JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Мы представляем метод, который сочетает в себе очистку мембранного белка и восстановление в пептидиски в одном хроматографическом шаге. Биотинилатированные леса используются для прямого вложения поверхности и измерения взаимодействия белково-лигандов с помощью биослойной интерферометрии.

Аннотация

Мембранные белки, включая транспортеры, каналы и рецепторы, составляют почти одну четвертую часть клеточного протеома и более половины текущих целей препарата. Тем не менее, основным препятствием для их характеристики и эксплуатации в академических или промышленных условиях является то, что большинство биохимических, биофизических и наркотиков стратегии скрининга требуют этих белков, чтобы быть в водорастворимых состоянии. Наша лаборатория недавно разработала пептидиск, мембранный мимет, предлагающий «универсальный» подход к проблеме растворимости мембранного белка. Мы представляем здесь обтекаемый протокол, который сочетает в себе очищение белка и восстановление пептидиск в одном хроматографическом шаге. Этот рабочий процесс, называется Pepti'uick, позволяет обойти диализ и инкубацию с полистирола бусы, тем самым значительно уменьшая воздействие моющего средства, белковой денатурации, и потеря образца. Когда PeptiSu'uis осуществляется с биотинилатами эшафот, препарат может быть непосредственно прикреплен к стрептавидин покрытием поверхностей. Нет необходимости биотинилатировать или модифицировать мембранный белок цели. ПептиКуивит демонстрируется здесь с мембранным рецептором FhuA и противомикробным лиганд-колицином M, используя биослойную интерферометрию для определения точной кинетики их взаимодействия. Вывод заключается в том, что Pepti'uick является удобным способом для подготовки и анализа взаимодействия мембранного белка-лигада в течение одного дня в среде, свободной от моющего средства.

Введение

Мембранные белки часто исключаются из программ исследования открытия наркотиков или антител из-за склонности мембранных белков к агрегированию за пределами липидной двухслойной среды, особенно в присутствии моющих средств1. Таким образом, в последние годы, несколько мембранных миметиков (так называемых эшафот) были разработаны для облегчения изоляции и допроса мембранных белков в полностью без моющих средств окружающей среды (т.е. нанодиски, SMALPs, амфиполы и т.д.) 2,3,4,5,6. Однако, реконституция мембранных белков в этих миметики часто требует обширной оптимизации, которая занимает много времени и в целом сопровождается потерей восстановления белка7,8. Чтобы преодолеть эти ограничения, наша лаборатория недавно разработала "один-размер-подходит для всех" формулировка, известная как пептидиск9. Пептидиск образуется при нескольких копиях дизайнера 4,5 kDa амфипатического бигелического пептида, связывающегося с гидрофобной поверхностью мембранного белка цели. Стабильная реконституция в пептидиске происходит при удалении моющего средства, заманивая как эндогенные липиды, так и растворимые мембранные белки в водорастворимые частицы. Эти стабилизированные частицы теперь поддаются для многочисленных приложений вниз по течению.

Метод пептидиса предлагает ряд преимуществ; например, восстановление проста, так как связывание пептидис леса на цель руководствуется шаблон белка себя9,10. Пептидная стоихиометрия также самоопределена, и добавление экзогенных липидов не является необходимым. Формирование пептидиск происходит путем простого разбавления моющего средства, важное преимущество перед диализом или адсорбцией на полистироловых шариках, что часто приводит к низкой урожайности белка из-за неспецифической поверхностной ассоциации и агрегации11,12 ,13. Окончательная сборка пептидиска очень термостабильна и неизменно растворима в различных буферах или при наличии divalent катионов (например, Ni2). Чистота и структурная однородность эшафота также высока (например, без эндотоксина), а пептид можно настроить с функциональными группами, расположенными на разных позициях.

Мы представляем здесь лабораторный рабочий процесс под названием Pepti'uick, также известный как на бисере восстановления9. Этот протокол сочетает в себе очистку мембранного белка и восстановление пептидиска в один шаг и на той же хроматографической поддержке. Как видно из названия, Pepti'uick быстро по сравнению с другими методами восстановления, и это также серьезно сокращает время воздействия моющего средства. Отрицательные эффекты моющего средства, такие как разворачивание белков и агрегация, часто происходят зависимым от времени образом; Поэтому, минимизация воздействия моющего средства имеет решающее значение для поддержания родной конформации белка14,15. Это имеет решающее значение для точности методов, которые сообщают о взаимодействиях белка и лиганд связывания сходства.

При разработке этого протокола, мы представляем новый биотинилатированной версии пептидис эшафот, называется Био-Peptidisc. Функциональные группы биотина позволяют накладивать мембранный белок цели на поверхности, покрытые стрептавидином. Так как маркировка биотина ограничена эшафотом, места связывания белка целевой мембраны остаются неизменными. Использование Bio-Peptidisc, связывающая кинетика бактериального мембранного рецептора FhuA и противомикробного пептида колицина М (ColM) определяются16. Это сродство измеряется с помощью биослойной интерферометрии (BLI), которая анализирует взаимодействия в режиме реального времени на основе моделей помех белого света, отраженных от наконечника датчика.

С помощью этого протокола, потребность в моющих средствах во время анализа BLI устраняется, что является важным событием, так как моющие средства могут нарушить взаимодействие. Связывание сходства может быть измерено быстро с помощью этого метода, и результаты сопоставимы с теми, которые сообщалось ранее с помощью нанодисков и изотермальной калории титрации (ITC)16. Критические шаги в процессе Pepti'uick показаны и обсуждены, такие как подготовка белка, разбавление моющего средства, пептид дополнение, и восстановление, а также советы по устранению неполадок лиганда и анализ связывания в АНАЛИЗblI. Используя рабочий процесс Pepti'uick, оказывается, что мембранные белки могут быть захвачены в пептидиски и их взаимодействия измеряется в течение дня.

протокол

1. Подготовка и растворимизация мембранных рецепторов FhuA

  1. Экспрессего 6-тегами FhuA в Escherichia coli штамм AW740. Выращивайте клетки в течение 18 ч при 37 градусах по Цельсию в m9 media(таблица 1). См Миллс и др.16 для подробного протокола выражения.
  2. Урожайные клетки по центрифугации (5000 х г,10 мин, 4 кв. c) и повторно их в 50 мл Tris-соли глицерола (TSG) буфера (Таблица 1). Dounce resuspended клеток и добавить фенилметанаsulfonylfluoride (PMSF) до окончательной концентрации 1 мМ незадолго до лизиса.
    ВНИМАНИЕ: PMSF является токсичным и коррозионным.
  3. Lyse клеток с помощью микрофлюидизатора (три прохода) на 15000 пси или французской прессы (три прохода) на 8000 пси. Пеллети нелизинированные клетки и другой нерастворимый материал при малоскоростной центрифугации (5000 х г,10 мин, 4 кв. C).
  4. Ultracentrifuge супернатант (200000 х г,40 мин, 4 кВ) для изоляции сырой фракции мембраны. Откажитесь от супернатанта, отостановите мембранные гранулы в минимальном количестве буфера TSG и бросьте с помощью стеклянного или металлического дунсерного аппарата для обеспечения однородности.
  5. Выполните анализ Брэдфорда, чтобы проверить концентрацию белка в восстановленной сырой мембране. Разбавить сырую мембрану до конечной концентрации 3 мг/мл с помощью буфера TSG до раствориления.
  6. Добавьте моющее средство Triton X-100 к конечной концентрации 1% (v/v), чтобы избирательно улавлить бактериальную внутреннюю мембрану в течение 1 ч при 4 градусах Цельсия с нежным раскачиванием. Пеллети нерастворимый материал (внешняя фракция мембраны) путем ультрацентрифугирования (200 000 х г,40 мин, 4 кв. C).
  7. Откажитесь от супернатанта, содержащего растворительную мембрану, и отбросьте гранулы в TSG до конечной концентрации 3 мг/мл. Добавьте оксид лаурилдиметиламина (LDAO) к концентрации 1% (v/v) к повторной фракции внешней мембраны и растворите в течение 1 ч при 4 градусах Цельсия с нежным раскачиванием.
  8. Выполните заключительный этап центрифугации, чтобы гранулировать все нерастворимые материалы (200 000 х г,40 мин, 4 кв С).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Резцовый супернатант содержит растворимые внешние мембранные белки, в том числе цель его помечены FhuA.

2. Очистка и восстановление FhuA с использованием рабочего процесса Pepti'uick

  1. Предварительно уравновесите расфасованный столбец Ni-NTA (объем мелина 5 мл) с двумя объемами столбцов обездвиженных металлических хроматографии (IMAC) буфера стирки(таблица 1).
  2. Разбавить растворило наружную мембрану с 1% LDAO до 0,04% LDAO с помощью TSG. Затем добавьте имидазол в окончательную концентрацию 5 мМ.
    ПРЕДЕКТО: Имидазол токсичен и коррозионен.
  3. Загрузите растворимые белки внешней мембраны на мишеню Ni-NTA и соберите протекаемый. Перезагрузите проток на вторичную погоду, чтобы увеличить переплетовную сечь по мисе и собрать вторичное прохождение.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Держите 20 qL аликот растворительного материала в качестве ссылки на более поздний анализ полиакриламидного геля натрия (SDS-PAGE).
  4. Вымойте мизину с 250 мл буфера мыть ямки и собрать первые 50 мл eluate. Слейте буфер стирки на высоту объема кровати мелина и закройте стоп-кок на столбце.
  5. Добавьте 1 мл концентрированного 10 мг/мл Био-Пептидиск пептидный раствор(таблица 1) в колонку. Добавьте 50 мл разбавленного 1 мг/мл био-пептидный пептидный раствор в TSG и перемешайте с помощью стеклянной стержня, чтобы перегреть бусы в TSG.
  6. После пептидисзахвата, позволяют мисеии, чтобы осесть и слить избыток 1 мг / мл Био-Пептидиск раствор через сосуд.
  7. Вымойте Ni-NTA прилагается пептидиск частиц с 50 мл TSG. Выявите пептидискчастицы с 15 мл буфера elution IMAC(Таблица 1), содержащего 600 мМ имидазола в TSG. Соберите 1 мл фракций и сразу же добавить 10 л 0,5 М EDTA для chelate выщелачивания ионов никеля.
    ВНИМАНИЕ: ЭДТА является раздражителем.

3. Оценка воззвания ПептиБыстрый

  1. Анализ SDS-PAGE
    1. Загрузите 10 аликотов стартового материала, протекающих, мытье (es) и eluted фракций от reconstitution Pepti'uick на 12% SDS-денатурный гель и электрофорез в течение 30 мин при постоянном токе 60 мА.
    2. Пятно гель с Coomassie синий краситель, destain гель, и визуализировать на сканере.
  2. Хроматография исключения размера (SEC)
    1. На основе 12% SDS-PAGE анализ ПептиБыстрый восстановления, изолировать и объединить соответствующие фракции, и сконцентрировать их с помощью 30 kDa отсечения центробежателя.
      ПРИМЕЧАНИЕ: В сопроводительном видео фракции F3-F7 объединяются вместе и сконцентрированы ниже 1 мл (объем впрыска цикла на инструменте SEC).
    2. Впрыските 1 мл объединенных фракций elution IMAC на столбик фильтрации геля S200 (300/10) со скоростью потока 0,25 мл/мин в буфере TSG. Соберите 1 мл фракций и запустить их на 12% SDS гель, чтобы определить, какие фракции SEC объединить и сконцентрироваться.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Eluted ПептиБыстрый фракции могут быть объединены без концентрации, и aliquot может быть введен на SEC, чтобы проверить качество восстановления. Это важный контроль для мембранных белков, которые потенциально чувствительны к агрегации во время центробежной концентрации.

4. Биослойная интерферометрия

  1. Экспериментальная установка BLI
    1. Навяжните 96 хорошо пластины вручную.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Все скважины заполнены до окончательного объема 200 Л.
    2. В столбце 1 строки A'E загрузите буфер кинетики в размере 200 qL, чтобы советы уравновеш— уравновеш— уравновеш— исходные сигналы.
    3. Разбавить лиганд (FhuA в Био-Пептидиск) до концентрации 2,5 мкг/мл в буфере кинетики (Таблица 1). Загрузите 200 л этого разбавления в строки A'D в столбце 2.
    4. Добавить 200 кв/л буфера кинетики только к E2 (справочный датчик).
    5. Добавьте 200 qL буфера кинетики в столбец 3, строки A'E для мытья избытка FhuA от кончика.
    6. В колонке 4 проведите двукратное серийное разбавление аналита (ColM) вниз по пластине от A4 до D4. Начните с 28 нм (8 ккд) в A4 до 3,5 нм (1'Kd) в D4.
    7. Добавьте 28 nM ColM в E4 для измерения неспецифической связывания (самая высокая концентрация ColM используется).
    8. Добавьте 200 qL буфера кинетики в столбец 5, ряды A'E.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Здесь ColM будет отделяться от кончика, и диссоциация измеряется.
    9. Поместите тарелку установки в инструмент BLI.
    10. Поместите поднос наконечника датчика в инструмент BLI.
    11. Откройте программное обеспечение для получения данных BLI и выберите Эксперимент Новой Кинетики на мастере программного обеспечения.
    12. Используйте вкладку определения пластины, чтобы ввести макет пластины 96 хорошо пластины в программное обеспечение.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Скважины, содержащие лиганд, FhuA ввеются как "Нагрузка". Скважины, содержащие буфер, вносятся только в качестве "буфера". Скважины, содержащие анализ, ColM, ввеются как "Образец".
    13. Используйте вкладку определения асссея, чтобы определить продолжительность времени и скорость вращения пластины для каждого шага эксперимента.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Экспериментальные шаги настроены как: 1) базовый упор: 60 с; 2) погрузка: 250 с; 3) базовый2: 300 с; 4) ассоциация: 450 с; и 5) диссоциация: 900 с. Оставьте скорость встряхивания по умолчанию (1000 об/мин). Вышеуказанные шаги индивидуально присваиваются каждой колонке в пластине 96 скважин, выбрав нужный шаг и правый клик Добавить шаг на каждом столбце.
    14. Назначить первый шаг, нажав на первый столбец, и выберите Start New Assay. Убедитесь, что базовый шаг правильно назначен с помощью нижнего окна правой и изменения с выпадающим меню по мере необходимости.
    15. Назначайте последующие шаги к каждой колонке, нажав вправо вдоль пластины и выбрав Добавить Шаг асссирования. Назначаем их соответствующему столбце, установленному в шаге 4.1.13.
    16. Используйте вкладку назначения датчика, чтобы убедиться, что инструмент octet принимает булавки BLI из правильного расположения в лоток датчика.
      ПРИМЕЧАНИЕ: В вкладке назначения датчика только A1'E1 должен быть выделен синим цветом. Убедитесь, что наконечник датчика присутствует в этих местах в лотке датчика и убедитесь, что F1'H1 пуст.
    17. Выделите F1'H1 на экране, затем нажмите правой кнопкой мыши и выберите Удалить, чтобы отметить их как пустые. Tick Заменить датчики в лоток после использования для сохранения используемых датчиков.
    18. Во вкладке «Эксперимент обзора», которая содержит окончательный обзор эксперимента до выполнения, перейдите на экспериментальные шаги, чтобы убедиться, что вся настройка верна.
    19. Во вкладке «Эксперимент запуска» выберите местоположение файла для сохранения файлов метода.
    20. Измените температуру пластины на комнатную.
    21. Выберите GO для запуска эксперимента.
  2. Анализ данных BLI
    1. Откройте программное обеспечение для анализа данных Octet BLI.
    2. Используйте вкладку выбора данных, чтобы найти эксперимент и проверить экспериментальное резюме. Импортируйте файл проекта из его местоположения сохранения, определенного во время шага 4.1.19.
    3. Ввейте концентрации аналита (здесь, ColM), выбрав информацию о датчике для каждого эксперимента.
    4. Назначай наконечник в E1 в качестве эталонного наконечника.
    5. Используйте вкладку обработки для вычитания эталонного сигнала (E1) из экспериментальных данных. Проверьте исходные данные из справочного наконечника на неспецифическую привязку анализа. Если ни одного не наблюдается, продолжайте.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Это важный отрицательный контроль. При неспецифическом привязке соблюдается, это будет учтено в шаге 4.2.7.
    6. Выровнять y-оси ко второму базовому этапу. Не тикайте межступенчатое соединение. Выберите фильтрацию Савицкого-Голея. Выберите данные процесса!.
    7. Во вкладке анализа выберите экспериментальные данные в таблице ниже сюжета, чтобы увидеть кривые ассоциации и диссоциации с вычитанным сигналом от референтного датчика.
    8. Выберите модель связывания 1:1 и выберите частичную форму кривой. Выберите Fit кривые!.
    9. Проанализируйте остаточный участок представления, чтобы проверить установку кривой.
    10. Прокрутите таблицу, чтобы увидеть вычисленное Kd.
    11. Выберите Сохранить отчет..., чтобы сохранить электронный документ с подробным описанием настройки, участков необработанных и проанализированных данных, а также расчетных констант диссоциации.

Результаты

Мембранный рецептор FhuA выражается в лабораторных штамме кишечной палочки. Внешняя фракция мембраны собирается путем центрифугирования, а белки растворяются с помощью двухступенчатой моющих средств. Растворимые мембранные белки загружаются на бусы агарозы Ni-NTA, упакованные в пластиковую колонку, а затем рабочий процесс Pepti'uick, представленный в протоколе. После контроля качества с использованием размера исключения хроматографии, био-Пептидиск частицы обездвижены на стрептавидин покрытием булавки. Анализ BLI проводится для измерения кинетики взаимодействий между FhuA и ColM. Схематический обзор этого эксперимента представлен на рисунке 1.

Гель SDS работает для определения качества восстановления после удаления частиц FhuA Bio-Peptidisc из столбца IMAC (Рисунок 2). Аликвоты фракций, соответствующих для запуска, протекающих, смывает, и elution фракции загружаются на SDS-гель для оценки успеха метода Pepti'uick. Истощение FhuA в проточной фракции коррелирует с обогащением в фракциях elution, что указывает на то, что очистка белка была эффективной. Незначительные загрязняющие белковые полосы наблюдаются в неприглядных фракциях. Анализ геля SDS используется для определения того, какие фракции должны быть объединены до анализа SEC. Родной гель из eluted FhuA Био-Пептидиск частиц также запустить для подтверждения FhuA растворимости (Дополнительная рисунок 1). Миграция восстановленного белка в родной гель указывает на растворимость белка в среде, свободной от моющего средства.

Анализ SEC проводится для оценки растворимости пептидисковых частиц. Хроматограмма, представленная на рисунке 3A, показывает один, симметричный пик, прижимающийся примерно к 14 мл (6 мл за объемом пустоты 8,0 мл на колонке фильтрации геля S200 10/300). Положение этого пика, мимо объема пустоты, подтверждает растворимость частиц FhuA Bio-Peptidisc. Для справки, Рисунок 3B иллюстрирует теоретический субоптимальный препарат пептидиск. В этом случае хроматограмма показывает больший пик белка, eluting на объеме пустоты, что указывает на наличие белковых агрегатов. Меньший пик eluting только мимо основного пика пептидиса соответствует избыточному пептидам пептида.

Взаимодействие FhuA с аналитом ColM определяется после присоединения пептидисков к стрептавидиновым датчикам с покрытием. Наконечники датчиков сначала уравновешиваются в буфере кинетики, а затем передаются в буфер, содержащий био-пептидиски FhuA. Концентрация био-пептидисков FhuA и продолжительность времени, за которое они инкубируются наконечником оптимизирована до этого эксперимента(Дополнительная диаграмма 1). После погрузки и стирки шаги, шаг ассоциации измеряет взаимодействия между загруженными кончиками и четыре различных концентраций колицин M. Последующее движение кончиков обратно в буфер приводит к разъединению, которое измеряется сдвигом длины волны белого света, отражающегося от кончика.

На рисунке 4A отображается необработанный вывод сенсорной граммы данных в ходе этого эксперимента. Все следы отображаются в форме на этапах загрузки и базовых, кроме эталонного следа желтым цветом. Подсказка не имеет ligand нагруженного но подвергается действию к analyte для того чтобы провести для того чтобы провести для nonspecific связывания, который важный отрицательный контроль. Для более детального анализа результатов сигнал из эталонного наконечника вычитается из следов экспериментальных советов для учета неспецифических связей. Данные выравниваются к началу шага ассоциации, чтобы прямое визуальное сравнение, как показано на рисунке 4B. Это сравнение показывает увеличение переноса длины волны для увеличения концентраций колицина М. Кривая подходит для данных и демонстрирует классическую модель связывания 1:1.

Остаточный график представления(рисунок 4B, внизу), который описывает различия между установкой и экспериментальными данными, показывает, что примерка для самой высокой концентрации ColM (28 нм) является плохой по сравнению с тремя более низкими концентрациями. Профиль самой кривой не имеет связывающего кривого плато, что характерно для насыщения связывающего участка в типичном связывающем эксперименте. Отсутствие плато предполагает неоднородность связывания, которая, вероятно, является артефактом высокой концентрации КолМ. Эта самая высокая концентрация ColM поэтому уценена от анализа, и другие 3 концентрации использованы для того чтобы обусловить постоянн диссоциации (рисунок 4C,D). Двуххвостый студент t-тест,на уровне доверия 95%, обнаружили, что наблюдаемая диссоциация постоянной от этого эксперимента не значительно отличается от значений, полученных с использованием различных методов (Рисунок 4E)16.

figure-results-5209
Рисунок 1: Обзор рабочего процесса Pepti'uick с использованием био-peptidiscs и BLI анализа. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

figure-results-5631
Рисунок 2: анализ геля SDS (12%) запуска, протекающих, мытье и elution фракций, собранных через процесс Pepti'uick. Около 10 зЛ образца было загружено в каждую полосу и работать в течение 30 минут при постоянном течении 60 мА. Гель был окрашен с Coomassie синий, окрашивается, и визуализированы на гель сканера. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

figure-results-6272
Рисунок 3: Экспериментальные и теоретические профили SEC, представляющие оптимальные и субоптимальные воссоздания, соответственно. (A) Экспериментальный профиль SEC Pepti'uick воссоздал FhuA (No 82 kDa) в Bio-Peptidiscs. Фракции EMAC elution F3-F7 были объединены и сконцентрированы с помощью центроцентрики отсечения 30 kDa до 1 мл. Этот концентрированный образец был введен на 0,25 мл/мин на гель фильтрации S200 (10/300) колонки в буфере TSG. (B) Теоретический профиль SEC неоптимального ПептиБыстрый восстановления. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

figure-results-7155
Рисунок 4: Исследование взаимодействия ColM с FhuA восстановлено в Bio-Peptidiscs. (A) Сырье сенсорной грамма данных с эталонным датчиком след в желтом. (B, C) Вверху: этапы ассоциации и диссоциации с частичной установкой кривой связывания 1:1. Внизу: остаточные представления, отражающие разницу между экспериментальными данными и вычислительной установкой. (C) Переплотивание (B) с исключением самой высокой концентрации ColM. (D) Наблюдаемые коэффициенты ассоциации и диссоциации (kon and koff,соответственно) и константы диссоциации (Kd). (E) Сравнение FhuA-ColM диссоциации константы, полученные пептидиск и BLI (в этом эксперименте), пептидиск и микромасштабный термофорез (Сэвилл, неопубликованные данные), и нанодиск и изотермальной титромного кальотрии16. Бары ошибок представляют собой один SD неопределенности, в то время как n.s. не означает существенной разницы на уровне доверия 95%. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

M9 Media (на литр)
200 мл соли M9
800 мл dH2O
10 мл 40% Глюкоза
80 Лл 1 M CaCl2
2,5 мл 1 M MgSO4
300 л 15 мг/мл тиамин
Буфер TSG
50 мМ Трис-HCl, рН 7.8
50 мМ NaCl
10% Глицерол
Буфер мытья iMAC
50 мМ Трис-HCl, рН 7.8
50 мМ NaCl
10% глицерола
0.04% LDAO
5 мМ Имидазол
Био-Пептидиск Решение
Растворите готовый к использованию bio-Peptidisc (95% чистоты) в стерильном dH2O. Концентрация и объем пептидного раствора зависит от шага в процессе восстановления.
50 мМ Трис-HCl, рН 7.8
50 мМ NaCl
ПРИМЕЧАНИЕ: Этот био-пептидисцид пептидный запас стабилен на уровне 4 градусов по Цельсию в течение месяца.
Буфер Elution IMAC
50 мМ Трис-HCl, рН 7.8
50 мМ NaCl
10% Глицерол
600 мМ Имидазол
Кинетика Буфер
50 мМ Трис-HCl, рН 7.8
50 мМ NaCl
0.002% Tween-20
0.1% BSA

Таблица 1: Рецепты для подготовки средств массовой информации и решений.

Дополнительная диаграмма 1: 4%-16% четкий анализ родного геля фракций elution, собранных из рабочего процесса Pepti'uick. Около 10 qL образца был загружен в каждой полосе и работать в течение 40 минут при постоянном токе 30 мА. Гель был окрашен с Coomassie синий, окрашивается, и визуализированы на сканере. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить эту цифру.

Дополнительная диаграмма 2: Оптимизация концентрации лиганда с использованием одного штифта. (A) Шесть различных концентраций FhuA в Био-Пептидиск испытания для привязки к одной стрептавидина покрытием булавки. Это было установлено в пластине 96 скважин с буфером в скважинах между концентрациями лиганда (см. Дополнительный файл 1 для протокола установки). (B) Сырье датчика данных для эксперимента по оптимизации лиганда. Штырь дает наибольший ответ и дополнительно достигает насыщения при концентрации no 4 (или 2,5 мкг/мл). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить эту цифру.

Дополнительный файл 1. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть этот файл (Право нажмите, чтобы скачать).

Обсуждение

В то время как моющие средства остаются самым простым методом для извлечения и очистки мембранных белков, эти сурфактанты могут иметь много нежелательных эффектов на стабильность белка, функции, и вниз по течению анализы1,2,3, 4,5,6,7,8,9. Эти трудности побудили развитие мембранных миметики, которые стремятся свести к минимуму наличие моющих средств и повторить родной мембраны окружающей среды как можнобольше 2,3,4 ,5,6. Большинство методов восстановления, однако, требуют существенной оптимизации условий восстановления и часто требуют дополнительных шагов очистки, которые уменьшают конечную доходность7,8. Пептидиск спонтанно адаптируется к целевому мембранном белку и сравнительно требует небольшой оптимизации и очистки вниз по течению9,10. В этом протоколе, Pepti'uick представлен как простое средство для рационализации протокола восстановления для анализа взаимодействия белка и белка ниже по течению.

Хотя это просто, Есть несколько экспериментальных предостережений, которые могут привести к неудачной реконструкции. Среди них наиболее распространенным является связано с агрегацией белка. Поэтому крайне важно, чтобы выполнить размер исключения хроматографии для мониторинга процесса восстановления. Например, пик исключения размера, eluting на объеме пустоты, свидетельствует о белковых агрегатах(рисунок 3B)17,18. Мембранные белковые агрегаты обычно образуются при длительном воздействии субоптимальных моющих средств до восстановления. В частности, было установлено, что мембранные белки в моющих средствах, как правило, образуют агрегаты при концентрации ультрафильтрации на центробежных устройствах. В этом случае чувствительные мембранные белки могут быть сконцентрированы с помощью вакуумной ультрафильтрации, более мягкого и однородного метода концентрации, так как адсорбция белков в фильтр уменьшается.

В общем, чтобы избежать концентрации белка, eluted фракции IMAC должны быть объединены, и aliquot вводят на столбец исключения размера, чтобы проверить его качество восстановления. Следует отметить, что неинкорпорированные свободные пептидные элиты сразу после основного пика пептидиск(рисунок 3B). Бесплатные леса не обязательно препятствуют вниз по течению экспериментов. Однако, при необходимости, это превышение может быть удалено размер исключения хроматографии. Кроме того, увеличение объема стирки во время восстановления, и до elution из iMAC синой, достаточно, чтобы эффективно удалить большую часть свободного пептида пептида пептида. Таким образом, хроматография исключения размера рекомендуется в качестве быстрого и простого средства для проверки качества восстановления.

Эксперимент BLI требует тщательной оптимизации как лиганда, так и анализа концентраций. Связывание лиганда должно быть достаточным для получения четкого сигнала, но перегрузка вызовет насыщение сигнала, что приводит к артефактам данных от переполненности и стерическому препятствию на поверхности кончика. Таким образом, как концентрация лиганда, так и продолжительность времени, который наконечник проводит в растворе лиганда, должна быть оптимизирована для каждого образца белка(Дополнительная диаграмма 2). Концентрация аналита также должна быть оптимизирована. Если константа разобщена диссоциация, то этот шаг становится легче, так как диапазон концентрации может быть приближен. Хорошей отправной точкой для этого анализа является использование концентрации белка между 0,1- и 20 раз ожидаемых Kd19.

После получения данных BLI необходимо проводить тщательный анализ данных, чтобы избежать неправильного толкования. Расчет константы диссоциации зависит от припадка кривой связывания. Если уже известна привязка стоихиометрии, для первоначальной установки следует использовать классическую двухмолекулярную модель взаимодействия 1:1. Следует отметить, что неоднородная кривая связывания часто является результатом артефактов и неидеального поведения, вызванного высокой концентрацией аналита, что может быть неправильно истолковано как сложная модель связывания. Таким образом, снижение концентрации аналита до тех пор, пока профиль сенсорной граммы не покажет 1:1 связывающую стоихиометрию, может помочь дифференцировать разнородную привязку от более сложных взаимодействий. Любые остаточные неоднородные связывающие данные затем дисконтированы, как показано на рисунке 420.

В этом отчете измеряется константа диссоциации 2,28 и 0,74 нм для взаимодействия FhuA-ColM. Это значение согласуется с постоянной диссоциации, ранее определяемой в нашей группе с нанодиском или пептидиском с использованием ЦМТ или MST, соответственно (Рисунок 4E)16. Эта последовательность обеспечивает уверенность в восстановлении пептидиска и анализа BLI как средства для определения кинетики взаимодействия. Важно отметить, что белки, как правило, обездвижены на стрептавидина биосенсоров либо через биотин химических перекрестных ссылок или сайта конкретных дополнение с использованием E. coli биотина ligase BirA21. Очевидно, что биотинилатирование пептидислеса, вместо целевого мембранного белка, имеет много преимуществ. Биотиниляция scaffold экономит время и сводит к минимуму потенциал для нарушения важных мест связывания белка. Мы также обнаружили, что Pepti'uick применима к широкому спектру белковых целевых классов, в том числе G-белков-связанных рецепторов (GPCRs), ионных каналов, и мембранных белков. В целом, следует отметить, что первоначальный экстракт моющего средства мембранных белков в агрегированном состоянии имеет решающее значение, и что немедленное восстановление в пептидиск уменьшает вниз по течению проблемы агрегации. Учитывая простоту, предполагается, что Peptisu'ue будет распространена на другие стрептавидин основе связывающих анализы, такие как поверхностный плазмон резонанс (SPR), ELISA анализы, и сродство выдвижной вниз с использованием стрептавидина основе связывания анализы, такие как поверхностный плазмон резонанс (SPR), ELISA анализы, и сродство выдвиженца с использованием стрептавидиина.

Раскрытие информации

FD является основателем Peptidisc Biotech для распространения пептидов пептидов для академического сообщества. Peptidisc Biotech также сотрудничает с промышленными биотехнологическими и фармацевтическими компаниями для внедрения пептидиса в их рабочие процессы открытия. Публикация этой статьи в открытом доступе была организована fort'Bio.

Благодарности

Мы благодарим Совет по естественным наукам и инженерным исследованиям Канады. JS имеет стипендию CGS-M CIHR. LT была поддержана Биотехнологии и биологических наук Научно-исследовательский совет финансируемых юго-западной бионауки Докторская учебная партнерство (обучение грант ссылка BB/M009122/1). FD является кафедрой исследований уровня II в Канаде.

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
30 kDa cut-off centrifugal concentratorMillipore SigmaC7715-
AmpicillinBioShop69-52-3Sodium Salt
Bio-Peptidisc PeptidePeptidisc Biotechhttps://peptidisc.com-
Bovine Serum Albumin (BSA)Sigma9048-46-8Lyophilized powder
CaCl2Fisher Chemical10035-04-8Certified ACS
EDTABioShop6381-92-6Biotechnology Grade
Ettan LC (AKTA)Amersham Pharmacia Biotech18-1145-58-
GlucoseBioShop50-99-7Anhydrous, Reagent Grade
GlycerolFisher Chemical56-81-5Certified ACS
ImidazoleBioShop288-32-4Biotechnology Grade
Lauryldimethylamine oxide (LDAO)Sigma101822204~30% in H2O
MgSO4Fisher Chemical10034-99-8Certified ACS
MicrofluidizerMicrofluidicsM-110LFit with F20Y 75µ diruption chamber
Ni-NTA ResinGold BiotechnologyH-320-50-
Non-binding 96well BLI PlateGreiner Bio-one655076Microplate, PS, 96 well, F-Bottom (chimney well), Black, Fluotrac, Med. Binding
Octet Red96FortéBioOCTET RED96E-GxPOctet RED96e instrument, Octet CFR software, desktop computer, LC monitor, accessory kit, IQ/OQ kit, PQ Kits and one-year warranty
Phenylmethanesulfonylfluoride (PMSF)SigmaP-7626-
Protein Assay Dye - Reagent ConcentrateBio-Rad5000006Used in the bradford assay to determine protein concentration - 5x concentration
Sodium Chloride (NaCl)BioShop7647-14-5Biotechnology Grade
Streptavidin (SA) BiosensorsForteBio18-5019One tray of 96 biosensors coated with streptavidin for quantitation, screening, or kinetic applications.
Superdex S200 (300/10)Amersham Pharmacia Biotech175175-01-
ThiamineMerck69271-
Tris-HClBioShop77-86-1Reagent Grade
Triton X-100BioShop900998-1Biotechnology Grade
Tween-20BioShop56-40-6Reagent Grade
Ultra centrifugeBeckman Coulter365668-

Ссылки

  1. Rawlings, A. E. Membrane proteins: always an insoluble problem. Biochemical Society Transactions. 44 (3), 790-795 (2016).
  2. Popot, J. L. Amphipols, Nanodiscs, and Fluorinated Surfactants: Three Non Conventional Approaches to Studying Membrane Proteins in Aqueous Solutions. Annual Review of Biochemistry. 79, 737-775 (2010).
  3. Lee, S. C., et al. A Method for Detergent-Free Isolation of Membrane Proteins in their Local Lipid Environment. Nature Protocols. 11, 1149-1162 (2016).
  4. Frauenfeld, J., et al. A Saposin-Lipoprotein Nanoparticle System for Membrane Proteins. Nature Methods. 13, 345-351 (2016).
  5. Bayburt, T. H., Grinkova, Y. V., Sligar, S. G. Assembly of Single Bacteriorhodopsin Trimers in Bilayer Nanodiscs. Archives of Biochemistry and Biophysics. 450, 215-222 (2006).
  6. Denisov, I. G., Grinkova, Y. V., Lazarides, A. A., Sligar, S. G. Directed Self-Assembly of Monodisperse Phospholipid Bilayer Nanodiscs with Controlled Size. Journal of the American Chemical Society. 126, 3477-3487 (2004).
  7. Denisov, I. G., Sligar, S. G. Nanodiscs for Structural and Functional Studies of Membrane Proteins. Nature Structural, Molecular Biology. 23, 481-486 (2016).
  8. Hagn, F., Etzkorn, M., Raschle, T., Wagner, G. Optimized Phospholipid Bilayer Nanodiscs Facilitate High-Resolution Structure Determination of Membrane Proteins. Journal of the American Chemical Society. 135, 1919-1925 (2013).
  9. Carlson, M. L., et al. The Peptidisc, A Simple Method for Stabilizing Membrane Proteins in Detergent-Free Solution. eLife. 7, 34085 (2018).
  10. Carlson, M. L., et al. Profiling the E. coli Membrane Interactome Captured in Peptidisc Libraries. eLife. 8, 46615 (2019).
  11. Serdakowski, A., et al. A novel method to determine residual detergent in biological samples post endotoxin reduction treatment and evaluation of strategies for subsequent detergent removal. International Immunopharmacology. 37, 16-22 (2016).
  12. Smith, S. M. Strategies for the Purification of Membrane Proteins. Protein Chromatography. 681, 485-496 (2011).
  13. Lin, S. H., Guidotti, G. Purification of Membrane Proteins. Methods in Enzymology. 463, 619-629 (2009).
  14. Wolfe, A. J., Gugel, J. F., Chen, M., Movileanu, L. Kinetics of Membrane Protein-Detergent Interactions Depend on Protein Electrostatics. Journal of Physical Chemistry B. 122 (41), 9471-9481 (2018).
  15. Montigny, C., et al. Slow Phospholipid Exchange between a Detergent-Solubilized Membrane Protein and Lipid-Detergent Mixed Micelles: Brominated Phospholipids as Tools to Follow Its Kinetics. PLoS ONE. 12 (1), 0170481 (2017).
  16. Mills, A. T., Le H, T., Coulton, J. W., Duong, F. FhuA Interactions in a Detergent-Free Nanodisc Environment. Biochimica et Biophysica Acta - Biomembranes. 1838 (1), 364-371 (2014).
  17. Hong, P., Koza, S., Bouvier, E. S. P. Size-Exclusion Chromatography for the Analysis of Protein Biotherapeutics and their Aggregates. Journal of Liquid Chromatography Related Technologies. 35 (20), 2923-2950 (2012).
  18. Mahler, H. C., Friess, W., Grauschopf, U., Kiese, S. Protein aggregation: Pathways, induction factors and analysis. Journal of Pharmaceutical Sciences. 98 (9), 2909-2934 (2009).
  19. Trinkle-Mulcahy, L. Recent advances in proximity-based labeling methods for interactome mapping. F1000Research. 8, 135 (2019).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

153

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены