PeptiQuick ، خطوه واحده لدمج البروتينات الغشائية في أقراص البيتيلات الحيوية لاختبارات ربط البروتين الانسيابية

Summary

نقدم طريقه تجمع بين تنقيه البروتين الغشائي وأعاده التشكيل إلى أقراص البيتيغرافيه في خطوه واحده للكروماتوغرافي. وتستخدم السقالات الحيوية للحصول علي المرفق السطحي المباشر وقياس التفاعلات البروتينية والبروتينات عن طريق قياس التداخل الحيوي.

Abstract

البروتينات الغشائية ، بما في ذلك الناقلات والقناات والمستقبلات ، تشكل ما يقرب من ربع البروتينية الخلوية وأكثر من نصف الأهداف الحالية للمخدرات. ومع ذلك ، فان أحد العوائق الرئيسية التي تحول دون توصيفها واستغلالها في الأوساط الاكاديميه أو الصناعية هو ان معظم استراتيجيات الفحص البيوكيميائية والبيوفيزيائية والدوائية تتطلب ان تكون هذه البروتينات في حاله قابله للذوبان في الماء. طور مختبرنا مؤخرا البيتيديسك ، وهو الغشاء الذي يقدم نهج "مقاس واحد يناسب الجميع" لمشكله ذوبان البروتين الغشائي. نقدم هنا بروتوكولا مبسطا يجمع بين تنقيه البروتين وأعاده تشكيل البيتيديسك في خطوه واحده للكروماتوغرافي. هذا سير العمل ، وتسمي PeptiQuick ، يسمح لتجاوز غسيل الكلي والحضانة مع الخرز البوليسترين ، التالي الحد بشكل كبير من التعرض للتنظيف ، والبروتين التشبع ، وفقدان العينة. عندما يتم تنفيذ PeptiQuick مع السقالات الحيوية ، يمكن ربط الاعداد مباشره بالأسطح المغطية بالمكورات العقديه. ليست هناك حاجه إلى التعكر الحيوي أو تعديل هدف البروتين الغشاء. يتم عرض PeptiQuick هنا مع مستقبلات الغشاء FhuA ومضادات الميكروبات الليكوليسين M ، وذلك باستخدام قياس التداخل بالشكل الدقيق لتحديد الحركية الدقيقة للتفاعل بينهما. ويخلص إلى ان PeptiQuick هو وسيله مريحه لاعداد وتحليل غشاء البروتين-ligand التفاعلات في غضون يوم واحد في بيئة خاليه من المنظفات.

Introduction

وغالبا ما تستبعد البروتينات غشاء من المخدرات أو الأجسام المضادة اكتشاف البرامج البحثية بسبب الميل من البروتينات الغشاء لتجميع خارج البيئة الدهنية الطبقات ، وخاصه في وجود المنظفات¹. ولذلك ، في السنوات الاخيره ، تم تطوير العديد من المحاكاة الغشائية (تسمي السقالات) لتسهيل العزلة والاستجواب من البروتينات الغشائية في بيئة خاليه تماما من المنظفات (اي ، أقراص النانو ، SMALPs ، البرمائيات ، الخ) ^{2،3،4،5،6}. ومع ذلك ، فان أعاده تكوين البروتينات الغشائية في هذه الميميتيكس غالبا ما يتطلب التحسين الشامل ، والذي يستغرق وقتا طويلا ويرافقه عموما مع فقدان البروتين الانتعاش^7،8. وللتغلب علي هذه القيود ، طور مختبرنا مؤخرا صيغه "مقاس واحد يناسب الجميع" تعرف باسم بيبتيديسك⁹. يتم تشكيل peptidisc عندما نسخ متعددة من مصمم 4.5 ده البرمائية البرمائيات ربط الببتيد إلى سطح مسعور من بروتين الغشاء المستهدف. أعاده مستقره في البيتيديسك يحدث عند أزاله المنظفات ، والدخول علي حد سواء الدهون الذاتية والبروتينات الغشاء solubilized في جزيئات قابله للذوبان في الماء. هذه الجزيئات استقرت الآن قابله للعديد من التطبيقات المصب.

طريقه peptidisc يقدم العديد من المزايا; علي سبيل المثال ، أعاده التشكيل واضحة ، حيث ان ربط سقالة البيتيديسك علي الهدف يسترشد بقالب البروتين نفسه^9،10. القياس الببتيد هو أيضا تحديد الذات ، وأضافه الدهون الخارجية ليس من الضروري. تكوين البيتيديسك يحدث عن طريق تخفيف المنظفات بسيطه ، ميزه هامه علي غسيل الكلي أو الامتزاز علي الخرز البوليسترين ، والتي غالبا ما تؤدي إلى انخفاض البروتين الغلة بسبب غير محدده الجمعية السطحية والتجميع^{11،12 ،13}. الجمعية بيبتيديسك النهائي هو حراريا للغاية وقابل للذوبان دائما في مخازن مختلفه أو في وجود الكاتيونات ثنائي التكافؤ (علي سبيل المثال ، Ni^{2 +}). نقاء وتجانس الهيكلية للسقالة هو أيضا عاليه (علي سبيل المثال ، اندوتوكسين خاليه) ، ويمكن تخصيص الببتيد مع المجموعات الوظيفية وضعت في مواقف مختلفه.

نحن نقدم هنا سير عمل المختبر يسمي PeptiQuick ، والمعروف أيضا باسم الخرز أعاده تشكيل⁹. يجمع هذا البروتوكول بين تنقيه البروتين الغشائي وأعاده تكوين البيتيديسك في خطوه واحده وعلي نفس الدعم الكروماتوغرافي. وكما يشير الاسم ، فان PeptiQuick سريع مقارنه بطرق أعاده التشكيل الأخرى ، كما انه يقلل بشكل خطير من وقت التعرض للتنظيف. اثار المنظفات السلبية مثل البروتين تتكشف والتراكم غالبا ما تحدث بطريقه تعتمد علي الوقت; لذلك ، التقليل من التعرض للتنظيف أمر بالغ الاهميه للمحافظة علي البروتين الأصلي^14،15. وهذا أمر بالغ الاهميه لدقه الطرق التي تبلغ عن تفاعلات البروتين وأوجه التقارب الملزمة.

اثناء تطوير هذا البروتوكول ، ونحن نقدم رواية النسخة الحيوية من سقالة peptidisc ، وتسمي بيو بيبتيديسك. المجموعات الوظيفية البيوتين تسمح المرفق من البروتين الغشاء المستهدف علي الأسطح المغلفة العقديات. منذ الوسم البيوتين يقتصر علي سقالة ، ومواقع ملزمه علي البروتين الغشاء الهدف تبقي دون تغيير. باستخدام بيو-بيبتيديسك ، يتم تحديد حركيه ملزمه من مستقبلات الغشاء البكتيري FhuA ومضادات الميكروبات كوليسين M (ColM)¹⁶. ويقاس هذا التقارب عن طريق قياس التداخل البسيط (BLI) ، الذي يحلل التفاعلات في الوقت الحقيقي استنادا إلى أنماط تداخل الضوء الأبيض المنعكسة من طرف مستشعر.

باستخدام هذا البروتوكول ، يتم التخلص من الحاجة إلى المنظفات اثناء تحليل BLI ، وهو تطور مهم ، حيث ان المنظفات يمكن ان تعطل التفاعلات. ويمكن قياس أوجه التقارب الملزمة بسرعة بهذه الطريقة ، وتكون النتائج مماثله لتلك التي ابلغ عنها في وقت سابق باستخدام أقراص النانو والمعايرة الحرارية للقياس الحجمي (ITC)¹⁶. يتم عرض الخطوات الهامه في سير العمل PeptiQuick ومناقشتها ، مثل اعداد البروتين ، وتخفيف المنظفات ، وأضافه الببتيد ، وأعاده التشكيل ، إلى جانب نصائح لاستكشاف الأخطاء المرتبطة بالربط والتحلل في فحص BLI. باستخدام سير العمل PeptiQuick ، وجد ان البروتينات الغشائية يمكن التقاطها في أقراص البيتينات وتفاعلاتها تقاس في غضون يوم واحد.

Protocol

1. اعداد والاذابه من مستقبلات الغشاء FhuA

1. أعرب له₆-الموسومة fhua في القولونية سلاله AW740. تنمو الخلايا ل 18 ح في 37 درجه مئوية في وسائل الاعلام مسنومكس (الجدول 1). انظر المطاحن وآخرون¹⁶ للحصول علي بروتوكول تعبير مفصل.
2. حصاد الخلايا بواسطة طرد (5,000 x g، 10 دقيقه ، 4 درجه مئوية) وأعاده التعليق عليها في 50 ML من تريس-الملح-الجلسرين (tsg) العازلة (الجدول 1). قم باعاده الخلايا المعاد تعليقها وأضف الفلوريد (PMSF) إلى تركيز نهائي من 1 مم قبل تحلل.
   تحذير: PMSF سامه وقابله للتاكل.
3. Lyse الخلايا باستخدام microfluidizer (ثلاثه مقاطع) في 15,000 psi أو الصحافة الفرنسية (ثلاثه مقاطع) في 8,000 psi. بيليه الخلايا unlysed وغيرها من المواد غير قابله للذوبان بواسطة طرد منخفضه السرعة (5,000 x g، 10 دقيقه ، 4 درجه مئوية).
4. الطارد الفائق (200,000 x g، 40 دقيقه ، 4 درجه مئوية) لعزل جزء الغشاء الخام. تجاهل supernatant ، وأعاده تعليق بيليه غشاء في الحد الأدنى من المخزن المؤقت TSG ، والدوس باستخدام الزجاج أو المعدن جهاز اللحام لضمان التجانس.
5. اجراء فحص برادفورد للتحقق من تركيز البروتين من الغشاء الخام المعاد تعليقه. تمييع الغشاء الخام إلى تركيز نهائي من 3 مغ/مل باستخدام العازلة TSG قبل الذوبان.
6. أضافه المنظفات تريتون X-100 إلى تركيز نهائي من 1 ٪ (v/v) لأذابه انتقائية الغشاء الداخلي البكتيري ل 1 ح في 4 درجه مئوية مع هزاز لطيف. بيليه المواد غير قابله للذوبان (جزء الغشاء الخارجي) من قبل نبذ حلول (200,000 x g، 40 min ، 4 درجه مئوية).
7. تجاهل ماده طافي التي تحتوي علي الغشاء solubilized وأعاده تعليق بيليه في tsg إلى تركيز نهائي من 3 ملغ/مل. أضافه أكسيد اللويلديميثيلاميني (LDAO) إلى تركيز 1% (v/v) علي كسر الغشاء الخارجي المعاد تعليقه والاذابه لمده 1 ساعة عند 4 درجه مئوية مع هزاز لطيف.
8. تنفيذ خطوه طرد النهائي إلى بيليه جميع المواد غير قابله للذوبان (200,000 x g، 40 min ، 4 درجه مئوية).
   ملاحظه: الناتجة ماده طافي يحتوي علي البروتينات الغشاء الخارجي solubilized ، بما في ذلك الهدف fhua له الموسومة.

2. تنقيه وأعاده تشكيل FhuA باستخدام سير العمل بيبتيكويك

1. قبل تتوازن a معبا العمود Ni-NTA (5 مل حجم الراتنج) مع اثنين من مجلدات العمود من المعادن غير المعبئة تقارب اللوني (ايماك) غسل العازلة (الجدول 1).
2. تمييع الغشاء الخارجي solubilized من 1 ٪ LDAO إلى 0.04 ٪ LDAO باستخدام TSG. ثم ، أضافه ايميدازول إلى تركيز نهائي من 5 ملم.
   تحذير: ايميدازول سام ومسبب للتاكل.
3. تحميل البروتينات الغشاء الخارجي solubilized علي الراتنج ني-NTA وجمع تدفق. أعاده تحميل الجريان علي الراتنج لزيادة ملزمه الراتنج FhuA وجمع تدفق الثانوية.
   ملاحظه: الحفاظ علي 20 μl قسامه من المواد solubilized كمرجع للتحليل في وقت لاحق الصوديوم دوديسيل كبريتات بولياكرياميد هلام الكهربائي (SDS-PAGE) تحليل.
4. غسل الراتنج مع 250 mL من ايماك العازلة وجمع أول 50 مل من التملص. استنزاف العازلة الغسيل إلى ارتفاع حجم السرير الراتنج وإغلاق محبس علي العمود.
5. أضافه 1 مل من مركزه 10 ملغ/مل الحيوي بيبتيديسك الببتيد الحل (الجدول 1) إلى العمود. أضافه 50 mL من تمييع 1 ملغ/مل الحيوي البيتيديسك الببتيد محلول في TSG ويحرك الراتنج مع قضيب زجاجي لأعاده تعليق الخرز في TSG.
6. بعد الملائمة للبيبتيديسك ، والسماح للراتنج لتسويه واستنزاف الزائدة 1 مغ/مل الحيوي-Peptidisc الحل من خلال الراتنج.
7. غسل الجسيمات peptidisc المرفقة ني-NTA مع 50 mL من TSG. Elute جزيئات البيتيديسك مع 15 مل من المخزن المؤقت ايماك الشطف (الجدول 1) التي تحتوي علي 600 mM ايميدازول في tsg. جمع 1 مل الكسور وأضافه علي الفور 10 μL من 0.5 M أدتا إلى مخلب أيونات النيكل.
   تحذير: أدتا هو مهيج.

3-تقييم عمليه أعاده تشكيل البيتيكويك

1. تحليل الصفحات المخزونة
   1. تحميل 10 μl قسامات من المواد البداية ، flowthrough ، يغسل (es) ، والأجزاء التي لا يمكن التملص منها من تشكيل peptiquick علي 12 ٪ SDS-ديكاتبورينج هلام و اليكتروفوريس لمده 30 دقيقه في تيار مستمر من 60 mA.
   2. وصمه عار هلام مع صبغ الأزرق كوماسي ، destain الهلام ، وتصور علي الماسح الضوئي.
2. الفصل اللوني لاستبعاد الحجم (SEC)
   1. استنادا إلى تحليل الصفحات 12 ٪ من أعاده تشكيل بيبتيكويك ، عزل وتجميع الكسور ذات الصلة ، والتركيز عليها باستخدام 30 المكثف الطرد المركزي للقطع.
      ملاحظه: في الفيديو المصاحب ، يتم تجميع الكسور F3-F7 معا وتتركز تحت 1 مل (حجم حلقه الحقن علي الجهاز SEC).
   2. حقن ~ 1 مل من الكسور ايماك المجمعة علي هلام الترشيح S200 (300/10) عمود بمعدل تدفق 0.25 mL/min في المخزن المؤقت TSG. جمع 1 مل من الكسور وتشغيلها علي 12 ٪ من هلام SDS لتحديد الكسور SEC إلى تجمع والتركيز.
      ملاحظه: قد يتم تجميع الكسور PeptiQuick التي يتم التملص منها دون تركيز ، وقد يتم حقن اليكووت علي SEC للتحقق من جوده أعاده التشكيل. هذا هو عنصر تحكم هام للبروتينات الغشائية التي يحتمل ان تكون حساسة للتجميع اثناء تركيز الطرد المركزي.

4-قياس التداخل بالبياير

1. الاعداد التجريبي ل BLI
   1. اعداد لوحه البئر 96 باليد.
      ملاحظه: يتم تعبئة جميع الآبار إلى الحجم النهائي من 200 μL.
   2. في العمود 1 ، الصفوف ا − E ، تحميل 200 μL من المخزن المؤقت حركيه للسماح تلميحات لتتوازن وتشكيل اشاره الأساس.
   3. تمييع يجند (fhua في بيو-بيبتيديسك) إلى تركيز 2.5 ميكروغرام/مل في العازلة حركيه (الجدول 1). تحميل 200 μL من هذا التخفيف إلى صفوف ا − D في العمود 2.
   4. أضافه 200 μL من المخزن المؤقت الحركية فقط إلى E2 (مستشعر المرجع).
   5. أضافه 200 μL من المخزن المؤقت حركيه إلى العمود 3 ، صفوف ا − E لغسل FhuA الزائدة من الطرف.
   6. في العمود 4 ، اجراء التخفيفات التسلسلية مرتين من التحليلية (ColM) أسفل اللوحة من A4 إلى D4. تبدا مع 28 نانومتر (8 * Kd) في A4 إلى 3.5 nM (1 * Kd) في D4.
   7. أضافه 28 نانومتر ColM إلى E4 لقياس لربط غير محدده (اعلي تركيز ColM المستخدمة).
   8. أضافه 200 μL من المخزن المؤقت للحركية إلى العمود 5 ، صفوف ا − E.
      ملاحظه: هنا ، سيتم فك الColM من الطرف ، ويتم قياس التفكك.
   9. ضع لوحه الاعداد في أداه BLI.
   10. ضع صينية طرف المستشعر في أداه BLI.
   11. افتح برنامج الحصول علي بيانات BLI وحدد تجربه حركيه جديده علي معالج البرامج.
   12. استخدام علامة التبويب تعريف لوحه لإدخال تخطيط لوحه جيدا 96 في البرنامج.
       ملاحظه: الآبار التي تحتوي علي ligand ، fhua يتم إدخالها ك "تحميل". الآبار التي تحتوي علي المخزن المؤقت فقط يتم إدخالها ك "المخزن المؤقت". الآبار التي تحتوي علي التحاليل ، ColM ، يتم إدخالها علي انها "العينة".
   13. استخدم علامة التبويب تعريف الفحص لتحديد طول الوقت وسرعه دوران اللوحة لكل خطوه في التجربة.
       ملاحظه: يتم اعداد الخطوات التجريبية ك: 1) الأساس: 60 s; 2) التحميل: 250 s ؛ 3) للأساس 2:300 s ؛ 4) الجمعية: 450 s ؛ و 5) التفكك: 900 s. اترك سرعه الاهتزاز كافتراضي (1,000 دوره في الدقيقة). يتم تعيين الخطوات المذكورة أعلاه بشكل فردي لكل عمود في لوحه البئر 96 عن طريق تحديد الخطوة المطلوبة وانقر بزر الماوس الأيمن فوق أضافه خطوه فحص علي كل عمود.
   14. تعيين الخطوة الاولي عن طريق النقر بزر الأيمن علي العمود الأول وحدد بدء فحص جديد. تاكد من تعيين خطوه الأساس بشكل صحيح باستخدام اطار ايمن السفلي والتغيير مع القائمة المنسدلة حسب الحاجة.
   15. تعيين الخطوات التالية لكل عمود عن طريق النقر بزر الأيمن علي طول لوحه وتحديد أضافه الفحص الخطوة. تعيين هذه إلى العمود المناسب ، كما هو موضح في الخطوة 4.1.13.
   16. استخدم علامة التبويب تعيين المستشعر للتاكد من ان الاداه ثماني بتات تاخذ دبابيس BLI من الموقع الصحيح في علبه المستشعر.
       ملاحظه: في علامة التبويب تعيين المستشعر ، يجب ان يتم تمييز A1-E1 فقط باللون الأزرق. تاكد من وجود طرف مستشعر في هذه المواقع في درج المستشعر وتاكد من ان F1 − H1 فارغه.
   17. قم بتمييز F1 − H1 علي الشاشة ، ثم انقر بزر الماوس الأيمن وحدد أزاله لوضع علامة عليها كفارغه. القراد استبدال أجهزه الاستشعار في علبه بعد استخدامها للاحتفاظ أجهزه الاستشعار المستخدمة.
   18. في علامة التبويب تجربه المراجعة ، التي توفر نظره عامه نهائيه للتجربة قبل التنفيذ ، انتقل إلى الخطوات التجريبية للتاكد من صحة الاعداد بأكمله.
   19. في علامة التبويب تشغيل التجربة ، حدد موقع ملف لحفظ ملفات الأسلوب.
   20. تغيير درجه حرارة اللوحة إلى درجه حرارة الغرفة.
   21. حدد انتقال لتشغيل التجربة.
2. تحليل بيانات BLI
   1. افتح برنامج Octet BLI لتحليل البيانات.
   2. استخدم علامة التبويب تحديد البيانات لتحديد موقع التجربة والتحقق من الملخص التجريبي. استيراد ملف المشروع من موقع الحفظ الخاص به المعرفة اثناء الخطوة 4.1.19.
   3. إدخال تركيزات التحاليل (هنا ، ColM) عن طريق تحديد معلومات المستشعر لكل تجربه.
   4. تعيين التلميح في E1 كتلميح المرجع.
   5. استخدم علامة التبويب معالجه لطرح اشاره مرجعيه (E1) من البيانات التجريبية. تحقق من البيانات الاوليه من الطرف المرجعي للربط التحليلي غير المحدد. إذا لم يتم ملاحظه اي منها ، المضي قدما.
      ملاحظه: هذا عنصر تحكم سلبي هام. في حاله ملاحظه الربط غير المحدد ، سيتم احتساب ذلك في الخطوة 4.2.7.
   6. محاذاة المحور ص إلى الخطوة الاساسيه الثانية. لا تقم بوضع علامة علي الاتصال interstep. حدد تصفيه سافيتزكي-جولاي. حدد معالجه البيانات!.
   7. في علامة التبويب تحليل ، حدد البيانات التجريبية في الجدول أدناه المؤامرة لرؤية الاقتران ومنحنيات التفكك مع اشاره من مستشعر المرجع طرح.
   8. حدد نموذج الربط 1:1 وحدد المنحني الجزئي المناسب. حدد تناسب المنحنيات!.
   9. تحليل مؤامرة العرض المتبقية للتحقق من تركيب المنحني.
   10. مرر عبر الجدول لرؤية_الدالةK المحسوبة.
   11. حدد حفظ التقرير. .. لحفظ مستند جدول بيانات يفصل الاعداد والمخططات الاوليه وتحليلها وثوابت التفكك المحسوبة.

النتائج

يتم التعبير عن مستقبلات الغشاء FhuA في المختبر e. كولاي سلاله. يتم حصاد الجزء الغشاء الخارجي من قبل الطرد ، والبروتينات مذابه باستخدام استخراج المنظفات من خطوتين. يتم تحميل البروتينات غشاء solubilized علي الخرز Ni-NTA معباه في عمود من البلاستيك ، تليها سير العمل PeptiQuick كما هو مبين في البروتوكول. بعد مراقبه الجودة باستخدام الفصل اللوني الاستبعاد الحجم ، يتم تعبئة جزيئات بيو-بيبتيديسك علي دبابيس المغلفة العقديات. يتم اجراء تحليل BLI لقياس حركيه التفاعلات بين FhuA و ColM. ويرد العرض التخطيطي لهذه التجربة في الشكل 1.

يتم تشغيل هلام SDS لتحديد نوعيه أعاده تشكيل بعد التملص من الجزيئات FhuA بيو-بيبتيديسك من العمود IMAC (الشكل 2). يتم تحميل aliquots من الكسور المقابلة للبدء ، تدفق ، يغسل ، والأجزاء الشطف علي SDS-هلام لتقييم نجاح أسلوب PeptiQuick. ويرتبط استنزاف FhuA في كسر الجريان مع إثراء في الكسور الشطف ، مما يدل علي ان تنقيه البروتين كانت فعاله. لوحظت عصابات البروتين الملوث الصغيرة في الكسور التي لا يمكن التملص منها. يتم استخدام تحليل الهلام SDS لتحديد الكسور التي يجب تجميعها قبل تحليل SEC. يتم تشغيل هلام الأصلي من الجزيئات FhuA بيو-بيبتيديسك لتاكيد FhuA الذوبان (الشكل التكميلي 1). الهجرة من البروتين المعاد تشكيله في هلام الأصلي يشير إلى البروتين الذوبان في بيئة خاليه من المنظفات.

يتم اجراء تحليل SEC لتقييم قابليه الذوبان في جزيئات البيتيديسك. ويظهر الكروماتوجرام في الشكل 3A الذروة واحده متناظرة التملص في حوالي 14 مل (6 مل الماضية حجم الفراغ من 8.0 مل علي الترشيح هلام S200 10/300 العمود). موقف هذه الذروة ، في الماضي حجم الفراغ ، ويؤكد ذوبان جزيئات FhuA بيو-بيبتيديسك. للرجوع اليها ، يوضح الشكل 3B اعداد البيتيديسك النظري الأمثل. في هذه الحالة ، يظهر الكروماتوجرام ذروه البروتين الكبيرة التي تفلت من حجم الفراغ ، مما يشير إلى وجود مجاميع البروتين. الذروة أصغر التملص فقط الماضية الذروة peptidisc الرئيسية يتوافق مع الببتيدات بيبتيديسك الزائدة.

يتم تحديد التفاعل من FhuA مع ColM التحليلية بعد المرفق من البيتياقراص إلى أجهزه الاستشعار المغلفة العقديات. نصائح الاستشعار هي المعايرتها الاولي في العازلة الحركية ، ثم نقلها إلى العازلة التي تحتوي علي FhuA بيو-Peptidiscs. يتم تحسين تركيز الاقراص الحيوية FhuA وطول الفترة الزمنيه التي يتم احتضانها مع الطرف قبل هذه التجربة (الشكل التكميلي 1). بعد خطوات التحميل والغسيل ، خطوه الجمعية يقيس التفاعلات بين النصائح المحملة وأربعه تركيزات مختلفه من الكوليسين م. الحركة اللاحقة من النصائح مره أخرى إلى نتائج العازلة في التفكك ، والذي يقاس بواسطة التحول الطول الموجي من الضوء الأبيض تعكس قباله غيض.

الشكل 4A يعرض الناتج sensorgram البيانات الخام من هذه التجربة. تظهر كافة التتبعات الموحدة في خطوات التحميل والخط الأساسي ، باستثناء التتبع المرجعي باللون الأصفر. التلميح المرجعي لا يحتوي علي الاربطه ولكنه يتعرض للتحليل لفحصه للربط غير المحدد ، وهو عنصر تحكم سلبي هام. لمزيد من التحليل التفصيلي للنتائج ، يتم طرح الاشاره من التلميح المرجعي من الآثار الخاصة بالتلميحات التجريبية لحساب الربط غير المحدد. تتم محاذاة البيانات إلى بداية خطوه الاقتران للسماح باجراء مقارنه مرئية مباشره ، كما هو موضح في الشكل 4B. وتظهر هذه المقارنة زيادة في تحول الطول الموجي لزيادة تركيزات الكوليسين م. ويتناسب المنحني مع البيانات ويعرض نموذجا كلاسيكيا 1:1 ملزما.

وتبين مؤامرة العرض المتبقية (الشكل 4 ب، القاع) ، التي تصف الاختلافات بين البيانات المناسبة والتجريبية ، ان التركيب لاعلي تركيز لColM (28 نانومتر) ضعيف مقارنه بالتركيزات الثلاثة المنخفضة. يفتقر التشكيل الجانبي للمنحني نفسه إلى الهضبة المنحنية الملزمة ، والتي تعتبر سمه لتشبع الموقع الملزم في تجربه ربط نموذجيه. عدم وجود هضبة يوحي ملزمه غير متجانسة ، والتي من المحتمل ان تكون قطعه أثريه من تركيز ColM عاليه. التالي ، فان هذا التركيز الأعلى ColM مخصوم من التحليل ، وتستخدم التركيزات الثلاثة الأخرى لتحديد ثابت التفكك (الشكل 4ج ، د). اختبار tالطالب ثنائي الذيل ، علي مستوي الثقة 95 ٪ ، وجدت ان ثابت التفكك لوحظ من هذه التجربة لا يختلف كثيرا عن القيم التي تم الحصول عليها باستخدام تقنيات مختلفه (الشكل 4e)¹⁶.

الشكل 1: نظره عامه لسير العمل PeptiQuick باستخدام بيو-بيبتيديسك وتحليل BLI. يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.

الشكل 2: تحليل هلام المخزون (12%) من البداية ، وتدفق ، وغسل ، والأجزاء التملص التي تم جمعها من خلال سير العمل PeptiQuick. تم تحميل حوالي 10 μL من عينه في كل حاره وتشغيل لمده 30 دقيقه في تيار مستمر من 60 mA. كان الهلام ملطخا باللون الأزرق كوماسي ، والذي تمت رؤيته علي ماسح الجل. يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.

الشكل 3: لمحات تجريبية ونظرية للثانية تمثل أعاده الدساتير المثلي وشبه الأمثل ، علي التوالي. (ا) الملف التجريبي للثانية من بيبتيكويك المعاد تشكيلها (~ 82 ده) في الاقراص الحيوية. تم تجميع كسور الامتصاص من IMAC F3-F7 وتركيزها باستخدام مكثف الطرد المركزي الذي تم قطعه لمده 30 كيلو. تم حقن هذه العينة المركزة في 0.25 mL/min علي هلام الترشيح S200 (10/300) عمود في المخزن المؤقت TSG. (ب) النظرية SEC الشخصية لأعاده تشكيل بيبتيكويك دون الأمثل. يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.

الشكل 4: التحقيق في تفاعلات ColM مع FhuA المعاد تشكيلها في بيو-بيبتيديسك. (ا) البيانات الخام sensorgram مع اشاره استشعار تتبع باللون الأصفر. (ب ، ج) الأعلى: خطوات الاقتران والتفكك مع تركيب منحني ربط 1:1 جزئيا. الأسفل: الآراء المتبقية التي تصور الفرق بين البيانات التجريبية والتركيب الحسابي. (ج) أعاده زرع (ب) مع استبعاد اعلي تركيز لColM. (د) معدلات الاقتران والتفكك الملحوظة (k_on و k_off، علي التوالي) وثوابت التفكك (ك_د). (ه) مقارنه ثوابت التفكك fhua-ColM التي تم الحصول عليها بواسطة البيتيديسك و BLI (في هذه التجربة) ، البيتيديسك والمقياس المجهري لإدرار البول (saville ، البيانات غير المنشورة) ، والأقراص النانويه والمعايرة الحرارية¹⁶. تمثل أشرطه الخطا SD واحده من عدم اليقين ، بينما نوفاسكوتيا يدل علي عدم وجود فرق كبير في مستوي الثقة 95%. يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.

مسنومكس ميديا (لكل لتر)

200 mL الملح مسنومكس

800 مل dH2س

10 مل 40 ٪ الجلوكوز

80 μL 1 M CaCl2

2.5 mL 1 M MgSO مستقره4

300 μL 15 ملغ/مل الثيامين

TSG العازلة

50 مم تريس-HCl ، pH 7.8

50 mM NaCl

10% الجلسرين

IMAC غسل العازلة

50 مم تريس-HCl ، pH 7.8

50 mM NaCl

10 ٪ الجلسرين

0.04% LDAO

5 مم ايميدازول

الحيوي البيتيديسك الحل

تذوب الاقراص الحيوية الجاهزة للاستخدام (> نقاء 95%) في الدرجةالثانيةمن التعقيم بالدرهم الإماراتي. تركيز وحجم الحل الببتيد يعتمد علي الخطوة في عمليه أعاده تشكيل.

50 مم تريس-HCl ، pH 7.8

50 mM NaCl

ملاحظه: هذا المخزون الببتيد بيو-بيبتيديسك مستقره في 4 درجه مئوية لأكثر من شهر.

المخزن المؤقت IMAC الelution

50 مم تريس-HCl ، pH 7.8

50 mM NaCl

10% الجلسرين

600 مم ايميدازول

المخزن الحركي المؤقت

50 مم تريس-HCl ، pH 7.8

50 mM NaCl

0.002 ٪ توين-20

0.1 في المائة

الجدول 1: وصفات لاعداد وسائل الاعلام والحلول.

الشكل التكميلي 1:4% – 16% تحليل جل أصلي واضح لكسور الامتصاص التي تم جمعها من سير عمل PeptiQuick. تم تحميل حوالي 10 μL من عينه في كل حاره وتشغيل لمده 40 دقيقه في تيار ثابت من 30 مللي أمبير. كان الهلام ملطخا باللون الأزرق كوماسي ، والذي تمت رؤيته علي ماسح ضوئي. يرجى النقر هنا لتحميل هذا الرقم.

الشكل التكميلي 2: التحسين الأمثل للتركيز باستخدام دبوس واحد. (ا) التركيزات الستة المختلفة لل fhua في بيو-بيبتيديسك التي تم اختبارها للربط بدبوس واحد مغطي بالالعقديات. هذا كان ثبتت فوق في 96 بئر لوحه مع مخزن مؤقت في الآبار بين [ليغس] تركيزات (رايت اضافيه ملف 1 لاعداد بروتوكول). (ب) البيانات الاوليه sensorgram لتجربه التحسين الأمثل. دبوس يعطي أكبر استجابه الاضافه إلى ذلك يصل إلى التشبع في تركيز رقم 4 (أو 2.5 ميكروغرام/مل). يرجى النقر هنا لتحميل هذا الرقم.

ملف تكميلي 1. الرجاء انقر هنا لعرض هذا الملف (انقر بزر الماوس الأيمن للتحميل).

Discussion

في حين تبقي المنظفات ابسط طريقه لاستخراج وتنقيه البروتينات الغشائية ، يمكن ان يكون لهذه السطحية العديد من الآثار غير المرغوب فيها علي استقرار البروتين ، وظيفة ، وتحليلات المصب^{1،2،3، 4،5،6،7،8،9}. وقد حفزت هذه الصعوبات تطوير الاغشيه الغشائية ، والتي تسعي إلى التقليل من وجود المنظفات وتكرار بيئة الغشاء الأصلي قدر الإمكان^{2،3،4 و5و6}. بيد ان غالبيه أساليب أعاده التشكيل تتطلب تحسينا كبيرا في ظروف أعاده التشكيل وكثيرا ما تتطلب خطوات تنقيه اضافيه ، مما يخفض العائد النهائي^7و8. و peptidisc تتكيف تلقائيا مع البروتين الغشاء الهدف ونسبيا ، يتطلب التحسين قليلا وتنقيه المصب^9،10. في هذا البروتوكول ، يتم تقديم PeptiQuick كوسيلة بسيطه لتبسيط بروتوكول أعاده التشكيل لتحليل تفاعل البروتين والبروتين المصب.

علي الرغم من ان واضحة ، وهناك العديد من المحاذير التجريبية التي يمكن ان تؤدي إلى أعاده تشكيل غير ناجحه. من بين هذه, الأكثر شيوعا ويرجع ذلك إلى تراكم البروتين. ولذلك فمن الاهميه بمكان اجراء الفصل اللوني لاستبعاد الحجم لرصد عمليه أعاده التشكيل. علي سبيل المثال ، حجم الاستبعاد الذروة التملص في حجم الفراغ يدل علي مجاميع البروتين (الشكل 3 ب)^17،18. تتشكل مجاميع البروتين الغشائي عاده عند التعرض لفترات طويلة لظروف المنظفات دون الأمثل قبل أعاده التشكيل. علي وجه الخصوص ، تم العثور علي ان البروتينات الغشائية في المنظفات تميل إلى تشكيل المجاميع عندما تتركز عن طريق الترشيح الفائق علي أجهزه الطرد المركزي. في هذه الحالة ، يمكن ان تتركز البروتينات الغشاء الحساسة باستخدام فراغ فائقه الترشيح ، وهو أسلوب الطف وأكثر تجانسا من التركيز منذ الامتزاز من البروتينات إلى فلتر يتناقص.

بشكل عام ، لتجنب تركيز البروتين ، يجب تجميع كسور IMAC التي لا يمكن التملص منها ، وحقن القرص الصغير في عمود استبعاد الحجم للتحقق من جوده التشكيل. وتجدر الاشاره إلى ان الحرة غير المدمجة الببتيد التملص فقط بعد ذروه peptidisc الرئيسي (الشكل 3B). السقالة الحرة لا تعيق بالضرورة التجارب المصب. ومع ذلك ، إذا لزم الأمر ، يمكن أزاله هذا الفائض بواسطة اللوني استبعاد الحجم. بدلا من ذلك ، وزيادة حجم الغسيل اثناء أعاده تشكيل ، وقبل التملص من الراتنج ايماك ، هو ما يكفي لأزاله بشكل فعال معظم الببتيد بيبتيديسك الحرة. لذلك ، يوصي بالفصل اللوني لاستبعاد الحجم كوسيلة سريعة وبسيطه للتحقق من جوده أعاده التشكيل.

تتطلب تجربه BLI التحسين الدقيق لتركيزات الربط والتحاليل. يجب ان يكون ربط ligand كافيه للحصول علي اشاره واضحة ، ولكن الحمولة الزائدة سوف يسبب تشبع الاشاره ، مما يؤدي إلى التحف البيانات من الاكتظاظ والعوائق فراغي علي سطح الطرف. ولذلك ، فان كلا من تركيز الربط وطول الوقت الذي ينفقه الطرف في الحل يجب ان يكون أمثل لكل عينه بروتين (الشكل التكميلي 2). ويجب أيضا تحسين تركيز التحاليل. إذا كانت ثابته التفكك معروفه ، تصبح هذه الخطوة أسهل ، لأنه يمكن تقريب نطاق التركيز. نقطه انطلاق جيده لهذا التحليل هو استخدام تركيزات البروتين بين 0.1-و 20-اضعاف المتوقع¹⁹د. ك.

بعد الحصول علي بيانات BLI ، يجب اجراء تحليل دقيق للبيانات لتجنب سوء التفسير. يعتمد حساب ثابت التفكك علي احتواء منحني الربط. الا إذا كانت القياسات إلزاميه الملزمة معروفه بالفعل ، يجب استخدام نموذج التفاعل الكلاسيكي 1:1 ثنائيه الجزيئات للتركيب الاولي. وتجدر الاشاره إلى ان المنحني الملزم غير المتجانس غالبا ما يكون نتيجة للسلوك الحرفي والسلوك غير المثالي الناجم عن ارتفاع تركيز التحاليل ، والذي يمكن تفسيره بأنه نموذج ملزم معقد. ولذلك ، خفض تركيز التحليلية حتى يعرض التشكيل الجانبي sensorgram 1:1 قياس الانحناء ربط يمكن ان تساعد علي التفريق بين الربط غير المتجانسة من التفاعلات أكثر تعقيدا. ثم يتم خصم اي بيانات الربط غير المتجانسة المتبقية كما هو مبين في الشكل 4²⁰.

في هذا التقرير ، يتم قياس ثابت التفكك من 2.28 ± 0.74 nM للتفاعل ColM FhuA. هذه القيمة متوافقة مع ثابت التفكك المحدد سابقا في مجموعتنا مع نانوديسك أو البيتيديسك باستخدام مركز التجارة الكترونيه أو MST ، علي التوالي (الشكل 4e)¹⁶. يوفر هذا التناسق الثقة حول أعاده تكوين البيكتيديسك وتحليل BLI كوسيلة لتحديد حركيه التفاعل. الأهم من ذلك ، تجدر الاشاره إلى ان البروتينات عاده ما يتم تعبئتها علي المواد البيولوجية العقديات اما عن طريق الربط الكيميائي البيوتين أو بالاضافه إلى موقع محدده باستخدام e. القولونية البيوتين البيره²¹. من الواضح ان التعكر الحيوي لسقالة البيتيديسك ، بدلا من البروتين الغشاء المستهدف ، له العديد من المزايا. الحيوية سقالة يوفر الوقت ويقلل من القدرة علي تعطيل المواقع الهامه البروتين ملزمه. وقد وجدنا أيضا ان PeptiQuick ينطبق علي مجموعه واسعه من الطبقات المستهدفة البروتين ، بما في ذلك مستقبلات G-البروتين المقرونة (GPCRs) ، قنوات أيون ، والبروتينات غشاء β-برميل. بشكل عام ، تجدر الاشاره إلى ان استخراج المنظفات الاوليه من البروتينات الغشائية في حاله الكلي الحرة أمر بالغ الاهميه ، وان أعاده التشكيل الفوري في peptidisc يقلل من مشاكل التجميع المصب. ونظرا للبساطة ، فانه من المتصور انه سيتم توسيع peptiquick ليشمل الاختبارات الملزمة الأخرى المستندة إلى العقديات ، مثل رنين البلازمون سطحي السطحي (موارد الاستخدام الخاصة) ، واختبارات اليسا ، والتقارب بين السحب باستخدام خرز سترافيدين.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
30 kDa cut-off centrifugal concentrator	Millipore Sigma	C7715	-
Ampicillin	BioShop	69-52-3	Sodium Salt
Bio-Peptidisc Peptide	Peptidisc Biotech	https://peptidisc.com	-
Bovine Serum Albumin (BSA)	Sigma	9048-46-8	Lyophilized powder
CaCl2	Fisher Chemical	10035-04-8	Certified ACS
EDTA	BioShop	6381-92-6	Biotechnology Grade
Ettan LC (AKTA)	Amersham Pharmacia Biotech	18-1145-58	-
Glucose	BioShop	50-99-7	Anhydrous, Reagent Grade
Glycerol	Fisher Chemical	56-81-5	Certified ACS
Imidazole	BioShop	288-32-4	Biotechnology Grade
Lauryldimethylamine oxide (LDAO)	Sigma	101822204	~30% in H2O
MgSO4	Fisher Chemical	10034-99-8	Certified ACS
Microfluidizer	Microfluidics	M-110L	Fit with F20Y 75µ diruption chamber
Ni-NTA Resin	Gold Biotechnology	H-320-50	-
Non-binding 96well BLI Plate	Greiner Bio-one	655076	Microplate, PS, 96 well, F-Bottom (chimney well), Black, Fluotrac, Med. Binding
Octet Red96	FortéBio	OCTET RED96E-GxP	Octet RED96e instrument, Octet CFR software, desktop computer, LC monitor, accessory kit, IQ/OQ kit, PQ Kits and one-year warranty
Phenylmethanesulfonylfluoride (PMSF)	Sigma	P-7626	-
Protein Assay Dye - Reagent Concentrate	Bio-Rad	5000006	Used in the bradford assay to determine protein concentration - 5x concentration
Sodium Chloride (NaCl)	BioShop	7647-14-5	Biotechnology Grade
Streptavidin (SA) Biosensors	ForteBio	18-5019	One tray of 96 biosensors coated with streptavidin for quantitation, screening, or kinetic applications.
Superdex S200 (300/10)	Amersham Pharmacia Biotech	175175-01	-
Thiamine	Merck	69271	-
Tris-HCl	BioShop	77-86-1	Reagent Grade
Triton X-100	BioShop	900998-1	Biotechnology Grade
Tween-20	BioShop	56-40-6	Reagent Grade
Ultra centrifuge	Beckman Coulter	365668	-