JoVE Logo
发表
联系我们

登录

需要订阅 JoVE 才能查看此. 登录或开始免费试用。

本文内容

  • 摘要
  • 摘要
  • 引言
  • 研究方案
  • 结果
  • 讨论
  • 披露声明
  • 致谢
  • 材料
  • 参考文献
  • 转载和许可

摘要

提出了两种胆固醇富集方法:应用富含胆固醇的环糊精来丰富哺乳动物组织和细胞，以及利用富含胆固醇的磷脂型分散物（脂质体）来丰富Xenopus卵母细胞。这些方法有助于确定胆固醇水平升高对分子、细胞和器官功能的影响。

摘要

哺乳动物组织和细胞的胆固醇丰富，包括用于研究细胞功能的Xenopus卵母细胞，可以使用多种方法完成。在这里，我们描述了用于此目的的两种重要方法。首先，我们描述了如何使用充满胆固醇的环糊精来丰富组织和细胞，以脑动脉（组织）和海马神经元（细胞）为例。此方法可用于任何类型的组织、细胞或细胞系。胆固醇富集的替代方法包括使用低密度脂蛋白（LDL）。这种方法的优点是，它使用部分天然胆固醇平衡机制的细胞。然而，虽然环糊精方法可以应用于丰富任何细胞类型与胆固醇的兴趣，LDL方法仅限于表达LDL受体的细胞（例如，肝细胞，骨髓衍生细胞，如血白细胞和组织巨噬细胞），和浓缩水平取决于LDL受体的浓度和流动性。此外，低密度脂蛋白颗粒包括其他脂质，因此胆固醇的输送是非特异性的。其次，我们描述了如何使用含有胆固醇的磷脂色（即脂质体）来丰富异种卵母细胞的胆固醇。异种卵母细胞是一种流行的异质表达系统，用于研究细胞和蛋白质功能。对于哺乳动物组织（脑动脉）的环糊精胆固醇增生方法，以及Xenopus卵母细胞的磷脂胆固醇浓缩方法，我们证明胆固醇水平在孵育5分钟后达到最大值。在长期潜伏期（例如60分钟），这种胆固醇水平保持不变。这些数据共同为优化组织、细胞和Xenopus卵母细胞的胆固醇富集时间条件提供了基础，用于旨在研究胆固醇富集的影响的功能研究。

引言

胆固醇是一种主要的细胞脂质，它起着许多关键的功能和结构作用121，2，3，4，5，6，7，8，9。7,8,95,6,,3,4,,从调节血浆膜的物理特性到确保细胞的生存能力、生长、增殖，以及作为信号和前体分子在大量生化途径中，胆固醇是正常细胞和器官功能所必需的必要组成部分。因此，胆固醇缺乏会导致严重的身体畸形和各种疾病。另一方面，即使胆固醇在生理水平（2-3x）以上略有增加，也含有细胞毒性11、2、10，2,10与疾病的发展有关，包括心血管11、12、1312,13和神经退行性疾病1114、15、16、17。14,15,16,17因此，为了询问胆固醇的关键功能并确定胆固醇水平变化的影响，已经开发出了改变组织、细胞和异种卵母细胞中胆固醇含量的不同方法。

哺乳动物组织和细胞中胆固醇水平的变化
有几种方法可以被用来降低组织和细胞18的胆固醇水平。一种方法是接触溶解在脂蛋白缺乏血清中的他汀类药物，以抑制HMG-CoA还原酶，控制胆固醇合成率19，20。19,然而，这些降胆固醇药物也抑制沿美价酮途径形成非固醇产物。因此，加入少量的美价，使这些产品的形成21，并增强这种方法的特异性。降低胆固醇水平的另一种方法是使用β-环糊精。这些糖原蛋白单体单体具有一个内部疏水性腔，其直径与固醇22的大小相匹配，便于从细胞中提取胆固醇，从而消耗其原生胆固醇含量23。例如，2-羟丙基-β-环糊精（HP_CD），这是一种临床前药物，目前正在测试治疗尼曼-皮克C型疾病，一种遗传性致命的代谢紊乱，其特征是淋索质胆固醇储存24。胆固醇消耗水平取决于所使用的特定衍生物。例如，HP_CD 提取的胆固醇的容量低于甲基化衍生物，甲基β-环糊精（M+CD）24，25，26，27，28，29，30。29,3024,25,26,27,28,值得注意的是，然而，β-环糊精还可以提取其他疏水分子，除了胆固醇，这可能会导致非特异性的影响31。与耗竭相比，细胞和组织可以通过与胆固醇23的中饱和的β-环糊精进行治疗，专门与胆固醇一起丰富。这种方法也可用作胆固醇消耗31中使用的β-环糊精特异性的对照。组织和细胞中胆固醇的消耗非常简单，可以通过将细胞暴露30-60分钟到溶解在用于储存细胞的介质中的5 mM M_CD来实现。这种方法可导致胆固醇含量降低50%（例如，在海马神经元32，大鼠脑动脉33）。另一方面，准备β-环糊精-胆固醇复合物用于组织和细胞的胆固醇富集更为复杂，将在协议部分进行说明。

使用饱和胆固醇的β-环糊精来丰富组织和细胞的替代方法涉及使用LDL，它依赖于组织/细胞18中表达的LDL受体。虽然这种方法提供了使用细胞的天然胆固醇平衡机制的优点，但它有几个局限性。首先，不能用这种方法来丰富不表达LDL受体的组织和细胞。其次，低密度脂蛋白颗粒除了胆固醇外，还含有其他脂质。具体来说，LDL由蛋白质ApoB100（25%）组成和以下脂质（75%）:~6-8%胆固醇，+45-50%胆汁酯，+18-24%磷脂，和+4-8%三甘油34。因此，通过低密度脂蛋白颗粒输送胆固醇是非特异性的。第三，表达低密度脂蛋白受体的组织和细胞中低密度脂蛋白增加的百分比可能明显低于使用饱和胆固醇的环糊精观察到的含量。例如，在以前的研究中，通过低密度脂蛋白使啮齿动物脑动脉与胆固醇的丰富率仅使胆固醇水平增加10-15%35。相反，如协议部分所述，这些动脉与胆固醇饱和的动脉的浓缩导致胆固醇含量增加>50%（参见代表结果部分，图1）。

异种卵母细胞中胆固醇水平的变化
异种卵母细胞是一种异质表达系统，通常用于研究细胞和蛋白质功能。早期的研究表明，Xenopus卵母细胞的胆固醇与磷脂摩尔比为0.5± 0.136。由于这种内在的高胆固醇水平，增加胆固醇含量在这个系统中是具有挑战性的，但可以通过膜磷脂和胆固醇制成的分散实现。为此，我们选择的磷脂与用于形成人造平面脂质双层的磷脂相似，包括L-β-磷脂乙醇胺（POPE）和1-棕榈-2-奥莱基-sn-糖二烯-3-磷脂-l-塞林（POPS），如协议部分所述。这种方法可能导致胆固醇含量增加 >50%（参见代表结果部分，图 2）。

用基于磷脂的分散物丰富Xenopus卵母细胞的替代方法是使用胆固醇饱和的环糊精，这与组织和细胞的丰富方式类似。然而，我们发现这种方法的可重复性和效率较低，胆固醇含量平均增加约25%。这可能是由于这两种方法的加载能力不同（请参阅代表结果部分，图 3）。相反，已经表明，使用环糊精来消耗Xenopus卵母细胞的胆固醇，可以导致胆固醇含量降低40%36。

在这里，我们专注于哺乳动物组织和细胞的胆固醇丰富，通过应用环糊精饱和胆固醇，和异种卵母细胞使用脂质体。这两种方法都可以加以利用，以划定胆固醇水平增加对蛋白质功能的影响。蛋白质功能胆固醇调制的机制可能涉及直接相互作用8和/或间接效应9。当胆固醇通过直接相互作用影响蛋白质功能时，胆固醇水平增加对蛋白质活动的影响可能与细胞类型、表达系统或浓缩方法无关。例如，我们利用这两种方法来确定胆固醇对G蛋白的影响，内向纠正钾（GIRK）通道，以心房肌细胞37、海马神经元32、38、HEK29339细胞和异种卵母细胞32,3832、37,37表示。这些研究的结果是一致的:在所有三种类型的哺乳动物细胞和两栖卵母细胞胆固醇上升调节GIRK通道功能（参见代表结果部分，图4，海马神经元和相应的实验在Xenopus卵母细胞）。此外，这些研究中的观察结果也符合在心房肌细胞37，4040和海马神经元32，38,38新鲜从动物接受高胆固醇饮食40的研究的结果一致。37值得注意的是，使用M+CD的海马神经元的胆固醇富集逆转了用于治疗高胆固醇饮食对胆固醇水平和GIRK功能38影响的阿托伐他汀疗法的效果。在其他研究中，我们研究了突变对胆固醇敏感性的影响，使用Xenopus卵母细胞和HEK293细胞41来纠正体内的钾通道Kir2.1。同样，突变对通道灵敏度的影响在两个系统中是相似的。

两种浓缩方法在确定胆固醇水平升高对分子、细胞和器官功能的影响方面应用不计其数。特别是，使用环糊精-胆固醇复合物来丰富细胞和组织是非常普遍的，主要是因为它的特异性。最近的例子包括确定胆固醇对HERG通道激活和底层机制的影响42，发现胆固醇激活G蛋白耦合受体平滑促进刺猪信号43，以及通过膜相关链接蛋白44确定胆固醇在干细胞生物力学中的作用和辅助生成。在我们自己的工作中，我们利用哺乳动物组织富集与M_CD:胆固醇复合物，研究胆固醇富集对基本功能的影响，以及大电导（BK，MaxiK）在血管平滑肌35、45、46中钙和电压门通道（BK，MaxiK）的药理学特征。35,45,46在其他研究中，我们使用基于磷脂的分散方法来丰富具有胆固醇的Xenopus卵母细胞，以确定不同区域在Kir2.1和GIRK通道中胆固醇敏感性41、47、48、4947,48,49中的作用，并确定这些通道4132、50、51中的假定胆固醇结合位,点。32,50

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

研究方案

田纳西大学健康科学中心（UTHSC）进行了所有动物实验程序。动物护理和实验议定书由UTHSC动物护理和使用委员会审查和批准，该委员会是一个由国际实验室动物护理评估和鉴定协会认可的机构。

1. 使用甲基β-环糊精与胆固醇饱和的组织和细胞浓缩

注:下面的胆固醇浓缩协议适用于组织、细胞和细胞系。例如，我们描述了为丰富哺乳动物脑动脉而执行的步骤。提供了脑动脉（图1）和神经元的代表性结果（图4）。

  1. 制备富含胆固醇的M+CD
    1. 称量 0.064 g M_CD，并将其溶解在含有 10 mL 磷酸盐缓冲盐水 （PBS） 溶液的烧瓶中，以获得 5 mM M_CD 的最终浓度。用搅拌棒搅拌溶液，确保 M_CD 完全溶解。
    2. 重量 0.0024 克胆固醇粉，并添加到同一瓶中，以获得 0.63 mM 胆固醇浓度。然后大力搅拌溶液。使用铲子分解尽可能多的胆固醇块（有些块将保持到孵化）。
    3. 用至少两层石蜡膜盖住烧瓶，在37°C的水浴中缓慢摇动（约30振荡/分钟）。此步骤至关重要。
    4. 8-16 小时后，将溶液冷却至室温 （RT），然后通过 0.22 μm polyethersulfone 注射器过滤器过滤到玻璃瓶中。
      注:要达到溶液中不同的胆固醇浓度，请用简单的比例调整胆固醇和M+CD的含量。将M+CD:胆固醇摩尔比保持在8:1，以获得具有胆固醇的甲基-β-环糊精载体的饱和度是很重要的。如果储存在4°C，胆固醇丰富的溶液可以立即使用或几天内使用。然而，随着胆固醇总成的出现，胆固醇的丰富能力会随着时间而下降，溶液变得浑浊。
  2. 用M+CD饱和胆固醇治疗脑动脉
    1. 安乐死斯普拉格道利大鼠（250-300克），将其放入一个室与2%的西葫芦。然后，用锋利的断头盘或一把大剪刀将麻醉大鼠斩首。
      注:如果定期执行这些过程，则制定断头磨削时间表非常有用。此外，应该专门用一把单独的剪刀来斩首啮齿动物。灭鼠斩首是一种最终过程;因此，仪器不必无菌。每次使用后用肥皂水清洗就足够了。
    2. 将老鼠的头朝前放置，远离研究人员。将一把中等大小的剪刀的尖部分放在头骨和脑干之间，并在两侧横向切割。
    3. 使用钳子撬开头颅骨，拉起颅骨底部进行横向切割，并小心地取出大脑。确保切断支撑大脑在颅骨内的光学神经。
    4. 取出后，将大脑放入带有PBS的烧杯中。
      注:大脑可以在4°C下储存在冰上4-6小时。
    5. 在非无菌环境中，大鼠大脑转移到一个蜡解剖碗，有足够的PBS来淹没它。固定大脑，防止大脑移动。
      注:如果执行迅速，可以在 RT 处执行步骤 1.2.5。否则，它需要在冰上完成。
    6. 使用锋利的钳子和小手术剪刀来解剖脑动脉及其分支，在RT的PBS显微镜下形成大脑底部的Willis圆。此步骤至关重要。
    7. 在 96 井板或 35 mm 盘中将 PBS 中的动脉段（长达 1 厘米长）短暂冲洗，以去除剩余血液，然后将它们放入足够的胆固醇丰富溶液（在步骤 1.1 中准备），以覆盖整个动脉段。如果有足够的胆固醇丰富溶液和96井盘，如果动脉小，或者缺乏胆固醇丰富的溶液，请使用35毫米的菜。
      注:同样的方法可用于利用60分钟的孵育时间丰富其他组织和细胞的胆固醇。例如，这种方法以前用于小鼠脑动脉35、45、海马神经元32、心房肌细胞37和HEK293细胞39的胆固醇富集。,45需要根据胆固醇敏感测定在不同时间点验证胆固醇浓缩，确定每个组织或细胞类型的最小孵育时间（例如，通过沾染胆固醇敏感荧光染料菲律宾蛋白，对组织中胆固醇量进行生化测定）。
  3. 用类固醇敏感的荧光染料菲利宾染色动脉组织，以确定胆固醇水平的任何变化。
    注:在代表结果部分，我们演示了两种评估胆固醇水平变化的方法的结果:通过应用商用的基于胆固醇的胆固醇氧化酶试剂盒（参见材料表）进行的生化测定，以及使用类固醇敏感的荧光染料菲利芬染色。第一种方法可以按照制造商的说明执行。后一种方法的协议如下。
    1. 使用一瓶新鲜的菲律宾粉，制备10毫克/mL的二甲基硫氧化物（DMSO）库存溶液。此步骤至关重要。
      注: 生成的解决方案对光敏感。如果准备正确，菲律宾股票溶液为黄色。一些菲律宾粉可能粘在瓶盖上。因此，用 DMSO 溶剂冲洗瓶子和盖以保留全部数量的菲律宾元非常重要。一旦准备，菲律宾股票必须在几天内使用。菲律宾素在5天后完全失去荧光能力，即使储存在黑暗中，在-20°C。
    2. 从富含胆固醇的溶液中取出动脉段，用PBS清洗3倍5分钟。
    3. 将动脉段固定在4%的甲醛中，在冰上工作15分钟。
      注意:甲醛是轻敏的。因此，工作必须在黑暗中进行。
    4. 将动脉段放入RT的PBS中0.5%的Triton，10分钟，以渗透组织，促进染料渗透。
    5. 在摇床上用 PBS 清洗 3 倍的动脉段 5 分钟。此步骤至关重要。
      注:当 Triton 完全冲掉后，PBS 溶液表面不应有任何气泡。
    6. 稀释PBS中的菲律宾股票溶液，最终浓度为25微克/mL。将从PBS溶液中取出动脉，将其置于稀释的菲律宾溶液中，在黑暗中放置1小时。此步骤至关重要。
    7. 通过在摇床上用PBS冲洗3倍的动脉段，洗掉菲律宾。此步骤至关重要。
    8. 用蒸馏水短暂地冲洗动脉段，用餐巾纸吸收过多的液体，并使用市售的安装介质将动脉安装到滑道上（参见材料表）。
    9. 用盖玻片盖住动脉，避免动脉滚动或扭曲，并将滑道设置为在 RT 的黑暗区域干燥 24 小时。
    10. 安装介质干燥后，用透明指甲油密封盖玻片边缘，让指甲油干燥 10-15 分钟。将滑板存放在 -20°C 的黑暗中。
    11. 在成像之前，将幻灯片与 RT 进行平衡。
    12. 使用荧光显微镜或荧光读取器对组织进行成像，其激发设置为 340-380 nm，发射速度为 385-470 nm。
      注意:菲律宾光漂白剂快;因此，必须及时对样品进行成像。

2. 使用富含胆固醇的磷脂基色散物（脂质体）丰富异种卵母细胞

  1. 准备解决方案
    1. 要制备胆固醇的库存溶液，请将10毫克胆固醇粉溶解在10mL玻璃烧杯或瓶子中的1mL氯仿中。将溶液转移到 1.5 mL 盖式玻璃瓶中。
      注意:鉴于氯仿的毒性和快速蒸发，在发动机罩中工作，并将试剂放在冰上。
    2. 准备一个150 mM KCl，10 mM三酯-HEPES，pH = 7.4缓冲液，用于富含胆固醇的磷脂。为此，在双蒸馏水中溶解在 Erlenmeyer 烧瓶 5.5905 g KCl 和 0.6057 g Tris 中，总体积为 0.5 L。在另一瓶中，将5.5905克KCl和1.19155克HEPES溶解在双蒸馏水中，总体积为0.5升。将两个溶液混合在 1 L Erlenmeyer 烧瓶中，用 HCl 将 pH 调整到 7.4。
      注:将所得的 150 mM KCl、10 mM Tris-HEPES 溶液储存在 4 °C 下。
    3. 要准备ND96预中卵母细胞培养（低K+，低Ca2+）缓冲，将1 mL的2M KCl，1 mL的1MMgCl2，45.5 mL的2M NaCl，和5 mL的1/1 M NaOH-HEPES在1LErlenmeyer烧瓶。2加入900 mL双蒸馏水，用HCl将pH值调整到7.4。将溶液转移到1升气缸，用双蒸馏水将体积提高到1升。然后添加 1.8 mL 的 1 M CaCl2并过滤溶液。
      注:用于制造 ND96 溶液的组件之间的比例略有变化似乎对胆固醇富集并不重要，可能是因为 ND96 溶液在浓缩步骤本身期间没有使用，而是用于存储。例如，1 L 溶液的钠和氯化离子浓度略低，通过结合 2 mL 的 1 M KCl、1 m MgCl2的 1 mL、1 M NaCl 的 82.5 mL、1 M HEPES 的 5 mL 和 1.8 mL 的 1 M CaCl2（Ca 2+省略以获得 Ca2+免费溶液）制成。使用 NaOH 将溶液的 pH 调整为 7.4。将产生的 ND96 卵母细胞培养溶液储存在 4 °C 下长达 1 个月。
  2. 用胆固醇脂质体进行磷脂型分散的制备
    1. 在12 mL玻璃管中，将以下10mg/mL氯仿溶解脂质溶液的200μL组合:L-β-磷脂乙醇胺，1-棕榈-2-奥莱基-斯-糖-3-磷脂-l-血清素，和胆固醇。
    2. 蒸发发动机罩中的氯仿，在氮气流下缓慢干燥。此步骤至关重要。
    3. 在pH = 7.4下，将800 μL的缓冲溶液中的脂质悬浮，该溶液由150 mM KCl和10 mM Tris-HEPES组成，用石蜡膜覆盖。
    4. 在 80 kHz 下轻轻声波 10 分钟，直到形成乳状混合物。此步骤至关重要。
      注意:当声波时，玻璃管中的分散应轻轻振动，形成小波。分散液滴不应在管内跳跃。
  3. 用胆固醇丰富异种卵母细胞
    注:青蛙卵母细胞携带卵巢可以从两个来源获得:第一，Xenopus laevis 雌蛙可以用于内部手术。这一程序必须得到机构动物护理和使用委员会的批准。第二，可以从商业供应商处购买整个卵巢。作为购买或隔离整个卵巢，然后消化它们（如步骤 2.3.1-2.3.4）所述的替代方案，单个卵母细胞可在商业上购买。如果使用后者，则可以跳过步骤 2.3.1-2.3.4。
    1. 将新鲜获得的卵巢保持在+14°C的ND96溶液中。在这些情况下，卵巢可储存长达 1 周。
    2. 要获得单个卵母细胞，使用锋利的钳子在多个地方破坏卵巢囊。将卵巢块放入 60 mm 板中，5 mL 的 Ca2+-无 ND96 辅以 0.5 mg/mL 胶原酶。在 RT 时以 60 振荡/分钟的速度在轨道摇床上摇动 15 分钟。
      注:此步骤将确保卵巢囊的消化。为了保持酶活性，避免长时间（>1 h）储存含有ND96的胶原蛋白酶。即使在 15 °C 以下的低温下，也应进行短暂的存储。
    3. 使用具有宽尖的转移移液器，大力移液含卵细胞溶液上下约5-10倍，以分离单个卵母细胞。在此步骤中，解决方案将变暗。
    4. 使用 Ca2+-无 ND96 快速冲洗卵母细胞，直到溶液变透明。
    5. 使用带窄尖的转移移液器将单个卵母细胞转移到Ca2+-含ND-96溶液，辅以2mg/mL的根粒。
      注:当需要存储卵母细胞时，此步骤至关重要。单个卵母细胞可在14-17°C下储存在培养箱中数天。然而，必须每天至少清除一次死亡的卵母细胞，以避免有毒化学物质对溶液的污染。
    6. 将胆固醇丰富的磷脂色散物的90μL转移到96孔板的一口井中。
    7. 将多达六只卵母细胞从ND96介质转移到尽可能少的介质的井中。此步骤至关重要。
      注意:在转移过程中不要将卵母细胞暴露在空气中，以保持卵母细胞完好无损。
    8. 将 96 井板放在三维平台旋转器上，为细胞中的卵母细胞提供 5-10 分钟的小轨道运动。
    9. 加入一滴ND96到井中，将富含胆固醇的卵母细胞从96井板转移到带ND96的35毫米板中，立即使用。此步骤至关重要。
    10. 使用市售的基于胆固醇的胆固醇氧化酶试剂盒（参见材料表），按照制造商的说明评估胆固醇水平的变化。

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

结果

使用饱和胆固醇的环糊精作为丰富组织和细胞胆固醇的手段是公认的。在这里，我们首先演示了这种广泛使用的方法的应用，用M+CD饱和胆固醇来丰富大鼠脑动脉的胆固醇。图1A显示了一个图像脑动脉平滑肌肉层的例子，并演示了在组织富集后获得的与菲律宾相关的荧光的浓度依赖性增加，胆固醇浓度从6.25 μM-6.25 mM开始1小时。

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

讨论

用胆固醇丰富哺乳动物组织和细胞以及Xenopus卵母细胞的方法是研究胆固醇水平升高对单个分子物种、复杂大分子系统（如蛋白质）以及细胞和器官功能的影响的有力工具。在本文中，我们描述了促进此类研究的两种补充方法。首先，我们描述了如何使用富含胆固醇的M+CD来丰富组织和细胞。我们证明，在脑动脉部分，这种方法导致胆固醇水平增加+50%。此外，在最近的一项研究中，我们显示?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

披露声明

A. M. Dopico 博士是一名特殊兼职的联邦雇员，现任国家酒精滥用和酗酒咨询委员会成员。

致谢

这项工作得到了美国心脏协会（至A.R.-D.）的科学家发展赠款（11SDG5190025）的支持，以及国家卫生研究所R01授予AA-023764（至A.N.B.）和HL-104631和R37 A-11560（至A.M.D.） 的支持。

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

材料

NameCompanyCatalog NumberComments
Amplex Red Cholesterol Assay KitInvitrogenA12216
Pierce BCA Protein Assay KitThermo Scientific23225
Pre-Diluted Protein Assay Standards BSA setThermo Scientific23208
Brain PE 25Mg in ChloroformAvanti Lipids840022C
16:0-18:1 PS 25Mg ChloroformAvanti Lipids840034C
Cholesterol 100Mg PowderSigmaC8667
KClFisherP217
Trizma baseSigmaT6066
HEPESCorning61-034-RO
MgCl2FisherM33
NaClFisherS271
KH2PO4FisherP285
MgSO4EMD ChemicalsMX0070-1
EDTAVWRE177
Dextrose AnhydrousFisherBP350
NaHCO3SigmaS6014
CaCl2SigmaC3881
Blood Gas TanknexAir
NaOHFisherS318
1.5mL tubesFisherS35818
Gastight Syringe 100uLHamilton1710
Microliter Syringe 25uLHamilton702
12 mL heavy duty conical centrifuge beaded rim tubePyrex8120-12
ChloroformFisherC298
Support StandHomescience ToolsCE-STAN5X8
Universal Clamp, 3-ProngHomescience ToolsCE-CLPUNIV
SonicatorLaboratory SuppliesG112SP1G
3D rotator mixerBenchmark ScientificB3D 1308
96 well plateSigmaBR781602
N2 gasnexAir
Glass beakers 40ml-1LFisher02-540
Ice MachineScotsmanCU1526MA-1
Ice bucketFisher50-136-7764
1X PBSCorning21-031-CM
TritonXFisherBP151-100
Sonic DismembratorFisherModel 100
Eppendorf microcentrifugeEppendorfModel 5417R
Amber bottlesFisher03-251-420
Corning™ Disposable Glass Pasteur PipetsFIsher13-678-4A
ParafilmFIsher50-998-944
Isotemp™ BOD Refrigerated IncubatorFIsher97-990E
OocytesXenoocyte™10005
RatEnvigoSprague Dawleyweight 250g
Methyl-β-cyclodextrinSigmaC4555
Water bath incubator with shakerPrecision51221080Lowest shaker setting O/N 37 °C
FilipinSigmaSAE0088-1ML
DMSOFisherBP231
Paraformaldehyde 4%Mallinckrodt2621
DI H2OUniversity DI source
ProLong Gold antifade reagnetInvitrogenP10144
Microslides 75x25mm FrostedDiaggerG15978A
ForcepsFine Science Tools11255-20
Microscope CoverslipDiaggerG15972B
Clear nail polishRevlon771 Clear
Labeling TapeFisher15-901-20F
Securline Lab Marker IISigmaZ648205-5EA
BD 10mL SyringeFisher14-823-16E
1.2 μm syringe filterVWR28150-958
KimWipesFisher06-666A
pH probeSartoruspy-p112s
pH meterDenver instrumentModel 225
70% ETOHPharmco211USP/NF
TimerFisher02-261-840
Steno bookStaples163485

参考文献

  1. Yeagle, P. L. Cholesterol and the cell membrane. Biochimica et Biophysica Acta. 822, 267-287 (1985).
  2. Yeagle, P. L. Modulation of membrane function by cholesterol. Biochimie. 73, 1303-1310 (1991).
  3. Gimpl, G., Burger, K., Fahrenholz, F. Cholesterol as modulator of receptor function. Biochemistry. 36, 10959-10974 (1997).
  4. Maxfield, F. R., van Meer, G. Cholesterol, the central lipid of mammalian cells. Current Opinion in Cell Biology. 22, 422-429 (2010).
  5. Goluszko, P., Nowicki, B. Membrane cholesterol: a crucial molecule affecting interactions of microbial pathogens with mammalian cells. Infection and Immunity. 73, 7791-7796 (2005).
  6. Ramprasad, O. G., et al. Changes in cholesterol levels in the plasma membrane modulate cell signaling and regulate cell adhesion and migration on fibronectin. Cell Motility and Cytoskeleton. 64, 199-216 (2007).
  7. Rosenhouse-Dantsker, A., Mehta, D., Levitan, I. Regulation of Ion Channels by Membrane Lipids. Comprehensive Physiology. 2, 31-68 (2012).
  8. Direct mechanisms in cholesterol modulation of protein function. Advances in Experimental Medicine and Biology. Rosenhouse-Dantsker, A., Bukiya, A. N. , Springer Nature. Switzerland. 1135(2019).
  9. Cholesterol modulation of protein function: sterol specificity and indirect mechanisms. Advances in Experimental Medicine and Biology. Rosenhouse-Dantsker, A., Bukiya, A. N. , Springer Nature. Switzerland. 1115(2019).
  10. Kellner-Weibel, G., Geng, Y. J., Rothblat, G. H. Cytotoxic cholesterol is generated by the hydrolysis of cytoplasmic cholesteryl ester and transported to the plasma membrane. Atherosclerosis. 146, 309-319 (1999).
  11. Kruth, H. S. Lipoprotein cholesterol and atherosclerosis. Current Molecular Medicine. 1, 633-653 (2001).
  12. Ross, R. Atherosclerosis--an inflammatory disease. The New England Journal of Medicine. 340, 115-126 (1999).
  13. Steinberg, D. Atherogenesis in perspective: hypercholesterolemia and inflammation as partners in crime. Nature Medicine. 8, 1211-1217 (2002).
  14. Ho, Y. S., Poon, D. C. H., Chan, T. F., Chang, R. C. C. From small to big molecules: How do we prevent and delay the progression of age- related neurodegeneration? Current Pharmaceutical Design. 18, 15-26 (2012).
  15. Stefani, M., Liguri, G. Cholesterol in Alzheimer's disease: Unresolved questions. Current Alzheimer Research. 6, 15-29 (2009).
  16. Ong, W. Y., Halliwell, B. Iron, atherosclerosis, and neurodegeneration: A key role for cholesterol in promoting iron-dependent oxidative damage? Annals of the New York Academy of Sciences. 1012, 51-64 (2004).
  17. Igoumenou, A., Ebmeier, K. P. Diagnosing and managing vascular dementia. Practitioner. 256, 13-16 (2012).
  18. Luu, W., Gelissen, I. C., Brown, A. J. Manipulating Cholesterol Status Within Cells. Methods in Molecular Biology. 1583, 41-52 (2017).
  19. Egom, E. E. A., Hafeez, H. Biochemistry of statins. Advances in Clinical Chemistry. 73, 127-168 (2016).
  20. Igel, M., Sudhop, T., von Bergmann, K. Pharmacology of 3-hydroxy-3-methylglutaryl-coenzyme A reductase inhibitors (statins), including rosuvastatin and pitavastatin. Journal of Clinical Pharmacology. 42, 835-845 (2002).
  21. Nakanishi, M., Goldstein, J. L., Brown, M. S. Multivalent control of 3-hydroxy-3-methylglutaryl coenzyme A reductase. Mevalonate-derived product inhibits translation of mRNA and accelerates degradation of enzyme. The Journal of Biological Chemistry. 263, 8929-8937 (1988).
  22. López, C. A., de Vries, A. H., Marrink, S. J. Molecular Mechanism of Cyclodextrin Mediated Cholesterol Extraction. PLoS Computational Biology. 7, e1002020(2011).
  23. Christian, A. E., Haynes, M. P., Phillips, M. C., Rothblat, G. H. Use of cyclodextrins for manipulating cellular cholesterol content. Journal of Lipid Research. 38, 2264-2272 (1997).
  24. Dai, S., et al. Methyl-β-cyclodextrin restores impaired autophagy flux in Niemann-Pick C1-deficient cells through activation of AMPK. Autophagy. 13, 1435-1451 (2017).
  25. Chen, F. W., Li, C., Ioannou, Y. A. Cyclodextrin induces calcium- dependent lysosomal exocytosis. PLoS One. 5, e15054(2010).
  26. Soga, M., et al. HPGCD outperforms HPBCD as a potential treatment for Niemann-Pick disease type C during disease modeling with iPS cells. Stem Cells. 33, 1075-1088 (2015).
  27. Maetzel, D., et al. Genetic and chemical correction of cholesterol accumulation and impaired autophagy in hepatic and neural cells derived from Niemann-Pick Type C patient-specific iPS cells. Stem Cell Reports. 2, 866-880 (2014).
  28. Sarkar, S., et al. Impaired autophagy in the lipid-storage disorder Niemann-Pick type C1 dis- ease. Cell Reports. 5, 1302-1315 (2013).
  29. Rosenbaum, A. I., Zhang, G., Warren, J. D., Maxfield, F. R. Endocytosis of beta-cyclodextrins is responsible for cholesterol reduction in Niemann-Pick type C mutant cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107, 5477-5482 (2010).
  30. Yu, D., et al. Niemann-Pick Disease Type C: Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Neuronal Cells for Modeling Neural Disease and Evaluating Drug Efficacy. Journal of Biomolecular Screening. 19, 1164-1173 (2014).
  31. Zidovetzki, R., Levitan, I. Use of cyclodextrins to manipulate plasma membrane cholesterol content: evidence, misconceptions and control strategies. Biochimica et Biophysica Acta. 1768, 1311-1324 (2007).
  32. Bukiya, A. N., Durdagi, S., Noskov, S., Rosenhouse-Dantsker, A. Cholesterol up-regulates neuronal G protein-gated inwardly rectifying potassium (GIRK) channel activity in the hippocampus. The Journal of Biological Chemistry. 292, 6135-6147 (2017).
  33. Bukiya, A. N., Vaithianathan, T., Kuntamallappanavar, G., Asuncion-Chin, M., Dopico, A. M. Smooth muscle cholesterol enables BK β1 subunit-mediated channel inhibition and subsequent vasoconstriction evoked by alcohol. Arteriosclerosis, Thrombosis and Vascular Biology. 31, 2410-2423 (2011).
  34. Hegele, R. A. Plasma lipoproteins: genetic influences and clinical implications. Nature Reviews Genetics. 10, 109-121 (2009).
  35. Bisen, S., et al. Distinct mechanisms underlying cholesterol protection against alcohol-induced BK channel inhibition and resulting vasoconstriction. Biochimica et Biophysica Acta. 1861, 1756-1766 (2016).
  36. Santiago, J., et al. Probing the Effects of Membrane Cholesterol in the Torpedo californica Acetylcholine Receptor and the Novel Lipid-exposed Mutation αC418W in Xenopus Oocytes. The Journal of Biological Chemistry. 276, 46523-46532 (2001).
  37. Deng, W., et al. Hypercholesterolemia induces up-regulation of KACh cardiac currents via a mechanism independent of phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate and Gβγ. The Journal of Biological Chemistry. 287, 4925-4935 (2012).
  38. Bukiya, A. N., Blank, P. S., Rosenhouse-Dantsker, A. Cholesterol intake and statin use regulate neuronal G protein-gated inwardly rectifying potassium channels by cholesterol and PI(4,5)P2. Journal of Lipid Research. 60, 19-29 (2019).
  39. Bukiya, A. N., et al. Cholesterol increases the open probability of cardiac KACh currents. Biochimica et Biophysica Acta Biomembranes. 1848, 2406-2413 (2015).
  40. Bukiya, A. N., Rosenhouse-Dantsker, A. Hypercholesterolemia effect on potassium channels. Hypercholesterolemia. Kumar, S. A. , Intech. 95-119 (2015).
  41. Rosenhouse-Dantsker, A., et al. Distant cytosolic residues mediate a two-way molecular switch that controls the modulation of Kir channels by cholesterol and PI(4,5)P2. The Journal of Biological Chemistry. 287, 40266-40278 (2012).
  42. Chun, Y. S., Oh, H. G., Park, M. K., Cho, H., Chung, S. Cholesterol regulates HERG K+ channel activation by increasing phospholipase C β1 expression. Channels. 7, 275-287 (2013).
  43. Luchetti, G., et al. Cholesterol activates the G-protein coupled receptor Smoothened to promote Hedgehog signaling. eLife. 5, e20304(2016).
  44. Sun, S., et al. Cholesterol-dependent modulation of stem cell biomechanics: application to adipogenesis. Journal of Biomechanical Engineering. , In Press (2019).
  45. North, K., Bisen, S., Dopico, A. M., Bukiya, A. N. Tyrosine 450 in the Voltage- and Calcium-Gated Potassium Channel of Large Conductance Channel Pore-Forming (slo1) Subunit Mediates Cholesterol Protection against Alcohol-Induced Constriction of Cerebral Arteries. The Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 367, 234-244 (2018).
  46. Bukiya, A. N., Dopico, A. M. Regulation of BK Channel Activity by Cholesterol and Its Derivatives. Advances in Experimental Medicine and Biology. 1115, 53-75 (2019).
  47. Rosenhouse-Dantsker, A., Leal-Pinto, E., Logothetis, D. E., Levitan, I. Comparative analysis of cholesterol sensitivity of Kir channels: role of the CD loop. Channels. 4, 63-66 (2010).
  48. Rosenhouse-Dantsker, A., Logothetis, D. E., Levitan, I. Cholesterol Sensitivity of Kir2.1 is controlled by a belt of residues around the cytosolic pore. Biophysical Journal. 100, 381-389 (2011).
  49. Rosenhouse-Dantsker, A., Noskov, S. Y., Logothetis, D. E., Levitan, I. Cholesterol sensitivity of Kir2.1 depends on functional inter-links between the N and C termini. Channels. 7, 303-312 (2013).
  50. Rosenhouse-Dantsker, A., Noskov, S., Durdagi, S., Logothetis, D. E., Levitan, I. Identification of novel cholesterol-binding regions in Kir2 channels. The Journal of Biological Chemistry. 288, 31154-31164 (2013).
  51. Bukiya, A. N., Rosenhouse-Dantsker, A. Synergistic activation of G protein-gated inwardly rectifying potassium channels by cholesterol and PI(4,5)P2. Biochimica et Biophysica Acta Biomembranes. 1859, 1233-1241 (2017).
  52. Yi, A., Lin, Y. F., Jan, Y. N., Jan, L. Y. Yeast screen for constitutively active mutant G protein-activated potassium channels. Neuron. 29, 657-667 (2001).
  53. Bukiya, A., Dopico, A. M., Leffler, C. W., Fedinec, A. Dietary cholesterol protects against alcohol-induced cerebral artery constriction. Alcoholism, Clinical and Experimental Research. 38, 1216-1226 (2014).
  54. Simakova, M. N., Bisen, S., Dopico, A. M., Bukiya, A. N. Statin therapy exacerbates alcohol-induced constriction of cerebral arteries via modulation of ethanol-induced BK channel inhibition in vascular smooth muscle. Biochemical Pharmacology. 145, 81-93 (2017).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

转载和许可

请求许可使用此 JoVE 文章的文本或图形

请求许可

探索更多文章

157 LDL

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

政策

使用条款

隐私

联系我们

向图书馆推荐

JoVE 新闻简报

科研

教育

发表

图书馆员

关于 JoVE

版权所属 © 2025 MyJoVE 公司版权所有，本公司不涉及任何医疗业务和医疗服务。