaftler die signifikanten Vorteile der Photolyse genutzt, um Chemotaxis¹³zu untersuchen, um die Flagella-Schaltdynamik einzelner Bakterienzellen zu bestimmen, die einem stufenweisen Chemolockantenreiz^14,15, ausgesetzt sind, und um Motilitätsmuster einzelner Spermien in dreidimensionalen (3D) Gradienten¹⁶zu untersuchen.

In unserem Ansatz implementieren wir die Photolyse von Käfig-Aminosäuren in mikrofluidischen Geräten, um die Verhaltensreaktion einer bakterienpopulation auf kontrollierte chemische Impulse zu untersuchen, die durch Photorelease nahezu sofort verfügbar werden. Die Verwendung eines objektiven Objektivs mit geringer Vergrößerung (4x) (NA = 0,13, Schwerpunkttiefe ca. 40 m) ermöglicht sowohl die Beobachtung der aggregationiven Reaktion von Tausenden von Bakterien auf Populationsebene über ein großes Sichtfeld (3,2 mm x 3,2 mm) als auch die Messung der Bewegung auf Einzelzellebene. Wir stellen zwei Anwendungen dieser Methode vor: 1) die Freisetzung eines einzelnen chemischen Impulses zur Untersuchung der bakteriellen Akkumulations-Dissipationsdynamik ausgehend von einheitlichen Bedingungen und 2i) die Freisetzung mehrerer Impulse, um die bakterielle Akkumulationsdynamik unter zeitverändernden, räumlich heterogenen Chemopitantenbedingungen zu charakterisieren. Diese Methode wurde an den Meeresbakterien Vibrio ordalii getestet, die Chemotaxis in Richtung der Aminosäure Glutamat¹⁷durchführen, aber die Methode ist allgemein anwendbar auf verschiedene Kombinationen von Arten und Chemoattractants, sowie auf biologische Prozesse jenseits von Chemotaxis (z. B. Nährstoffaufnahme, Antibiotika-Exposition, Quorum-Erkennung). Dieser Ansatz verspricht dabei, die Ökologie und das Verhalten von Mikroorganismen in realistischen Umgebungen aufzuklären und die versteckten Kompromisse aufzudecken, denen einzelne Bakterien beim Navigieren in flüchtigen dynamischen Gradienten ausgesetzt sind.

Protokoll

1. Herstellung des Mikrofluidischen Geräts für das Einzel-Chemie-Puls-Experiment

1. Entwerfen Sie den Kanal mithilfe der CAD-Software (Computer-Aided Design), und drucken Sie ihn auf einen Transparenzfilm, um die Fotomaske zu erstellen (Abbildung 1A).
2. Fertigen Sie den Meister durch weiche Lithographie (unter Reinraumbedingungen).
   1. Einen Siliziumwafer (4 Zoll) in schneller Folge mit Aceton, Methanol und Isopropanol reinigen, dann mit Stickstoff trocknen. Den Wafer im Ofen bei 130 °C 5 min backen.
   2. Legen Sie den Wafer in die Mitte eines Spincoaters und gießen Sie SU-8 Photoresist auf den Wafer. Rampen Sie die Geschwindigkeit des Spincoaters bis zu 500 U/min über 5 s, und halten Sie bei 500 U/min für 10 s. Ramp bis zur Endgeschwindigkeit über 10 s und halten Sie bei dieser Geschwindigkeit für 30 s.
      HINWEIS: Der genaue Wert der Endgeschwindigkeit hängt von der angestrebten Schichtdicke und der verwendeten SU-8 ab.
   3. Nach dem Spin-Coating-Prozess den Wafer bei 65 °C und dann bei 95 °C backen. Lassen Sie den Wafer bei Raumtemperatur (RT) mindestens 5 min abkühlen.
      HINWEIS: Die Backzeit hängt von der gezielten Dicke und Art des verwendeten Photowiderstands ab. In der Regel sollte der Wafer für jede Schicht von 100 m 5 min bei 65 °C und 45 min bei 95 °C gebacken werden.
   4. Legen Sie die Fotomaske auf den Wafer, um sicherzustellen, dass nur der Bereich von Interesse ausgesetzt und polymerisiert wird. Setzen Sie UV-Licht für die im SU-8-Handbuch empfohlene Zeit aus.
      HINWEIS: Hier wurde der Wafer mit einer Belichtungsenergie von 200 mJ cm^-2 bei einer Wellenlänge von 350 nm für 150 s ausgesetzt.
   5. Backen Sie den Wafer bei 65 °C und 95 °C für die im SU-8-Handbuch empfohlene Zeit.
      HINWEIS: In der Regel sollte der Wafer für jede Schicht von 100 m 5 min bei 65 °C und 45 min bei 95 °C gebacken werden.
   6. Tauchen Sie den Wafer in einen Becher ein, der mit Polymethylmethacrylat (PMMA) Entwickler gefüllt ist, um den Master zu erhalten. Schütteln Sie den Becher vorsichtig, um sicherzustellen, dass der nicht polymerisierte Photoresist ausgewaschen wird. Backen Sie den Master bei 200 °C, um die SU-8-Schicht weiter zu vernetzen.
3. Bereiten Sie ein Polydimethylsiloxan (PDMS) Gemisch vor, indem Sie das Elastomer mit seinem Härtungsmittel (Materialtabelle) im Verhältnis 10:1 in einem Becher (hier 40 ml) kombinieren. Kräftig mischen, bis die Flüssigkeit homogen ist.
   HINWEIS: Die PDMS-Mischung sieht undurchsichtig aus, da während des Mischvorgangs Blasen erzeugt werden.
   VORSICHT: Um zu verhindern, dass die Haut mit potenziell gefährlichen Chemikalien oder biologischem Material in Berührung kommt, tragen Sie immer einen Labormantel und Einweg-Kunststoffhandschuhe während des gesamten Protokolls und befolgen Sie spezifische Sicherheitsprotokolle gemäß dem Material Sicherheitsdatenblatt (MSDS).
4. Entgasen Sie das PDMS-Gemisch in einer Vakuumkammer für 45 min bei RT. Um den Prozess zu beschleunigen, lassen Sie das Vakuum regelmäßig los, um die Blasen zu platzen, die sich an der Schnittstelle bilden.
   HINWEIS: Der Entgasungsprozess muss innerhalb von 1 h durchgeführt werden, um zu verhindern, dass die PDMS-Mischung mit der Aushärtung beginnt.
5. Mit einem Druckreiniger Staub von der Oberfläche des Masters entfernen, dann die entgaste PDMS-Mischung auf den Master gießen und im Ofen bei 80 °C für 2 h backen.
   HINWEIS: Alternativ würde das Backen über Nacht (oder für mindestens 12 h) bei 60 °C das gleiche gehärtete PDMS erreichen.
6. Schneiden Sie das PDMS mit einer Klinge um die Mikrostrukturen (in einem Abstand von ca. 5 mm) und schälen Sie das PDMS dann vorsichtig vom Master.
7. Stanzlöcher als Ein- und Auslass des Mikrokanals (hier ein Einlass und ein Auslass, siehe Abbildung 1A). Stellen Sie sicher, dass nichts die untere Seite des PDMS berührt, in dem sich die Features befinden.
   HINWEIS: Das Protokoll kann hier angehalten werden. Der Mikrokanal sollte mit Klebeband versiegelt werden, um die Ansammlung von Staub und anderen Partikeln während der Lagerung zu verhindern.
8. Kleben Sie den PDMS-Mikrokanal an einen Glasschlitten.
   1. Reinigen Sie eine Glasrutsche gründlich mit Seife, Isopropanol und entionisiertem Wasser. Lassen Sie das Glas gleiten trocken oder verwenden Sie Druckluft, um den Prozess zu beschleunigen.
   2. Entfernen Sie Staubpartikel, indem Sie mit Klebeband dabben. Verkleben Sie den PDMS-Mikrokanal unmittelbar nach der Behandlung beider Oberflächen mit Plasma (entweder mit einem Corona-System oder einer Plasma-Sauerstoffkammer) für 2 min.
   3. Legen Sie das mikrofluidische Gerät auf eine Kochplatte bei 80 °C für mindestens 1 h zu erhitzen, um die chemische Bindung mit dem Glas zu stärken.

2. Herstellung des 3D-gedruckten Millifluidischen Geräts für das Experiment mit mehreren Impulsen

1. Entwerfen Sie die 3D-Form mit 3D-Design-Software und drucken Sie den Master für die PDMS-Form mit einem hochauflösenden 3D-Drucker(Abbildung 1B).
   HINWEIS: Siehe Materialtabelle für den 3D-Drucker und das Formmaterial, das zum Erstellen des Masters verwendet wird.
2. Wiederholen Sie die Schritte 1.3 bis 1.4, und reinigen Sie dann die Oberfläche des Masters, indem Sie mit Klebeband dabben. Setzen Sie den Master auf eine Skala, dann, unter Vermeidung der zentralen Bereich des Masters, die von der Membran besetzt wird, gießen Sie auf die genaue Menge der ungehärteten PDMS-Mischung (hier, 23,4 g), um die gewünschte Höhe von PDMS zu erhalten, indem Sie die Höhe des Masters (hier, 0,5 mm). Entfernen Sie alle verbleibenden Blasen mit Hilfe von Druckluft.
3. Den PDMS auf den Master in einen Ofen bei 45 °C geben, um mindestens 12 h zu backen.
4. Die 3D-PDMS-Form an eine Petrischale kleben.
   1. Die gehärtete PDMS-Schicht und die Lochein- und Auslasslöcher für die Injektion der bakteriellen Suspension vorsichtig abziehen (Abbildung 1C).
   2. Aktivieren Sie sowohl die Oberfläche einer Petrischale (90 mm x 15 mm) als auch die PDMS-Form mit Sauerstoffplasma für 2 min. Verkleben Sie die PDMS-Form auf der Petrischale. Drücken Sie vorsichtig die Form auf die Petrischale, aber drücken Sie nicht, wo sich die Merkmale befinden, da dies die Verhörkammer zusammenbrechen kann.
   3. Die Mitdersächse an die PDMS 3D-Form geklebte Form bei 45 °C mindestens 12 h in einen Ofen geben, um die chemische Bindung zu stärken.
      HINWEIS: Das Protokoll kann hier angehalten werden.
5. Membranoberflächenfunktionalisierung¹⁸
   1. Aktivieren Sie die nanoporöse Polycarbonatmembran (PCTE) in einer Sauerstoffplasmakammer für 1 min bei RT.
      VORSICHT: Vermeiden Sie die Verwendung eines Coronasystems für die Plasmaaktivierung, da es die Membran beschädigt.
   2. Unter einer chemischen Haube eine kommerzielle Lösung von 3-Aminopropyltriethoxysilan (APTES) in entionisiertem Wasser auf 1 Volumen%(hier, 40 ml) verdünnen, indem Sie ein Polypropylenrohr verwenden.
      VORSICHT: Die APTES-Lösung ist akut toxisch (MSDS Health Hazard Score 3) und sollte ausschließlich unter einer chemischen Haube mit Handschuhen mit äußerster Sorgfalt behandelt werden. Handschuhe sofort nach der Handhabung der APTES-Lösung wechseln. APTES Dämpfe sind zerstörerisch für die Schleimhäute und die oberen Atemwege. Die Zielorgane von APTES sind Nerven, Leber und Niere. Wenn keine Dunstabzugshaube verfügbar ist, müssen ein Gesichtsschutz und ein Vollschutzgerät implementiert werden.
   3. Übertragen Sie die verdünnte APTES-Lösung in eine Petrischale und tauchen Sie die aktivierte Membran 20 min in die APTES-Lösung ein.
   4. Entfernen Sie die Membran aus der APTES-Lösung mit einer Pinzette und legen Sie sie zum Trocknen auf ein Reinraumtuch.
6. Für die Herstellung der mikrofluidischen PDMS-Kanäle, die auf der Membran liegen und das Waschen der Bakterienarena ermöglichen, wiederholen Sie die Schritte 1.1-1.7.
7. Die PDMS-Waschkanäle an die funktionalisierte Membran kleben.
   1. Aktivieren Sie sowohl den PDMS-Waschkanal als auch die PCTE-Membran mit einer Sauerstoffplasmakammer für 2 min.
      HINWEIS: Die Membran, die zwischen zwei PDMS-Schichten eingeklemmt wird, sollte kleiner sein als der PDMS-Waschkanal.
   2. Bringen Sie unmittelbar nach der Plasmabehandlung die funktionalisierte Membran und den PDMS-Waschkanal in Kontakt, indem Sie den PDMS-Waschkanal vorsichtig auf die Membran drücken.
      HINWEIS: Wenden Sie in diesem Stadium keinen übermäßigen Druck an, da dies zu einer (irreversiblen) Befestigung der Membran am Dach des Kanals führen und den Kanal blockieren könnte.
8. Sandwich die Membran zwischen zwei PDMS-Schichten (Abbildung 1E).
   1. Aktivieren Sie sowohl die gebundene Laminat-PDMS-Waschkanal-PCTE-Membran als auch die zuvor mit der Petrischale mit einer Sauerstoffplasmakammer für 2 min verklebte 3D-PDMS-Form. Bringen Sie sie in Kontakt und drücken Sie sie zusammen.
   2. Die Petrischale an die Sandwichstruktur in einem Ofen bei 45 °C für mindestens 12 h verklebt, um die chemische Bindung zu stärken.
      HINWEIS: Das Protokoll kann hier angehalten werden.

3. Zellkultur

1. Wachsen Sie eine Population von V. ordalii (Stamm 12B09 oder 12B09pGFP) über Nacht für 20 h in 2216 Medium¹⁹ auf einem Orbitalshaker (600 Rpm) bei 30 °C und Erntezellen in der spätexponentiellen Phase. Für Isolate, die pGFP beherbergen, fügen Sie Spectinomycin (50 g mL^-1) hinzu, um das Plasmid zu erhalten.
2. Zentrifugieren Sie eine 1 ml Aliquot von Zellen bei 2500 x g für 3 min, entfernen Sie den Überstand und setzen Sie die Zellen in 1 ml gefiltertem künstlichem Meerwasser wieder auf. Wiederholen Sie diesen Schritt.
3. Verhungern Sie die Population von V. ordalii auf einem Orbital-Shaker (600 Rpm) bei 30 °C für 3 h.
4. Bereiten Sie eine künstliche Meerwasserlösung von 10 mM (hier, 1 ml) 4-Methoxy-7-Nitroindolinyl-Käfig- L-Glutamat (MNI-kaltert-L-Glutamat)vor und lagern Sie bei -20 °C.
   HINWEIS: Schützen Sie die MNI-Käfig-L-Glutamat-Lösung vor Umgebungslicht, um eine Photolyse zu verhindern.
5. Verdünnen Sie die Zellen 50x, indem Sie die ausgehungerten Zellen in einerkünstlichen Meerwasserlösung von 1 mM MNI-Käfig-L-Glutamat wieder aufhängen.
   HINWEIS: Dadurch wird eine endgültige Bakterienkonzentration unter 5 x 10⁷ ml^-1 sichergestellt (der genaue Wert hängt von der Anfangskonzentration der Zellen im späten Exponential ab, die typischerweise 10⁹ ml^-1beträgt). Die bakterielle Konzentration wurde mit einem Spektralphotometer bei einer optischen Dichte (OD) von 600 nm geschätzt.

4. Kalibrierung des Unkaging-Protokolls

1. Legen Sie ein Tröpfchen (20 l) einer künstlichen Meerwasserlösung von MNI-Käfig-L-Glutamat²⁰ bei einer Konzentration C₀ = 10 mM auf eine Glasrutsche. Verkapseln Sie den Tröpfchen, indem Sie ihn mit einer kreisförmigen PDMS-Kammer bedecken (Durchmesser d = 5 mm, Höhe h = 250 m).
2. Stellen Sie den Glasschlitten auf eine Mikroskopstufe und setzen Sie die gesamte Kammer für 20 ms einem LED-Strahl bei einer Wellenlänge von 395 nm (Leistung 295 mW) mit einem 4x Objektiv (numerische Blende [NA] = 0,13) aus.
3. Öffnen Sie die PDMS-Kammer und extrahieren Sie ein Tröpfchen (1 L) zur Analyse mit einem UV-Vis Spektralphotometer.
4. Wiederholen Sie die Schritte 4.1 x 4.3 für verschiedene Daueren der LED-Beleuchtung von 0,1 s, 0,5 s, 2,5 s, 25 s, 250 s (oder bis zur Sättigung der chemischen Reaktion) und 0 s (um den Hintergrund zu erhalten). Replizieren Sie die Prozedurschritte 4.1 x 4.4 mindestens 3x (hier 4x).
5. Aus dem Absorptionsspektrum extrahieren Sie den Wert bei 405 nm, der den Peak im Absorptionsspektrum des Käfigmoleküls²¹darstellt. Um die Rate k der chemischen Unkaging-Reaktion durch die LED-Exposition¹⁴zu bestimmen, verwenden Sie die folgende Kinetikgleichung erster Ordnung für die numerische Anpassung der experimentellen Daten¹⁷
   
   wobei C(t) der Wert des Absorptionsspektrums der Lösung bei 405 nm (nach Hintergrundentfernung) mit einer unkapaten Zeit von t Sekunden ist. Für kleine Unkaging-Zeit t so, dass kt 1, Eq. 1 kann auf die lineare Formulierung vereinfacht werden
   

5. Single Chemical-Pulse Experiment

1. Halten Sie den mikrofluidischen Kanal 20 min unter Vakuum, um die Gaskonzentration innerhalb des PDMS zu reduzieren, so dass sich Blasen während des Füllprozesses weniger wahrscheinlich bilden.
2. Extrahieren Sie den Kanal aus der Vakuumpumpe und führen Sie sofort dieverdünnte bakterielle Suspension in 1 mM MNI-Käfig-L-Glutamat in künstlichem Meerwasser in den Mikrokanal sanft mit einer Mikropipette ein, um Flagellarschäden durch mechanische Scherkräfte zu vermeiden (hier dauerte der gesamte Füllvorgang 5-10 s). Nachdem Sie den Kanal mit der bakteriellen Suspension gefüllt haben, saugen Sie die Lösung im Übermaß mit Papiertuch und versiegeln Ein- und Auslass mit PDMS-Steckern, indem Sie sie vorsichtig in die Löcher drücken.
   HINWEIS: Auf diese Weise wird der Flüssigkeitsfluss in der Kammer verhindert.
3. Legen Sie den Mikrokanal auf eine Mikroskopstufe und bewegen Sie die Bühne, um das Sichtfeld in der Mitte des Kanals zu setzen. Richten Sie das Mikroskop ein, um die Bildgebung im Phasenkontrast (4x Objektiv) mit einer Bildrate von 12 fps durchzuführen.
   HINWEIS: Dieser Wert kann variiert werden, sollte aber nicht weniger als 10 fps betragen, um die Rekonstruktion der bakteriellen Bahnen durch Bildanalyse zu ermöglichen (siehe Protokollabschnitt 7).
4. Stellen Sie das Loch des LED-Strahls auf die minimale Blende ein. Durch Festlegen der Belichtungszeit der Kamera auf 5 s können Sie einige Frames aufzeichnen, um präzise Messungen der räumlichen Position und Größe des LED-Strahls zu erhalten.
   HINWEIS: Die LED-Lichtquelle wird über eine Flüssigkeitslichtführungsverbindung mit dem Epifluoreszenz-Beleuchtungsgerät des Mikroskops verbunden. Der LED-Strahl hat keinen Einfluss auf die Videoaufnahme, da Videoaufnahme und LED-Stimulation unabhängig über Software geleitet werden.
5. Führen Sie eine kontinuierliche Bildgebung für eine Gesamtdauer von 10 min (20 min für den größten chemischen Impuls) durch und aktivieren Sie gleichzeitig den fokussierten LED-Strahl bei 395 nm für die gewünschte Dauer (in diesem Experiment t = 20 ms, 100 ms, 500 ms) zu einem benutzerdefinierten Zeitpunkt (hier 10 s nach Beginn der Videoaufnahme) über Mikroskopsoftware. Um mehrere Replikationen desselben Prozesses zu erhalten, bewegen Sie die Bühne, um die bakterielle Reaktion über verschiedene Positionen des mikrofluidischen Kanals aufzuzeichnen. Replizieren Sie dieses Verfahren für jede Pulsgröße mit einem neuen Mikrokanal.
   HINWEIS: Der Uncaging-Prozess erzeugt einen axisymmetrischen zylindrischen Impuls, der in der Bildebene radial nach außen diffundiert.
6. Führen Sie separate Experimente ohne chemische Unkaging bei höherer Vergrößerung (20x Objektiv, NA = 0,45) mit einer höheren Bildrate (50 fps) durch, um die unvoreingenommene Schwimmbewegung der Bakterien aufzuzeichnen.

6. Mehrere chemisch-pulsige Experimente

1. Bewahren Sie die Millifluidische Kammer 20 min unter Vakuum auf.
2. Legen Sie die Petrischale mit der Millifluidischen Kammer auf eine Mikroskopstufe. Füllen Sie die Kammer unterhalb der Membran mit der verdünnten bakteriellen Suspension (hier dauerte der gesamte Füllvorgang 10-15 s) gfP-fluoreszierender V. ordalii in 1 mM MNI-Käfig- L-Glutamatlösung in künstlichem Meerwasser. Nachdem Sie den Kanal mit der bakteriellen Suspension gefüllt haben, saugen Sie die Lösung im Übermaß mit Papiertuch und versiegeln Ein- und Auslass mit PDMS-Steckern, indem Sie sie vorsichtig in die Löcher drücken.
   HINWEIS: Auf diese Weise wird der Flüssigkeitsfluss in der Kammer verhindert. Um eine bessere Visualisierung von Bakterien in diesem Setup zu ermöglichen, in dem die Bildgebung durch die nanoporöse Membran erfolgt, wird dringend empfohlen, fluoreszierende Stämme anstelle des Wildentyps zu verwenden (wie im Einzel-Chemie-Puls-Experiment verwendet).
3. Füllen Sie eine Spritze mit einer künstlichen Meerwasserlösungvon 1 mM MNI-Käfig-L-Glutamat und befestigen Sie Schläuche am Ein- und Auslass des Waschkanals über der Membran.
4. Schließen Sie die Schläuche an ein Abfallreservoir an und stellen Sie sicher, dass die Schläuche vollständig in das Flüssigkeitsabfallreservoir eingetaucht sind, um Druckschwankungen zu vermeiden.
5. Stellen Sie die entsprechende Durchflussrate auf der Spritzenpumpe ein (hier 50 l min^-1), um die gewünschte mittlere Durchflussrate im Waschkanal zu erhalten, die von der Kanalgeometrie abhängt.
6. Starten Sie die Spritzenpumpe, um den Durchfluss im Waschkanal über der Membran zu ermitteln.
7. Führen Sie die Software aus, die den LED-Strahl und die Mikroskopstufe steuert, um benutzerdefinierte Pulssequenzen an verschiedenen Orten und mit unterschiedlichen Intensitäten zu erzeugen.
   HINWEIS: Der kontinuierliche Fluss der künstlichen Meerwasserlösung von 1mM MNI-Käfig-L-Glutamat im Waschkanal über der Membran füllt die Käfig-Verbindungslösung auf und wäscht das verbrauchte Medium aus der Bakterienarena.
8. Nehmen Sie Videos mit einem 4x Objektiv in regelmäßigen Zeitintervallen über einen Zeitraum von mehreren Stunden und über mehrere zusammenhängende Stellen auf, um eine große Oberfläche zu bedecken (hier 1 cm x 1 cm, Abbildung 1F).

7. Bildanalyse und Datenanalyse

1. Rekonstruktion der bakteriellen Bahnen
   1. Aus den Filmen mit dem 4x Objektiv aufgenommen, rekonstruieren Sie die bakteriellen Bahnen mit Tracking-Software¹⁷.
      HINWEIS: Diese Bahnen stellen die 2D-Projektionen der 3D-Bakterienbewegung im Mikrokanal dar.
   2. Aus den rekonstruierten bakteriellen Flugbahnen wird die radiale Driftgeschwindigkeit jedes Schwimmenden bestimmt, indem man seine Schwimmgeschwindigkeit über die Richtung in Richtung des Zentrums des chemischen Impulses projiziert (Abbildung 2D). Für die Visualisierung der räumlich-zeitlichen Dynamik der radialen Driftgeschwindigkeit verwenden Sie ein Binning-Raster mit der räumlichen Größe 75 x 75 m und einem zeitlichen Fenster mit einem Intervall von 5 x 10 s(Abbildung 2D,E).
      HINWEIS: Aufgrund der zylindrischen Symmetrie des Prozesses können die Daten in Polarkoordinaten analysiert und über die Winkelbemaßung gemittelt werden (Abbildung 3).
   3. Aus den rekonstruierten bakteriellen Bahnen, bestimmen Sie die räumlich-zeitliche Dynamik der Verteilung von Bakterien, wie sie auf die chemischen Impulse reagieren (Abbildung 2E).
   4. Aus den höher auflösenden Filmen, die mit dem 20-fachen Ziel während der Einpulsexperimente aufgenommen wurden, extrahieren Sie die Verteilung der Schwimmgeschwindigkeit und der Laufzeit für die Bakterienpopulation, wenn sie auf den chemischen Puls reagieren (Abbildung 4).
2. Schätzen Sie den Diffusionskoeffizienten von Bakterien unter Berücksichtigung der Ableitungsdynamik der Bakterienpopulation, nachdem Chemotaxis abgeschlossen ist¹⁷ (hier für t > 300 s; Abbildung 3).
3. Schätzen Sie den Diffusionskoeffizienten von Glutamat, indem Sie die Stokes-Einstein-Gleichung anwenden
   
   wobei davon ausgegangen wird, dass es sich bei den Aminosäuremolekülen um kugelförmige Partikel mit hydrodynamischem Radius²²r_Ghandelt, k_B die Boltzmann-Konstante (1,38 x 10^-23 m² kg s^-2 K^-1), T ist die Temperatur (296 K) und die dynamische Viskosität des künstlichen Meerwassers (Salzgehalt 36 g kg^-1) bei 23 °C (10^-3 Pa s)²³

Ergebnisse

Wir verwendeten die mikrofluidischen und millifluidischen Geräte (Abbildung 1), um bakterielle Akkumulationsprofile unter dynamischen Nährstoffbedingungen zu untersuchen. Bakterielle Flugbahnen wurden aus aufgezeichneten Videos extrahiert, die durch Phasenkontrastmikroskopie der Akkumulations-Ableitungsdynamik einer bakterienpopulation nach einem durch Photolyse freigesetzten chemischen Impuls aufgenommen wurden (Abbildung 2 und Abbildung ...

Diskussion

Diese Methode ermöglicht es Forschern, bakterielle Chemotaxis unter kontrollierten, dynamischen Gradienten in mikro- und millifluidischen Geräten zu untersuchen und so eine reproduzierbare Datenerfassung zu ermöglichen. Die nahezu sofortige Erzeugung chemischer Impulse im Mikromaßstab durch Photolyse zielt darauf ab, die Arten von Nährstoffpulsen, denen Bakterien in freier Wildbahn begegnen, aus einer Reihe von Quellen zu reproduzieren, zum Beispiel die diffusive Ausbreitung von Pflaumen hinter sinkenden Meeresparti...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
(3-Aminopropyl) triethoxysilane (APTES)	Sigma-Aldrich	A3648	>98% purity, highly toxic
CELLSTAR tube	Greiner Bio-One	210261	50 ml
Centrifuge	Eppendorf	5424R	to eliminate spent media from the bacterial culture
Digital Incubators Incu-Line	VWR-CH	390-0384	to bake 3D master
Duster	VWR-CH	16650-22	to clean the wafer and microchannels
Hot plate	VWR-CH	444-0601	to bond the microchannels
Isopropanol	Sigma-Aldrich	W292907
LightSafe micro centrifuge tubes	Sigma-Aldrich	Z688312	1.5 ml
MATLAB	Mathworks		for image analysis and bacterial tracking
Microcentrifuge tube	Eppendorf	30120086	1.5 ml
Microscope glass slide	VWR-CH	631-1552
Microscope Nikon Eclipse TiE	Nikon Instruments	MEA53100	with motorized stage
MNI-Glutamate	Tocris Bioscience	1490	>98 % purity, photosensitive
Mold printing equipment	Stratasys		Objet30 3D printer
Mold printing service	3D Printing Studios	Custom	https://www.3dprintingstudios.com/
Nanodrop One UV-Vis Spectrophotometer	Thermo Fisher Scientific	ND-ONE-W	to calibrate the uncaging
NIS Elements	Nikon Instruments		Microscope Imaging Software
Oven Venti-Line	VWR-CH	466-3516	to bake PDMS (with forced convection)
Photoresist SU-8-3050	MicroChem Corp.	SU8-3050
Plasma chamber Zepto	Diener Electronic	ZEPTO-1	to functionalize the surfaces before bonding
Polycarbonate membrane	Sterlitech	PCT0447100	0.4 µm pore size, 19 % open area, 24 µm thickness
Polyethylene microtubing	Scientific Commodities	BB31695-PE/2	I.D. x O.D.: 0.015" x 0.043" / 0.38mm x 1.09mm
Polystyrene Petri dish	VWR-CH	25373-100	bottom surface (90 mm x 15 mm) to bond the millifluidic device
Scale	VWR-CH	611-2605	to weight PDMS mixture
sCMOS camera Andor Zyla	Oxford Instruments		for phase contrast and fluorescence microscopy (max 100 fps)
Sea salt	Instant Ocean	Product No. SS1-160p
SolidWorks 2015	Dassault Systemes SolidWorks		Used to design the mold
Spectra X light engine	Lumencolor		for LED 395 nm
Sylgard 184	Dow Corning	110-41-155	PDMS Si Elastomer Kit; curing agent
Syringe (Luer-Lok)	B Braun Omnifix	4616308F
Syringe Needle	Agani	A228	from 10 to 30 ml
Syringe Pump 11 Pico Plus Elite	Harvard Apparatus	70-4506	Terumo Agani 23 gauge 5/8 inch (16mm)
VeroGrey	Stratasys		Dual Syringe Pump
Vortex-Genie	Scientific Industries	SI-0236	Mold Material