JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

يتم تقديم طريقتين لتخصيب الكوليسترول: تطبيق السيكلوديكسترين المشبعة بالكوليسترول لإثراء أنسجة الثدييات والخلايا ، واستخدام التشتت القائم على الفوسفوليبيد التخصيب للكوليسترول (الليبوزومات) لإثراء البويضات الزينيوبوس. هذه الطرق مفيدة لتحديد تأثير ارتفاع مستويات الكوليسترول في الجسم في وظائف الجزيئية والخلوية والجهاز.

Abstract

يمكن تحقيق إثراء الكوليسترول في أنسجة الثدييات والخلايا ، بما في ذلك البويضات Xenopus المستخدمة لدراسة وظيفة الخلية ، باستخدام مجموعة متنوعة من الطرق. وهنا، نصف نهجين هامين يستخدمان لهذا الغرض. أولاً، نحن نصف كيفية إثراء الأنسجة والخلايا مع الكوليسترول باستخدام السيكلوديكسترين المشبعة الكوليسترول باستخدام الشرايين الدماغية (الأنسجة) والخلايا العصبية فرس النهر (الخلايا) كأمثلة. يمكن استخدام هذا النهج لأي نوع من الأنسجة أو الخلايا أو خطوط الخلايا. نهج بديل لتخصيب الكوليسترول ينطوي على استخدام البروتين الدهني منخفض الكثافة (LDL). ميزة هذا النهج هو أنه يستخدم جزءا من آلات التوازن الكوليسترول الطبيعي في الخلية. ومع ذلك، في حين يمكن تطبيق نهج السيكلوديكسترين لإثراء أي نوع من الخلايا من الفائدة مع الكوليسترول، ويقتصر نهج LDL على الخلايا التي تعبر عن مستقبلات LDL (على سبيل المثال، خلايا الكبد، والخلايا المشتقة من نخاع العظام مثل الكريات البيض الدم والبلفة الأنسجة)، ومستوى الإثراء يعتمد على تركيز وحركة مستقبلات LDL. وعلاوة على ذلك، تشمل جزيئات LDL الدهون الأخرى، لذلك تسليم الكوليسترول غير محدد. ثانياً، نحن نصف كيفية إثراء البويضات الزينية مع الكوليسترول باستخدام التشتت القائم على الفوسفوليبيد (أي الليبوزومات) التي تشمل الكوليسترول. تشكل البويضات الزينية نظام تعبير غير منطقي شائع يستخدم لدراسة وظيفة الخلية والبروتين. لكل من نهج تخصيب الكوليسترول القائم على السيكلودكسترين من أنسجة الثدييات (الشرايين الدماغية) ولنهج تخصيب الكوليسترول القائم على الفوسفوليبيد من البويضات Xenopus ، نبرهن على أن مستويات الكوليسترول تصل إلى الحد الأقصى بعد 5 دقيقة من الحضانة. يبقى هذا المستوى من الكوليسترول ثابتًا خلال فترات الحضانة الممتدة (على سبيل المثال، 60 دقيقة). معا، توفر هذه البيانات الأساس للظروف الزمنية الأمثل لإثراء الكوليسترول من الأنسجة والخلايا، وoocytes Xenopus للدراسات الوظيفية التي تهدف إلى استجواب تأثير تخصيب الكوليسترول.

Introduction

الكوليسترول، والدهون الخلوية الرئيسية، يلعب العديد من الأدوار الوظيفية والهيكلية الحرجة1،,2،,3،,4،,5،,6،,7،,8،,9. من تنظيم الخصائص الفيزيائية لغشاء البلازما إلى ضمان بقاء الخلية والنمو والانتشار ، والعمل كجزيء إشارة وسلائف في عدد كبير من المسارات الكيميائية الحيوية ، الكوليسترول هو مكون ضروري لوظيفة الخلية والجهاز الطبيعي. ونتيجة لذلك، يؤدي نقص الكوليسترول إلى تشوهات جسدية حادة ومجموعة متنوعة من الاضطرابات. من ناحية أخرى ، حتى زيادة صغيرة في الكوليسترول فوق المستويات الفسيولوجية (2-3x) هي سامة للخلايا1،2،10 وقد ارتبطت بتطور الاضطرابات ، بما في ذلك أمراض القلب والأوعية الدموية11،12،13 والأمراض العصبية التنكسية14،15،16،17. وهكذا، لاستجواب الوظائف الحرجة للكولسترول وتحديد تأثير التغيرات في مستويات الكوليسترول، تم تطوير النهج المختلفة التي تغير محتوى الكوليسترول في الأنسجة والخلايا والبويضات Xenopus.

تغير مستويات الكوليسترول في أنسجة الثدييات والخلايا
يمكن تسخير العديد من النهج لتقليل مستويات الكوليسترول في الأنسجة والخلايا18. نهج واحد ينطوي على تعرضهم للستاتين الذائبة في مصل نقص البروتين الدهني لمنع اختزال HMG-CoA, الذي يتحكم في معدل تخليق الكوليسترول19,,20. ومع ذلك ، فإن هذه الأدوية المخفضة للكوليسترول تمنع أيضًا تشكيل منتجات غير ستيرول على طول مسار الميفالونات. لذلك ، يتم إضافة كمية صغيرة من الميفالونات للسماح بتشكيل هذه المنتجات21 وتعزيز خصوصية هذا النهج. نهج آخر لخفض مستويات الكوليسترول ينطوي على استخدام α-cyclodextrins. هذه مونومرات glucopyranose تمتلك تجويف الهيدروفوبيا الداخلية مع القطر الذي يطابق حجم الستيرول22، مما يسهل استخراج الكوليسترول من الخلايا ، وبالتالي استنزافها من محتواها الأصلي الكوليسترول23. مثال على ذلك هو 2-هيدروكسي بروبيل-α-cyclodextrin (HPαCD)، وهو دواء ما قبل السريرية التي يجري اختبارها حاليا لعلاج مرض نيمان بيك من النوع C، وهو اضطراب التمثيل الغذائي القاتل الموروثة وراثيا تتميز تخزين الكوليسترول الليسوسومي24. مستوى نضوب الكوليسترول يعتمد على مشتق معين المستخدمة. على سبيل المثال ، يستخرج HPαCD الكوليسترول بسعة أقل من مشتق الميثيل ، ميثيل - α - سيكلوديكسترين (MαCD)24،25، 26،27،,2828،29،30. ومع ذلك ، ومع ذلك ، يمكن أن استخراج الجزيئات الأخرى الكارهة للماء بالإضافة إلى الكوليسترول ، والتي قد تؤدي بعد ذلك إلى آثار غير محددة31. على النقيض من النضوب ، يمكن إثراء الخلايا والأنسجة على وجه التحديد مع الكوليسترول من خلال العلاج مع α-cyclodextrin التي تم تشبعها مسبقًا بالكوليسترول23. ويمكن أيضا أن تستخدم هذا النهج كعنصر تحكم لخصوصية α-cyclodextrins المستخدمة لاستنفاد الكوليسترول31. استنفاد الكوليسترول من الأنسجة والخلايا أمر مباشر ويمكن تحقيقه عن طريق تعريض الخلايا لمدة 30-60 دقيقة إلى 5 mm MαCD مذابة في المتوسط المستخدم لتخزين الخلايا. هذا النهج يمكن أن يؤدي إلى انخفاض بنسبة 50٪ في محتوى الكوليسترول (على سبيل المثال، في الخلايا العصبية فرس النهر32، الشرايين الدماغية الفئران33). من ناحية أخرى ، يعد مجمع الكوليسترول في الدم لتخصيب الكوليسترول في الأنسجة والخلايا أكثر تعقيدًا ، وسيتم وصفه في قسم البروتوكول.

نهج بديل لإثراء الأنسجة والخلايا باستخدام α-cyclodextrin المشبعة الكوليسترول ينطوي على استخدام LDL, الذي يعتمد على مستقبلات LDL أعرب في الأنسجة / الخلايا18. في حين أن هذا النهج يوفر ميزة استخدام آلات التوازن الكوليسترول الطبيعي في الخلية ، إلا أن لديها العديد من القيود. أولاً، لا يمكن إثراء الأنسجة والخلايا التي لا تعبر عن مستقبلات LDL باستخدام هذا النهج. ثانياً، تحتوي جزيئات LDL على دهون أخرى بالإضافة إلى الكوليسترول. على وجه التحديد، LDL يتكون من البروتين ApoB100 (25٪) والدهون التالية (75٪): ~ 6-8٪ الكوليسترول، ~ 45-50٪ استر cholesteryl، ~ 18-24٪ فوسفوليبيدات، و ~ 4-8٪ triacylglycerols34. وبالتالي ، فإن تسليم الكوليسترول عبر جزيئات LDL غير محدد. ثالثا، قد تكون نسبة الزيادة في محتوى الكوليسترول من قبل LDL في الأنسجة والخلايا التي تعبر عن مستقبلات LDL أقل بكثير من الزيادة التي لوحظت باستخدام السيكلودكسترين المشبعة بالكوليسترول. على سبيل المثال ، في دراسة سابقة ، أدى إثراء الشرايين الدماغية القوارض مع الكوليسترول عن طريق LDL إلى زيادة 10-15٪ فقط في مستويات الكوليسترول35. في المقابل، أدى إثراء هذه الشرايين مع السيكلوديكسترين المشبعة الكوليسترول كما هو موضح في قسم البروتوكول في > 50٪ زيادة في محتوى الكوليسترول (انظر قسم النتائج التمثيلية، الشكل 1).

تغيير مستويات الكوليسترول في البويضات Xenopus
تشكل البويضات الزينية نظام تعبير غير يروج يستخدم عادة لدراسة وظيفة الخلية والبروتين. وقد أظهرت الدراسات السابقة أن نسبة الكوليسترول إلى الفوسفوليبيد المولي في البويضات Xenopus هو 0.5 ± 0.136. بسبب هذا المستوى المرتفع الجوهري من الكوليسترول ، فإن زيادة محتوى الكوليسترول في هذا النظام أمر صعب ، ومع ذلك يمكن تحقيقه باستخدام التشتت اتّسابه من فوسفوليبيدات الغشاء والكوليسترول. الفوسفوليبيدات التي اخترناها لهذا الغرض مماثلة لتلك المستخدمة لتشكيل ثنائيات الدهون البلانية الاصطناعية وتشمل L-α-phosphatidylethanolamine (البابا) و 1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phospho-l-serine (POPS)، كما هو موضح في قسم البروتوكول. يمكن أن يؤدي هذا النهج إلى زيادة بنسبة 50٪ في محتوى الكوليسترول (انظر قسم النتائج التمثيلية، الشكل 2).

نهج بديل لإثراء البويضات Xenopus مع التشتت القائم على الفوسفوليبيد ينطوي على استخدام السيكلوديكسترين المشبعة الكوليسترول، والتي تشبه الطريقة التي يتم إثراء الأنسجة والخلايا. ومع ذلك ، وجدنا أن هذا النهج منخفض القابلية للاستنساخ والكفاءة ، مع زيادة في متوسط ~ 25٪ في محتوى الكوليسترول. وربما يرجع ذلك إلى اختلاف قدرة التحميل على هذين النهجين (انظر قسم النتائج التمثيلية، الشكل 3). في المقابل، فقد تبين أن استخدام السيكلوديكسترين لاستنفاد الكوليسترول من البويضات Xenopus يمكن أن يؤدي إلى انخفاض ~ 40٪ في محتوى الكوليسترول36.

هنا، ونحن نركز على إثراء الكوليسترول من أنسجة الثدييات والخلايا من خلال تطبيق السيكلوديكسترين المشبعة الكوليسترول، وoocytes Xenopus باستخدام الليبوزومات. ويمكن تسخير كلا النهجين لتحديد تأثير زيادة مستويات الكوليسترول في الدم على وظيفة البروتين. قد تنطوي آليات تعديل الكوليسترول في وظيفة البروتين على تفاعلات مباشرة8 و / أو تأثيرات غير مباشرة9. عندما يؤثر الكوليسترول على وظيفة البروتين من خلال التفاعلات المباشرة ، فإن تأثير زيادة مستويات الكوليسترول على نشاط البروتين من المرجح أن يكون مستقلًا عن نوع الخلية أو نظام التعبير أو نهج الإثراء. على سبيل المثال، استوعنا هذين النهجين لتحديد تأثير الكوليسترول على G-بروتين مسور ة داخليتصحيح قنوات البوتاسيوم (GIRK) أعرب في myocytesالأذين37،الخلايا العصبية فرس النهر32،38، HEK29339 الخلايا ، وأوسيتس Xenopus 32،37. وكانت النتائج التي تم الحصول عليها في هذه الدراسات متسقة: في جميع الأنواع الثلاثة من خلايا الثدييات وفي البويضات البرمائية الكولسترول upregulationed وظيفة قناة GIRK (انظر قسم النتائج التمثيلية، الشكل 4،للخلايا العصبية فرس النهر والتجارب المقابلة في oocytes Xenopus). وعلاوة على ذلك، كانت الملاحظات التي أبديت في هذه الدراسات أيضا متسقة مع نتائج الدراسات التي أجريت في myocytes الأذينية37،40 وخلايا فرس النهر32،38 معزولة حديثا عن الحيوانات التي تتعرض لنظام غذائي عالي الكوليسترول40. وتجدر الإشارة إلى أن تخصيب الكوليسترول في الخلايا العصبية فرس النهر باستخدام MαCD عكس تأثير العلاج أتورفاستاتين المستخدمة لمعالجة تأثير النظام الغذائي ارتفاع الكوليسترول على حد سواء على مستويات الكوليسترول ووظيفة GIRK38. في دراسات أخرى، قمنا بدراسة تأثير الطفرات على حساسية الكوليسترول في قناة البوتاسيوم تصحيح داخلي Kir2.1 باستخدام كل من oocytes Xenopus وHEK293 خلايا41. مرة أخرى ، كان تأثير الطفرات على حساسية القناة مماثلًا في النظامين.

تطبيقات كل من أساليب التخصيب لتحديد تأثير ارتفاع مستويات الكوليسترول في الدم على الجزيئية، الخلوية، وظيفة الجهاز عديدة. على وجه الخصوص ، فإن استخدام مجمعات الكوليسترول السيكلوديكسترين لإثراء الخلايا والأنسجة شائع جدًا ويرجع ذلك إلى حد كبير إلى خصوصيته. وتشمل الأمثلة الحديثة على هذا النهج تحديد تأثير الكوليسترول على تنشيط قناة HERG والآليات الأساسية42، واكتشاف أن الكوليسترول ينشط مستقبلات البروتين G المقترنة الملساء لتعزيز القنفذ إشارة43، وتحديد دور الكوليسترول في الميكانيكا الحيوية للخلايا الجذعية وadipogenesis من خلال البروتينات الرابط المرتبطة الغشاء44. في عملنا الخاص، وأننا تستخدم إثراء أنسجة الثدييات مع MαCD: مجمع الكوليسترول لدراسة تأثير تخصيب الكوليسترول على الوظيفة الأساسية والشخصية الدوائية من قنوات الكالسيوم والجهد المسورة من التوصيلات الكبيرة (BK، MaxiK) في العضلات الملساء الأوعية الدموية35،45،46. في دراسات أخرى، استخدمنا نهج التشتت القائم على الفوسفوليبيد لإثراء oocytes Xenopus مع الكوليسترول لتحديد أدوار المناطق المختلفة في Kir2.1 وقنوات GIRK في حساسية الكوليسترول41،47،48،49، وكذلك لتحديد مواقع ربط الكوليسترول المفترضة في هذه القنوات32،50،51.47

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

تم تنفيذ جميع الإجراءات التجريبية مع الحيوانات في مركز العلوم الصحية بجامعة تينيسي (UTHSC). تم مراجعة رعاية الحيوانات والبروتوكولات التجريبية والموافقة عليها من قبل لجنة رعاية الحيوانات واستخدامها التابعة لـ UTHSC ، وهي مؤسسة معتمدة من قبل جمعية تقييم واعتماد المنظمة الدولية لرعاية الحيوانات المختبرية.

1. إثراء الأنسجة والخلايا باستخدام ميثيل-α-cyclodextrin المشبعة الكوليسترول

ملاحظة: بروتوكول تخصيب الكوليسترول أدناه مناسب للأنسجة والخلايا وخطوط الخلايا. على سبيل المثال، نحن نصف الخطوات التي أجريت لإثراء الشرايين الدماغية الثدييات. يتم توفير النتائج التمثيلية لكل من الشرايين الدماغية(الشكل 1)والخلايا العصبية(الشكل 4).

  1. إعداد MαCD المشبعة بالكوليسترول
    1. وزن 0.064 غرام من MαCD وتذوبه في قارورة تحتوي على 10 مل من محلول المالحة المخزنة بالفوسفات (PBS) للحصول على تركيز نهائي من MαCD 5 mM. حرك الحل بشريط ضجة لضمان حل MαCD بالكامل.
    2. وزن 0.0024 غرام من مسحوق الكوليسترول وإضافته إلى نفس القارورة للحصول على تركيز الكوليسترول 0.63 mM. ثم حرك الحل بقوة. استخدام ملعقة لتفريق أكبر عدد ممكن من قطع الكوليسترول (بعض قطع ستبقى حتى الحضانة).
    3. تغطية قارورة مع طبقتين على الأقل من فيلم البارافين ويهز ببطء (~ 30 التذبذبات / دقيقة) في حمام المياه 37 درجة مئوية بين عشية وضحاها. هذه الخطوة حاسمة.
    4. بعد 8-16 ساعة، قم بتبريد المحلول لدرجة حرارة الغرفة (RT)، ثم قم بتصفيته من خلال فلتر حقنة البولي إيثرسولفون 0.22 ميكرومتر في زجاجة زجاجية.
      ملاحظة: للوصول إلى تركيزات الكوليسترول المختلفة في الحل، قم بضبط كميات كل من الكوليسترول وMαCD بنسبة بسيطة. من المهم الحفاظ على نسبة مولر MαCD: الكوليسترول في 8:1 للحصول على تشبع حامل الميثيل-α-cyclodextrin مع الكوليسترول. يمكن استخدام محلول تخصيب الكوليسترول على الفور أو على مدار عدة أيام إذا تم تخزينه عند 4 درجات مئوية. ومع ذلك ، فإن القدرة على إثراء الكوليسترول تنخفض مع مرور الوقت مع ظهور مجاميع الكوليسترول ، ويصبح الحل غائمًا.
  2. علاج الشرايين الدماغية مع MαCD المشبعة بالكوليسترول
    1. القتل الرحيم الجرذ سبراغ داولي (250-300 ز) عن طريق وضعه في غرفة مع 2٪ isoflurane. ثم، قطع رأس الفئران مثير للسمرة باستخدام مقصلة حادة أو زوج حاد كبير من مقص.
      ملاحظة: إذا كان تنفيذ هذه الإجراءات بانتظام، فمن المفيد وضع جدول زمني لشحذ المقصلة. أيضا، ينبغي تخصيص زوج منفصل من مقص لقطع الرأس القوارض. قطع رأس القوارض هو إجراء نهائي. لذلك ، لا يجب أن تكون الأدوات عقيمة. التنظيف بالماء والصابون بعد كل استخدام يكفي.
    2. ضع رأس الجرذ مواجهاً للأمام بعيداً عن الباحث ضع الجزء المدبب من زوج متوسط الحجم من المقص بين الجمجمة وجذع الدماغ ، وتقطع بشكل لاحق على كلا الجانبين.
    3. استخدام ملقط لابعاد الجمجمة العليا مفتوحة عن طريق سحب ما يصل على قاعدة الجمجمة حيث تم إجراء التخفيضات الجانبية وإزالة الدماغ بعناية. تأكد من قطع الأعصاب البصرية التي تعقد الدماغ داخل الجمجمة.
    4. وضع الدماغ في كوب مع برنامج تلفزيوني على الجليد بعد إزالته.
      ملاحظة: يمكن تخزين الدماغ على الجليد لمدة 4-6 ساعة في 4 درجة مئوية.
    5. في بيئة غير معقمة نقل الدماغ الفئران إلى وعاء تشريح مشمع مع ما يكفي من برنامج تلفزيوني لغمره. دبوس الدماغ إلى أسفل لمنعها من التحرك.
      ملاحظة: الخطوة 1.2.5 يمكن تنفيذها في RT إذا تم تنفيذها بسرعة. خلاف ذلك، فإنه يجب أن يتم على الجليد.
    6. استخدام ملقط حادة ومقص الجراحية الصغيرة لتشريح الشرايين الدماغية وفروعها التي تشكل دائرة وليس في قاعدة الدماغ تحت المجهر في برنامج تلفزيوني في RT. كن لطيف عند تشريح لضمان عدم تمدد أنسجة الشريان أو قطعها. هذه الخطوة حاسمة.
    7. شطف شرائح الشريان لفترة وجيزة (تصل إلى 1 سم طويلة) في برنامج تلفزيوني إما في لوحة بئر 96 أو في طبق 35 ملم لإزالة بقايا الدم، ومن ثم وضعها لمدة 10 دقيقة في ما يكفي من محلول تخصيب الكوليسترول (أعدت في الخطوة 1.1) لتغطية شرائح الشريان بأكملها. استخدم طبقًا من 35 مم إذا كان هناك كمية وافرة من محلول تخصيب الكوليسترول وطبق بئر 96 إذا كانت الشرايين صغيرة أو إذا كان هناك نقص في محلول تخصيب الكوليسترول.
      ملاحظة: يمكن استخدام نفس النهج لإثراء الأنسجة والخلايا الأخرى مع الكوليسترول باستخدام وقت حضانة 60 دقيقة. على سبيل المثال، وقد استخدمت هذه الطريقة سابقا لتخصيب الكوليسترول من الشرايين الدماغية الماوس35،45، خلايا فرس النهر32، myocytes الأذين37 ، وHEK 293 الخلايا39.37 يجب تحديد الحد الأدنى من وقت الحضانة لكل نوع من الأنسجة أو الخلايا استنادًا إلى التحقق من تخصيب الكوليسترول في نقاط زمنية مختلفة مع قياس حساس للكوليسترول (على سبيل المثال ، التحديد الكيميائي الحيوي لكمية الكوليسترول في الأنسجة عن طريق تلطيخ مع صبغة الفلورسين الحساسة للكوليسترول.
  3. وصمة عار أنسجة الشريان مع صبغة الفلورسين الحساسة الستيرويد فلبيني لتحديد أي تعديلات في مستويات الكوليسترول في الدم.
    ملاحظة: في قسم النتائج التمثيلية، نبين نتائج نهجين لتقييم التغيرات في مستويات الكوليسترول: فحص كيميائي حيوي يتم تنفيذه من خلال تطبيق مجموعة تعتمد على الكوليسترول الأوكسيديز يتوافر تجارياً (انظر جدول المواد)وتلطيخ مع صبغة الفلورسين الحساسة للالستيرويد. يمكن تنفيذ النهج الأول باتباع تعليمات الشركة المصنعة. ويرد أدناه بروتوكول النهج الأخير.
    1. باستخدام زجاجة جديدة من مسحوق فيليبين، وإعداد محلول مخزون 10 ملغ/مل في ثنائي ميثيل سلفوكسيد (DMSO). هذه الخطوة حاسمة.
      ملاحظة: الحل الناتج حساس للضوء. إذا أعدت بشكل صحيح، حل الأسهم فيليبين هو مصفر. قد يلتصق بعض مسحوق الفلبينيين بغطاء الزجاجة. لذلك ، من المهم شطف الزجاجة والغطاء مع مذيب DMSO للاحتفاظ بالكمية الكاملة من الفلبينية. بمجرد إعدادها ، يجب استخدام مخزون الفلبينيين في غضون عدة أيام. فيليبين يفقد تماما قدرته على الفلورسين بعد 5 أيام، حتى عندما يتم تخزينها في الظلام في -20 درجة مئوية.
    2. إزالة شرائح الشريان من محلول تخصيب الكوليسترول وغسلها 3x مع برنامج تلفزيوني لمدة 5 دقيقة.
    3. إصلاح شرائح الشريان في 4٪ paraformaldehyde لمدة 15 دقيقة على الجليد.
      تنبيه: بارافورمالديهايد حساس للضوء. ولذلك، يجب أن يتم العمل في الظلام.
    4. وضع شرائح الشريان في 0.5٪ تريتون في برنامج تلفزيوني في RT لمدة 10 دقيقة لpermeabilize الأنسجة وتسهيل تغلغل الصبغة.
    5. غسل شرائح الشريان 3x مع برنامج تلفزيوني لمدة 5 دقيقة على شاكر. هذه الخطوة حاسمة.
      ملاحظة: عندما تم غسلها تماما تريتون، لا ينبغي أن يكون هناك أي فقاعات على سطح محلول PBS.
    6. تمييع محلول الأسهم الفلبينية في PBS إلى تركيز نهائي قدره 25 ميكروغرام/مل. إزالة الشرايين تشكل محلول PBS ووضعها في محلول فيليبين المخفف لمدة 1 ساعة في الظلام. هذه الخطوة حاسمة.
    7. غسل فيليبين عن طريق الرصال ة شرائح الشريان 3x مع PBS لمدة 5 دقيقة على شاكر. هذه الخطوة حاسمة.
    8. شطف شرائح الشريان لفترة وجيزة بالماء المقطر، وامتصاص السائل المفرط مع منديل ورقة، وجبل الشرايين على شريحة باستخدام وسائل الإعلام التركيب المتاحة تجاريا (انظر جدول المواد).
    9. غطي الشريان بقسيمة غطاء تتجنب المتداول أو التواء الشريان وتعيين الشرائح لتجف في منطقة مظلمة في RT لمدة 24 ساعة.
    10. بعد أن يجف وسائل الإعلام المتصاعدة، ختم حواف غطاء مع طلاء الأظافر واضحة، وترك طلاء الأظافر لتجف لمدة 10-15 دقيقة. تخزين الشرائح في الظلام في -20 درجة مئوية.
    11. معادلة الشرائح إلى RT قبل التصوير.
    12. صورة الأنسجة مع المجهر الفلوري أو قارئ الفلورسينس مع الإثارة تعيين في 340-380 نانومتر والانبعاثات في 385-470 نانومتر.
      تنبيه: فيليبين photobleaches بسرعة; وبالتالي ، يجب أن يتم عرض العينات على الفور.

2. إثراء البويضات Xenopus باستخدام التشتت القائم على الفوسفوليبيد الغني بالكوليسترول (الليبوزومات)

  1. إعداد الحلول
    1. لإعداد محلول مخزون من الكوليسترول ، قم بإذابة 10 ملغ من مسحوق الكوليسترول في 1 مل من الكلوروفورم في كوب زجاجي أو زجاجة 10 مل. نقل الحل إلى زجاجة مغطاة بـ 1.5 مل.
      تنبيه: في ضوء سمية الكلوروفورم والتبخر السريع له، اعمل في غطاء محرك السيارة والحفاظ على الكواشف على الجليد.
    2. إعداد 150 mM KCl، 10 mM تريس-HEPES، درجة الحموضة = 7.4 المخزن المؤقت للفوسفوليبيدات المخصب بالكوليسترول. للقيام بذلك، حل في قارورة Erlenmeyer 5.5905 غرام من KCl و 0.6057 غرام من تريس في الماء المقطر المزدوج إلى ما مجموعه 0.5 لتر حجم. في قارورة أخرى، حل 5.5905 غرام من KCl و 1.19155 غرام من HEPES في الماء المقطر المزدوج إلى ما مجموعه 0.5 لتر حجم. اخلطي الحلين معًا في قارورة 1 لتر إرلنماير، وضبط درجة الحموضة إلى 7.4 مع HCl.
      ملاحظة: تخزين الناتج 150 mM KCl، 10 mM تريس-HEPES الحل في 4 درجة مئوية.
    3. لإعداد ND96 قبل المتوسطة oocyte عبادة (منخفضة K+، منخفضة Ca2 +) العازلة، والجمع بين 1 مل من 2 M KCl، 1 مل من 1 M MgCl2،45.5 مل من 2 M NaCl، و 5 مل من 1/1 M NaOH-HEPES في قارورة 1 لتر Erlenmeyer. أضف الماء المقطر المزدوج بسعة 900 مل وضبط درجة الحموضة إلى 7.4 مع HCl. انقل المحلول إلى أسطوانة 1 لتر وارفع مستوى الصوت إلى 1 لتر مع الماء المقطر المزدوج. ثم إضافة 1.8 مل من 1 M CaCl2 وتصفية الحل.
      ملاحظة: لا يبدو أن الاختلافات الطفيفة في النسب بين المكونات المستخدمة في صنع حل ND96 حاسمة لتخصيب الكوليسترول، ربما لأن محلول ND96 لا يستخدم أثناء خطوة التخصيب نفسها ولكن للتخزين. مثال على ذلك هو محلول 1 L يحتوي على تركيز أقل قليلاً من أيونات الصوديوم وكلوريد ، ويتم ذلك عن طريق الجمع بين 2 مل من 1 M KCl ، 1 مل من 1 M MgCl2، 82.5 مل من 1 M NaCl ، 5 مل من 1 M HEPES ، و 1.8 مل من 1 M CaCl2 (Ca2 + يتم حذفها للحصول على حل Ca 2+ مجاني). ضبط درجة الحموضة من الحل إلى 7.4 مع NaOH. تخزين الناتج ND96 oocyte حل التبهي في 4 درجة مئوية لمدة تصل إلى 1 شهر.
  2. إعداد التشتت القائم على الفوسفوليبيد مع الليبوزومات الكوليسترول
    1. في أنبوب زجاجي 12 مل، اجمع بين 200 ميكرولتر من كل من محاليل الدهون المذابة ذات الـ 10 ملغ/مل التالية: L-α-phosphatidylethanolamine, 1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phospho-l-serine, والكوليسترول.
    2. يتبخر الكلوروفورم في غطاء محرك السيارة ليجف ببطء تحت تيار من النيتروجين. هذه الخطوة حاسمة.
    3. تعليق الدهون في 800 ميكرولتر من محلول المخزنة المؤقتة تتكون من 150 mM KCl و 10 mM Tris-HEPES في درجة الحموضة = 7.4، وتغطية مع فيلم البارافين.
    4. سونيكات بلطف في 80 كيلو هرتز لمدة 10 دقيقة حتى يتم تشكيل خليط حليبي. هذه الخطوة حاسمة.
      تنبيه: عند سونيكاتينج، يجب أن يهتز التشتت في الأنبوب الزجاجي بلطف، وتشكيل موجات صغيرة. قطرات من التشتت لا ينبغي أن يكون القفز داخل الأنبوب.
  3. إثراء البويضات Xenopus مع الكوليسترول
    ملاحظة: يمكن الحصول على المبيضين المحتويين على البويضات من مصدرين: أولاً، يمكن إيواء ضفادع الإناث Xenopus laevis لغرض الجراحة الداخلية. ويجب أن توافق اللجنة المؤسسية لرعاية الحيوانات واستخدامها على هذا الإجراء. ثانياً، يمكن شراء المبيضين الكاملين من الموردين التجاريين. كبديل لشراء أو عزل المبيضين الكاملين ثم هضمها كما هو موضح في الخطوات 2.3.1-2.3.4 ، تتوفر البويضات الفردية تجاريًا للشراء. إذا تم استخدام هذا الأخير، يمكن تخطي الخطوات 2.3.1-2.3.4.
    1. الحفاظ على المبيضين الطازجة في ~ 14 درجة مئوية في محلول ND96. في ظل هذه الظروف، يمكن تخزين المبيضين لمدة تصل إلى أسبوع واحد.
    2. للحصول على البويضات الفردية، اعطل كيس المبيض في أماكن متعددة باستخدام ملقط حادة. ضع قطع المبيض في لوحة 60 مم، مع 5 مل من Ca2+-FREE ND96 مُكمّلة بـ 0.5 ملغم/مل كولاكولاز. يهز على شاكر المداري في 60 التذبذبات / دقيقة لمدة 15 دقيقة في RT.
      ملاحظة: ستضمن هذه الخطوة هضم كيس المبيض. للحفاظ على النشاط الأنزيمي، تجنب تخزين الكولاجين الذي يحتوي على ND96 لفترات طويلة من الزمن (> 1 ساعة). حتى التخزين القصير يجب أن يتم في درجات حرارة باردة من تحت 15 درجة مئوية.
    3. باستخدام ماصة نقل مع طرف واسع، ماصة بقوة الحل المحتوي على oocyte صعودا وهبوطا ما يقرب من 5-10x لفصل oocytes الفردية. في هذه الخطوة، سوف يتحول الحل إلى الظلام.
    4. شطف بسرعة oocytes مع Ca2 +خالية ND96 حتى يصبح الحل شفافا.
    5. نقل البويضات الفردية إلى Ca2+-التي تحتوي على حل ND-96 المكمل ة بـ 2 ملغم/مل من جنتاميسين باستخدام ماصة نقل مع طرف ضيق.
      ملاحظة: هذه الخطوة ضرورية عندما يكون من الضروري تخزين البويضات. يمكن تخزين البويضات الفردية في حاضنة لعدة أيام عند 14-17 درجة مئوية. ومع ذلك ، يجب إزالة البويضات الميتة التي هي بيضاء على الأقل مرة واحدة في اليوم لتجنب تلوث المحلول بالمواد الكيميائية السامة.
    6. نقل 90 ميكرولتر من التشتت القائم على الفوسفوليبيد المخصب بالكوليسترول إلى بئر واحد من طبق بئر 96.
    7. نقل ما يصل إلى ستة oocytes من المتوسط ND96 إلى البئر مع أقل قدر ممكن من المتوسطة. هذه الخطوة حاسمة.
      تنبيه: لا تعرض البويضات للهواء أثناء النقل للحفاظ على البويضات سليمة.
    8. ضع لوحة البئر 96 على دوار منصة ثلاثية الأبعاد لتوفير حركة مدارية صغيرة للبويضات في الخلية لمدة 5-10 دقيقة.
    9. إضافة قطرة من ND96 في البئر، ونقل البويضات المخصب بالكوليسترول من لوحة البئر 96 إلى لوحة 35 ملم مع ND96 للاستخدام الفوري. هذه الخطوة حاسمة.
    10. استخدام مجموعة المتاحة تجاريا للكوليسترول الأوكسيديز (انظر جدول المواد)لتقييم التغيرات في مستويات الكوليسترول باتباع تعليمات الشركة المصنعة.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

النتائج

استخدام السيكلوديكسترين المشبعة بالكوليسترول كوسيلة لإثراء الأنسجة والخلايا مع الكوليسترول هو راسخ. هنا، ونحن أول من إظهار تطبيق هذا النهج المستخدمة على نطاق واسع لإثراء الشرايين الدماغية الفئران مع الكوليسترول باستخدام MβCD المشبعة الكوليسترول. يوضح الشكل...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

تشكل طرق إثراء أنسجة الثدييات والخلايا وأوسيتس زينوبوس مع الكوليسترول أداة قوية للتحقيق في تأثير مستويات الكوليسترول المرتفعة على الأنواع الجزيئية الفردية ، وعلى الأنظمة الجزيئية المعقدة (مثل البروتينات) ، وعلى وظيفة الجهاز الخلوي والجهاز. وقد وصفنا في هذه الورقة نهجين متكاملين يي...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

الدكتور أ. م. دوبيكو هو موظف فيدرالي خاص وبدوام جزئي وعضو حالي في المجلس الاستشاري الوطني المعني بتعاطي الكحول وإدمان الكحول.

Acknowledgements

تم دعم هذا العمل من قبل منحة تطوير العلماء (11SDG5190025) من جمعية القلب الأمريكية (إلى A.R.D.) ، والمعهد الوطني للصحة R01 يمنح AA-023764 (إلى A.N.B.) ، وHL-104631 و R37 AA-11560 (إلى A.M.D).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
Amplex Red Cholesterol Assay KitInvitrogenA12216
Pierce BCA Protein Assay KitThermo Scientific23225
Pre-Diluted Protein Assay Standards BSA setThermo Scientific23208
Brain PE 25Mg in ChloroformAvanti Lipids840022C
16:0-18:1 PS 25Mg ChloroformAvanti Lipids840034C
Cholesterol 100Mg PowderSigmaC8667
KClFisherP217
Trizma baseSigmaT6066
HEPESCorning61-034-RO
MgCl2FisherM33
NaClFisherS271
KH2PO4FisherP285
MgSO4EMD ChemicalsMX0070-1
EDTAVWRE177
Dextrose AnhydrousFisherBP350
NaHCO3SigmaS6014
CaCl2SigmaC3881
Blood Gas TanknexAir
NaOHFisherS318
1.5mL tubesFisherS35818
Gastight Syringe 100uLHamilton1710
Microliter Syringe 25uLHamilton702
12 mL heavy duty conical centrifuge beaded rim tubePyrex8120-12
ChloroformFisherC298
Support StandHomescience ToolsCE-STAN5X8
Universal Clamp, 3-ProngHomescience ToolsCE-CLPUNIV
SonicatorLaboratory SuppliesG112SP1G
3D rotator mixerBenchmark ScientificB3D 1308
96 well plateSigmaBR781602
N2 gasnexAir
Glass beakers 40ml-1LFisher02-540
Ice MachineScotsmanCU1526MA-1
Ice bucketFisher50-136-7764
1X PBSCorning21-031-CM
TritonXFisherBP151-100
Sonic DismembratorFisherModel 100
Eppendorf microcentrifugeEppendorfModel 5417R
Amber bottlesFisher03-251-420
Corning™ Disposable Glass Pasteur PipetsFIsher13-678-4A
ParafilmFIsher50-998-944
Isotemp™ BOD Refrigerated IncubatorFIsher97-990E
OocytesXenoocyte™10005
RatEnvigoSprague Dawleyweight 250g
Methyl-β-cyclodextrinSigmaC4555
Water bath incubator with shakerPrecision51221080Lowest shaker setting O/N 37 °C
FilipinSigmaSAE0088-1ML
DMSOFisherBP231
Paraformaldehyde 4%Mallinckrodt2621
DI H2OUniversity DI source
ProLong Gold antifade reagnetInvitrogenP10144
Microslides 75x25mm FrostedDiaggerG15978A
ForcepsFine Science Tools11255-20
Microscope CoverslipDiaggerG15972B
Clear nail polishRevlon771 Clear
Labeling TapeFisher15-901-20F
Securline Lab Marker IISigmaZ648205-5EA
BD 10mL SyringeFisher14-823-16E
1.2 μm syringe filterVWR28150-958
KimWipesFisher06-666A
pH probeSartoruspy-p112s
pH meterDenver instrumentModel 225
70% ETOHPharmco211USP/NF
TimerFisher02-261-840
Steno bookStaples163485

References

  1. Yeagle, P. L. Cholesterol and the cell membrane. Biochimica et Biophysica Acta. 822, 267-287 (1985).
  2. Yeagle, P. L. Modulation of membrane function by cholesterol. Biochimie. 73, 1303-1310 (1991).
  3. Gimpl, G., Burger, K., Fahrenholz, F. Cholesterol as modulator of receptor function. Biochemistry. 36, 10959-10974 (1997).
  4. Maxfield, F. R., van Meer, G. Cholesterol, the central lipid of mammalian cells. Current Opinion in Cell Biology. 22, 422-429 (2010).
  5. Goluszko, P., Nowicki, B. Membrane cholesterol: a crucial molecule affecting interactions of microbial pathogens with mammalian cells. Infection and Immunity. 73, 7791-7796 (2005).
  6. Ramprasad, O. G., et al. Changes in cholesterol levels in the plasma membrane modulate cell signaling and regulate cell adhesion and migration on fibronectin. Cell Motility and Cytoskeleton. 64, 199-216 (2007).
  7. Rosenhouse-Dantsker, A., Mehta, D., Levitan, I. Regulation of Ion Channels by Membrane Lipids. Comprehensive Physiology. 2, 31-68 (2012).
  8. Direct mechanisms in cholesterol modulation of protein function. Advances in Experimental Medicine and Biology. Rosenhouse-Dantsker, A., Bukiya, A. N. , Springer Nature. Switzerland. 1135(2019).
  9. Cholesterol modulation of protein function: sterol specificity and indirect mechanisms. Advances in Experimental Medicine and Biology. Rosenhouse-Dantsker, A., Bukiya, A. N. , Springer Nature. Switzerland. 1115(2019).
  10. Kellner-Weibel, G., Geng, Y. J., Rothblat, G. H. Cytotoxic cholesterol is generated by the hydrolysis of cytoplasmic cholesteryl ester and transported to the plasma membrane. Atherosclerosis. 146, 309-319 (1999).
  11. Kruth, H. S. Lipoprotein cholesterol and atherosclerosis. Current Molecular Medicine. 1, 633-653 (2001).
  12. Ross, R. Atherosclerosis--an inflammatory disease. The New England Journal of Medicine. 340, 115-126 (1999).
  13. Steinberg, D. Atherogenesis in perspective: hypercholesterolemia and inflammation as partners in crime. Nature Medicine. 8, 1211-1217 (2002).
  14. Ho, Y. S., Poon, D. C. H., Chan, T. F., Chang, R. C. C. From small to big molecules: How do we prevent and delay the progression of age- related neurodegeneration? Current Pharmaceutical Design. 18, 15-26 (2012).
  15. Stefani, M., Liguri, G. Cholesterol in Alzheimer's disease: Unresolved questions. Current Alzheimer Research. 6, 15-29 (2009).
  16. Ong, W. Y., Halliwell, B. Iron, atherosclerosis, and neurodegeneration: A key role for cholesterol in promoting iron-dependent oxidative damage? Annals of the New York Academy of Sciences. 1012, 51-64 (2004).
  17. Igoumenou, A., Ebmeier, K. P. Diagnosing and managing vascular dementia. Practitioner. 256, 13-16 (2012).
  18. Luu, W., Gelissen, I. C., Brown, A. J. Manipulating Cholesterol Status Within Cells. Methods in Molecular Biology. 1583, 41-52 (2017).
  19. Egom, E. E. A., Hafeez, H. Biochemistry of statins. Advances in Clinical Chemistry. 73, 127-168 (2016).
  20. Igel, M., Sudhop, T., von Bergmann, K. Pharmacology of 3-hydroxy-3-methylglutaryl-coenzyme A reductase inhibitors (statins), including rosuvastatin and pitavastatin. Journal of Clinical Pharmacology. 42, 835-845 (2002).
  21. Nakanishi, M., Goldstein, J. L., Brown, M. S. Multivalent control of 3-hydroxy-3-methylglutaryl coenzyme A reductase. Mevalonate-derived product inhibits translation of mRNA and accelerates degradation of enzyme. The Journal of Biological Chemistry. 263, 8929-8937 (1988).
  22. López, C. A., de Vries, A. H., Marrink, S. J. Molecular Mechanism of Cyclodextrin Mediated Cholesterol Extraction. PLoS Computational Biology. 7, e1002020(2011).
  23. Christian, A. E., Haynes, M. P., Phillips, M. C., Rothblat, G. H. Use of cyclodextrins for manipulating cellular cholesterol content. Journal of Lipid Research. 38, 2264-2272 (1997).
  24. Dai, S., et al. Methyl-β-cyclodextrin restores impaired autophagy flux in Niemann-Pick C1-deficient cells through activation of AMPK. Autophagy. 13, 1435-1451 (2017).
  25. Chen, F. W., Li, C., Ioannou, Y. A. Cyclodextrin induces calcium- dependent lysosomal exocytosis. PLoS One. 5, e15054(2010).
  26. Soga, M., et al. HPGCD outperforms HPBCD as a potential treatment for Niemann-Pick disease type C during disease modeling with iPS cells. Stem Cells. 33, 1075-1088 (2015).
  27. Maetzel, D., et al. Genetic and chemical correction of cholesterol accumulation and impaired autophagy in hepatic and neural cells derived from Niemann-Pick Type C patient-specific iPS cells. Stem Cell Reports. 2, 866-880 (2014).
  28. Sarkar, S., et al. Impaired autophagy in the lipid-storage disorder Niemann-Pick type C1 dis- ease. Cell Reports. 5, 1302-1315 (2013).
  29. Rosenbaum, A. I., Zhang, G., Warren, J. D., Maxfield, F. R. Endocytosis of beta-cyclodextrins is responsible for cholesterol reduction in Niemann-Pick type C mutant cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107, 5477-5482 (2010).
  30. Yu, D., et al. Niemann-Pick Disease Type C: Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Neuronal Cells for Modeling Neural Disease and Evaluating Drug Efficacy. Journal of Biomolecular Screening. 19, 1164-1173 (2014).
  31. Zidovetzki, R., Levitan, I. Use of cyclodextrins to manipulate plasma membrane cholesterol content: evidence, misconceptions and control strategies. Biochimica et Biophysica Acta. 1768, 1311-1324 (2007).
  32. Bukiya, A. N., Durdagi, S., Noskov, S., Rosenhouse-Dantsker, A. Cholesterol up-regulates neuronal G protein-gated inwardly rectifying potassium (GIRK) channel activity in the hippocampus. The Journal of Biological Chemistry. 292, 6135-6147 (2017).
  33. Bukiya, A. N., Vaithianathan, T., Kuntamallappanavar, G., Asuncion-Chin, M., Dopico, A. M. Smooth muscle cholesterol enables BK β1 subunit-mediated channel inhibition and subsequent vasoconstriction evoked by alcohol. Arteriosclerosis, Thrombosis and Vascular Biology. 31, 2410-2423 (2011).
  34. Hegele, R. A. Plasma lipoproteins: genetic influences and clinical implications. Nature Reviews Genetics. 10, 109-121 (2009).
  35. Bisen, S., et al. Distinct mechanisms underlying cholesterol protection against alcohol-induced BK channel inhibition and resulting vasoconstriction. Biochimica et Biophysica Acta. 1861, 1756-1766 (2016).
  36. Santiago, J., et al. Probing the Effects of Membrane Cholesterol in the Torpedo californica Acetylcholine Receptor and the Novel Lipid-exposed Mutation αC418W in Xenopus Oocytes. The Journal of Biological Chemistry. 276, 46523-46532 (2001).
  37. Deng, W., et al. Hypercholesterolemia induces up-regulation of KACh cardiac currents via a mechanism independent of phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate and Gβγ. The Journal of Biological Chemistry. 287, 4925-4935 (2012).
  38. Bukiya, A. N., Blank, P. S., Rosenhouse-Dantsker, A. Cholesterol intake and statin use regulate neuronal G protein-gated inwardly rectifying potassium channels by cholesterol and PI(4,5)P2. Journal of Lipid Research. 60, 19-29 (2019).
  39. Bukiya, A. N., et al. Cholesterol increases the open probability of cardiac KACh currents. Biochimica et Biophysica Acta Biomembranes. 1848, 2406-2413 (2015).
  40. Bukiya, A. N., Rosenhouse-Dantsker, A. Hypercholesterolemia effect on potassium channels. Hypercholesterolemia. Kumar, S. A. , Intech. 95-119 (2015).
  41. Rosenhouse-Dantsker, A., et al. Distant cytosolic residues mediate a two-way molecular switch that controls the modulation of Kir channels by cholesterol and PI(4,5)P2. The Journal of Biological Chemistry. 287, 40266-40278 (2012).
  42. Chun, Y. S., Oh, H. G., Park, M. K., Cho, H., Chung, S. Cholesterol regulates HERG K+ channel activation by increasing phospholipase C β1 expression. Channels. 7, 275-287 (2013).
  43. Luchetti, G., et al. Cholesterol activates the G-protein coupled receptor Smoothened to promote Hedgehog signaling. eLife. 5, e20304(2016).
  44. Sun, S., et al. Cholesterol-dependent modulation of stem cell biomechanics: application to adipogenesis. Journal of Biomechanical Engineering. , In Press (2019).
  45. North, K., Bisen, S., Dopico, A. M., Bukiya, A. N. Tyrosine 450 in the Voltage- and Calcium-Gated Potassium Channel of Large Conductance Channel Pore-Forming (slo1) Subunit Mediates Cholesterol Protection against Alcohol-Induced Constriction of Cerebral Arteries. The Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 367, 234-244 (2018).
  46. Bukiya, A. N., Dopico, A. M. Regulation of BK Channel Activity by Cholesterol and Its Derivatives. Advances in Experimental Medicine and Biology. 1115, 53-75 (2019).
  47. Rosenhouse-Dantsker, A., Leal-Pinto, E., Logothetis, D. E., Levitan, I. Comparative analysis of cholesterol sensitivity of Kir channels: role of the CD loop. Channels. 4, 63-66 (2010).
  48. Rosenhouse-Dantsker, A., Logothetis, D. E., Levitan, I. Cholesterol Sensitivity of Kir2.1 is controlled by a belt of residues around the cytosolic pore. Biophysical Journal. 100, 381-389 (2011).
  49. Rosenhouse-Dantsker, A., Noskov, S. Y., Logothetis, D. E., Levitan, I. Cholesterol sensitivity of Kir2.1 depends on functional inter-links between the N and C termini. Channels. 7, 303-312 (2013).
  50. Rosenhouse-Dantsker, A., Noskov, S., Durdagi, S., Logothetis, D. E., Levitan, I. Identification of novel cholesterol-binding regions in Kir2 channels. The Journal of Biological Chemistry. 288, 31154-31164 (2013).
  51. Bukiya, A. N., Rosenhouse-Dantsker, A. Synergistic activation of G protein-gated inwardly rectifying potassium channels by cholesterol and PI(4,5)P2. Biochimica et Biophysica Acta Biomembranes. 1859, 1233-1241 (2017).
  52. Yi, A., Lin, Y. F., Jan, Y. N., Jan, L. Y. Yeast screen for constitutively active mutant G protein-activated potassium channels. Neuron. 29, 657-667 (2001).
  53. Bukiya, A., Dopico, A. M., Leffler, C. W., Fedinec, A. Dietary cholesterol protects against alcohol-induced cerebral artery constriction. Alcoholism, Clinical and Experimental Research. 38, 1216-1226 (2014).
  54. Simakova, M. N., Bisen, S., Dopico, A. M., Bukiya, A. N. Statin therapy exacerbates alcohol-induced constriction of cerebral arteries via modulation of ethanol-induced BK channel inhibition in vascular smooth muscle. Biochemical Pharmacology. 145, 81-93 (2017).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

157 LDL Xenopus

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved