JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Представлены два метода обогащения холестерина: применение циклодекстрин насыщенного холестерином для обогащения тканей и клеток млекопитающих, а также использование обогащенных холестерином фосфолипидных дисперсий (липосом) для обогащения клеточных яйцеклеток. Эти методы являются полезными для определения влияния повышенного уровня холестерина в молекулярной, клеточной и органной функции.

Аннотация

Холестерин обогащения тканей млекопитающих и клеток, в том числе Ксенопус ооцитов, используемых для изучения функции клеток, может быть достигнуто с помощью различных методов. Здесь мы описываем два важных подхода, используемых для этой цели. Во-первых, мы описываем, как обогащать ткани и клетки с помощью циклодекстрин насыщен холестерина с помощью мозговых артерий (тканей) и гиппокампа нейронов (клеток) в качестве примеров. Этот подход может быть использован для любого типа тканей, клеток или клеточных линий. Альтернативный подход к обогащению холестерина предполагает использование липопротеинов низкой плотности (ЛПНП). Преимущество этого подхода является то, что он использует часть естественного холестерина гомеостаза машины клетки. Однако, в то время как циклодекстрин подход может быть применен для обогащения любого типа клеток с холестерином, LDL подход ограничивается клетками, которые выражают ldL рецепторов (например, клетки печени, костного мозга полученных клеток, таких как лейкоциты крови и ткани макрофагов), и уровень обогащения зависит от концентрации и мобильности рецептора ЛПНП. Кроме того, частицы ЛПНП включают в себя другие липиды, поэтому доставка холестерина неспецифическая. Во-вторых, мы описываем, как обогатить ооциты ксенопуса холестерином с помощью дисперсии на основе фосфолипидов (т.е. липосом), которая включает холестерин. Ксенопусские яйцеклетки представляют собой популярную гетерологусную систему экспрессии, используемую для изучения функции клеток и белков. Как для циклодекстрин основе холестерина обогащения подход млекопитающих тканей (мозговых артерий) и фосфолипид основе холестерина обогащения подход ксенопуса ооцитов, мы пяндекс. Этот уровень холестерина остается неизменным в течение длительных периодов инкубации (например, 60 мин). В совокупности эти данные обеспечивают основу для оптимизированных временных условий для обогащения холестерина тканей, клеток и ооцитов ксенопусов для функциональных исследований, направленных на изучение влияния обогащения холестерина.

Введение

Холестерин, основной клеточный липид, играет многочисленные критические функциональные и структурные роли1,,2,,3,,4,,55,66,7,8,,9. От регулирования физических свойств плазменной мембраны до обеспечения жизнеспособности клеток, роста, пролиферации и использования молекулы сигнала и прекурсора в изобилии биохимических путей, холестерин является императивным компонентом, необходимым для нормальной функции клеток и органов. В результате дефицит холестерина приводит к тяжелым физическим порокам развития и различным расстройствам. С другой стороны, даже небольшое повышение уровня холестерина выше физиологических уровней (2-3x),является цитотоксическим1,,2,,10 и было связано с развитием нарушений, в том числе сердечно-сосудистых11,,12,,13 и нейродегенеративных заболеваний14,15,16,17. Таким образом, для изучения важнейших функций холестерина и определения влияния изменений уровня холестерина были разработаны различные подходы, которые изменяют содержание холестерина в тканях, клетках и ксенопух.

Изменение уровня холестерина в тканях и клетках млекопитающих
Несколько подходов могут быть использованы для снижения уровня холестерина в тканях и клетках18. Один подход включает в себя их воздействие статинов, растворенных в липопротеино-дефицитной сыворотке для ингибирования HMG-CoA редуктазы, которая контролирует скорость синтеза холестерина19,20. Тем не менее, эти препараты снижения уровня холестерина также препятствуют образованию нестероловых продуктов вдоль мевалонатного пути. Таким образом, небольшое количество мевалоната добавляется, чтобы позволить образование этих продуктов21 и повысить специфику этого подхода. Другой подход к снижению уровня холестерина включает в себя использование циклодекстрин. Эти гюфрироранозы мономеры обладают внутренней гидрофобной полости с диаметром, который соответствует размеру стеринов22, что облегчает извлечение холестерина из клеток, тем самым истощая их от родного содержания холестерина23. Примером является 2-гидроксипропил-я-циклодекстрин (HP-CD), доклинический препарат в настоящее время тестируется для лечения ниманн-Пик типа C болезни, генетически наследственных смертельных метаболических расстройств, характеризующихся лизосомального холестерина хранения24. Уровень истощения холестерина зависит от конкретной производной используется. Например, HP-CD извлекает холестерин с меньшей емкостью, чем метилированные производные, метил-и-циклодекстрин (МЗКД)24,25,26,27,28,29,30. Примечательно, однако, что циклодекстрины могут также извлекать другие гидрофобные молекулы в дополнение к холестерину, что может привести к неспецифическим эффектам31. В отличие от истощения, клетки и ткани могут быть специально обогащены холестерином путем лечения циклодекстрином, который был донасыщен холестерином23. Этот подход также может быть использован в качестве контроля для специфики q-циклодекстринов, используемых для истощения холестерина31. Истощение холестерина из тканей и клеток является простым и может быть достигнуто путем разоблачения клеток в течение 30-60 мин до 5 мМ ММ МЗКД растворяется в среде, используемой для хранения клеток. Такой подход может привести к 50% снижению содержания холестерина (например, в гиппокампе нейронов32, крысиных мозговых артерий33). С другой стороны, подготовка комплекса к циклодекстрин-холестерин для обогащения холестерина тканей и клеток является более сложной и будет описана в разделе протокола.

Альтернативный подход к обогащению тканей и клеток с использованием циклодекстрин насыщен холестерина включает в себя использование ЛПНП, который опирается на рецепторы ЛПНП, выраженные в тканях / клетках18. Хотя этот подход предлагает преимущество использования природного холестерина гомеостаза машины клетки, он имеет несколько ограничений. Во-первых, ткани и клетки, которые не выражают рецептор ЛПНП не могут быть обогащены с помощью этого подхода. Во-вторых, частицы ЛПНП содержат другие липиды в дополнение к холестерину. В частности, ЛПНП состоит из белка ApoB100 (25%) и следующие липиды (75%): 6-8% холестерина, 45-50% холестериновый эфир, 18-24% фосфолипидов и 4-8% триацилглицерола34. Таким образом, доставка холестерина через частицы ЛПНП является неспецифической. В-третьих, процент увеличения содержания холестерина ЛПНП в тканях и клетках, которые выражают рецептор ЛПНП может быть значительно ниже, чем увеличение наблюдается с помощью циклодекстрин насыщенхолестерина холестерина. Например, в предыдущем исследовании, обогащение грызунов мозговых артерий с холестерином через ЛПНП привело только 10-15% увеличение уровня холестерина35. В отличие от этого, обогащение этих артерий циклодекстрином, насыщенным холестерином, как описано в разделе протокола, привело к увеличению содержания холестерина на 50% (см. раздел «Результаты представительства», рисунок 1).

Изменение уровня холестерина в яйцеклетках Ксенопуса
Ксенопусские яйцеклетки представляют собой гетерологовую систему экспрессии, обычно используемую для изучения функции клеток и белков. Более ранние исследования показали, что соотношение холестерина к фосфолипидным молярным соотношению у ооцитов Ксенопуса составляет 0,5 и 0,136. Из-за этого внутренне высокий уровень холестерина, повышение содержания холестерина в этой системе является сложной задачей, но может быть достигнуто с помощью дисперсии из мембранных фосфолипидов и холестерина. Фосфолипиды, которые мы выбрали для этой цели, аналогичны тем, которые используются для формирования искусственных планарных липидных бислой и включают L-я-фосфатидидаланоламин (POPE) и 1-palmitoyl-2-олеоил-сн-глицеро-3-фосфо-л-серин (POPS), как описано в разделе протокола. Такой подход может привести к увеличению содержания холестерина на 50% (см. раздел "Результаты представлений", рисунок 2).

Альтернативный подход к обогащению ооцитов ксенопуса фосфолипидными дисперсиями предполагает использование циклодекстрин, насыщенный холестерином, который похож на то, как обогащаются ткани и клетки. Тем не менее, мы обнаружили, что этот подход имеет низкую воспроизводимость и эффективность, в среднем на 25% больше содержания холестерина. Это, возможно, связано с различной грузоподъемностью этих двух подходов (см. раздел "Результаты представитель", рисунок 3). В отличие от этого, было показано, что использование циклодекстрин для истощения холестерина из ооцитов Ксенопуса может привести к снижениюсодержанияхолестерина на 40%.

Здесь мы сосредоточиваемся на обогащении холестерина тканей и клеток млекопитающих путем применения циклодекстрин насыщенных холестерином, и ксенопусов ооцитов с использованием липосом. Оба подхода могут быть использованы для разграничения влияния повышенного уровня холестерина на функцию белка. Механизмы модуляции холестерина функции белка могут включать прямые взаимодействия8 и/или косвенные эффекты9. Когда холестерин влияет на функцию белка через прямые взаимодействия, влияние повышения уровня холестерина на активность белка, вероятно, не зависит от типа клеток, системы выражения или подхода обогащения. Например, мы использовали эти два подхода, чтобы определить влияние холестерина на G-белок закрытых внутренне выправляя калия (GIRK) каналов, выраженных в предсердий миоцитов37, гиппокампа нейронов32,38, HEK29339 клеток, и Ксенопус ооцитов32,37. Результаты, полученные в этих исследованиях, были последовательными: во всех трех типах клеток млекопитающих и в оицитах амфибий холестерина upregulated GIRK функции канала (см. Представитель Результаты раздела, Рисунок 4, для гиппокампа нейронов и соответствующие эксперименты в ооцитов Ксенопуса). Кроме того, наблюдения, сделанные в этих исследованиях, также согласуются с результатами исследований, проведенных в предсердий миоцитов37,40 и гиппокампа нейронов32,38 свежеизолированных от животных, подвергаемых высоким уровнем холестерина диеты40. Примечательно, что обогащение холестерина гиппокампа нейронов с помощью МЗКД обратить вспять эффект аторвастатина терапии, используемой для решения воздействия диеты с высоким уровнем холестерина как на уровень холестерина и GIRK функции38. В других исследованиях мы исследовали влияние мутаций на чувствительность холестерина внутренне выправляющего калийный канал Kir2.1 с использованием обоих клеток Xenopus и клеток HEK29341. Опять же, влияние мутаций на чувствительность канала было аналогичным в двух системах.

Применение обоих методов обогащения для определения влияния повышенного уровня холестерина на молекулярную, клеточную и органную функцию многочисленны. В частности, использование циклодекстрин-холестериновых комплексов для обогащения клеток и тканей очень распространено во многом благодаря своей специфичности. Недавние примеры такого подхода включают определение влияния холестерина на активацию канала HERG и основные механизмы42, открытие, что холестерин активирует G белка связаны рецептор Smoothened содействовать Ежик сигнализации43, и определение роли холестерина в биомеханики стволовых клеток и адипогенеза через мембраны связанных связующих белков44. В нашей собственной работе, мы использовали обогащение тканей млекопитающих с комплексом M'CD: холестерин для изучения влияния обогащения холестерина на основную функцию и фармакологический профиль кальция- и напряжения-gated каналов большой проводимости (BK, MaxiK) в сосудистой гладкой мышце35,45,46. В других исследованиях, мы использовали фосфолипид основе дисперсии подход для обогащения ксенопусов ооцитов с холестерином, чтобы определить роли различных регионов в Kir2.1 и GIRK каналов в холестериновой чувствительности41,47,48,49, а также для определения предполагаемых холестеринсвязных сайтов в этих каналах32,50,51.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

протокол

Все экспериментальные процедуры с животными были проведены в Научном центре здоровья Университета Теннесси (UTHSC). Уход за животными и экспериментальные протоколы были рассмотрены и одобрены Комитетом по уходу за животными и использованию UTHSC, который является учреждением, аккредитованным Ассоциацией по оценке и аккредитации Организации По уходу за животными International.

1. Обогащение тканей и клеток с использованием метил-и-циклодекстрин, насыщенный холестерином

ПРИМЕЧАНИЕ: Протокол обогащения холестерина ниже подходит для тканей, клеток и клеточных линий. В качестве примера мы описываем шаги, выполняемые для обогащения мозговых артерий млекопитающих. Представитель результаты предоставляются как для мозговых артерий(рисунок 1) и нейронов(рисунок 4).

  1. Препарат МЗКД, насыщенный холестерином
    1. Взвесьте 0,064 г МЗКД и растворите его в колбе, содержащей 10 мл раствора фсфат-буфера сольятого раствора (PBS), чтобы получить окончательную концентрацию 5 мМ МЗКД. Перемешать раствор с перемешивания бар, чтобы убедиться, что M 'CD полностью растворяется.
    2. Взвесьте 0,0024 г порошка холестерина и добавьте его в ту же колбу, чтобы получить концентрацию холестерина 0,63 мм. Затем энергично перемешать раствор. Используйте шпатель, чтобы разбить как можно больше фрагментов холестерина, как это возможно (некоторые куски останутся до инкубации).
    3. Обложка колбу, по крайней мере два слоя парафина пленки и встряхнуть медленно (30 колебаний / мин) в 37 градусов по Цельсию водяной бане на ночь. Этот шаг имеет решающее значение.
    4. После 8-16 ч, охладить раствор до комнатной температуры (RT), а затем фильтровать его через 0,22 мкм фильтра полиyethersulfone шприца в стеклянную бутылку.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для достижения различных концентраций холестерина в растворе, отрегулируйте количество холестерина и МЗКД простой пропорцией. Важно поддерживать соотношение моляров МЗКД: холестерин в 8:1 для получения насыщения метил-и-циклодекстрина носителя с холестерином. Обогащающий холестерин раствор можно использовать немедленно или в течение нескольких дней, если он хранится при 4 градусах Цельсия. Тем не менее, холестерин обогащает способность снижается с течением времени, как холестерин агрегаты появляются, и решение становится облачным.
  2. Лечение мозговых артерий с помощью МЗКД, насыщенного холестерином
    1. Эвтанизировать крысу Спраг Доули (250-300 г), поместив ее в камеру с 2% изофлураном. Затем обезглавить обезболную крысу с помощью острой гильотины или большой острой пары ножниц.
      ПРИМЕЧАНИЕ: При регулярном выполнении этих процедур полезно разработать график заточки гильотины. Кроме того, отдельная ножница должна быть посвящена для обезглавливания грызунов. Обезглавливание грызунов является терминальной процедурой; поэтому инструменты не должны быть стерильными. Очистка с мыльной водой после каждого использования достаточно.
    2. Расположите голову крысы лицом вперед, подальше от исследователя. Поместите заостренные части среднего размера ножницы между черепом и стволом мозга, и вырезать боковой с обеих сторон.
    3. Используйте щипцвы, чтобы вырвать верхний череп открытым, подтягивая на основании черепа, где боковые порезы были сделаны и тщательно удалить мозг. Убедитесь в том, чтобы сократить оптические нервы, которые держат мозг в черепе.
    4. Положите мозг в стакан с PBS на льду после удаления.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Мозг может храниться на льду в течение 4-6 ч при 4 градусах Цельсия.
    5. В нестерильной среде передачи мозга крысы воском вскрытия чашу с достаточным КОЛИЧЕСТВОМ PBS, чтобы погрузить его. Прикрепите мозг вниз, чтобы он не двигался.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Шаг 1.2.5 может быть выполнен на RT, если выполняется быстро. В противном случае, это должно быть сделано на льду.
    6. Используйте острые щипцы и небольшие хирургические ножницы, чтобы вскрыть мозговые артерии и их ветви, которые образуют Круг Уиллиса у основания мозга под микроскопом в PBS на RT. Будьте нежны при вскрытии, чтобы убедиться, что ткани артерии не растягивается или вырезать. Этот шаг имеет решающее значение.
    7. Кратко промыть сегменты артерии (до 1 см в длину) в PBS либо в 96 хорошо пластины или в 35 мм блюдо, чтобы удалить остатки крови, а затем поместить их на 10 минут в достаточно холестерол раствор (подготовлен в шаг1.1), чтобы покрыть весь сегмент артерии. Используйте 35 мм блюдо, если есть достаточное количество холестеринообогащения решения и 96 хорошо пластины, если артерии малы или если есть нехватка холестеринообогащения решения.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Тот же подход может быть использован для обогащения других тканей и клеток с холестерином с помощью 60 мин инкубационного времени. Например, этот подход ранее использовался для обогащения холестерина мышечной мозговой артерии35,,45,гиппокампа нейронов32, предсердий миоцитов37, и HEK 293 клеток39. Минимальное время инкубации должно быть определено для каждой ткани или типа клетки на основе проверки обогащения холестерина в разных точках времени с холестерин-чувствительный анализ (например, биохимическое определение количества холестерина в ткани путем окрашивания с холестерина чувствительных флуоресценции красителя filipin).
  3. Пятно ткани артерии с стероидно-чувствительной флуоресценции красителя филиппинских определить любые изменения в уровнях холестерина.
    ПРИМЕЧАНИЕ: В разделе Представитель Результаты, мы демонстрируем результаты двух подходов для оценки изменений в уровнях холестерина: биохимический анализ осуществляется путем применения коммерчески доступных холестерина окисливания основе комплекта (см. Таблица материалов) и окрашивание с стероидной чувствительной флуоресценции dye filipin. Первый подход может быть выполнен, следуя инструкциям производителя. Ниже приводится протокол для последнего подхода.
    1. Используя свежую бутылку филиппинского порошка, приготовьте бульонный раствор 10 мг/мл в диметилсулькид (DMSO). Этот шаг имеет решающее значение.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Полученное решение светочувствительное. При правильном приготовлении, филиппинский бульонный раствор желтоватый. Некоторые филиппинский порошок может прилипнуть к крышке бутылки. Поэтому важно промыть бутылку и крышку с растворителем DMSO, чтобы сохранить все количество филиппинцев. После подготовки, филиппинский запас должен быть использован в течение нескольких дней. Филиппинец полностью теряет свою способность флуоресценции после 5 дней, даже при хранении в темноте при -20 градусов по Цельсию.
    2. Удалите сегменты артерий из раствора, обогащающего холестерин, и вымойте их в 3х с помощью PBS в течение 5 мин.
    3. Закрепите сегменты артерий в 4% параформальдегида в течение 15 мин на льду.
      ВНИМАНИЕ: Параформальдегид светочувствительный. Поэтому работа должна вестись в темноте.
    4. Поместите сегменты артерии в 0,5% Тритон в PBS на RT в течение 10 минут, чтобы проницательно ткани и облегчить проникновение красителя.
    5. Вымойте артерии сегментов 3x с PBS в течение 5 минут на шейкер. Этот шаг имеет решающее значение.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Когда Тритон был полностью вымыт, не должно быть никаких пузырьков на поверхности раствора PBS.
    6. Разбавить филиппинский бульонный раствор в PBS до конечной концентрации 25 мкг/мл. Удалите артерии форме раствора PBS и поместите их в разбавленный филиппинский раствор на 1 ч в темноте. Этот шаг имеет решающее значение.
    7. Вымойте филиппинцев путем полоскания артерии сегментов 3x с PBS в течение 5 минут на шейкере. Этот шаг имеет решающее значение.
    8. Промыть артерии сегментов кратко дистиллированной водой, поглощать чрезмерную жидкость с бумажной салфеткой, и смонтировать артерии на слайде с использованием коммерчески доступных монтажных носителей (см. Таблица материалов).
    9. Обложка артерии с coverslip избегая прокатки или скручивания артерии и установить слайды, чтобы высохнуть в темной области на RT в течение 24 ч.
    10. После монтажа носителя высыхает, печать крышкой края с четким лаком для ногтей, и оставить лак для ногтей, чтобы высохнуть в течение 10-15 мин. Хранить слайды в темноте при -20 градусов по Цельсию.
    11. Уравновесите слайды на RT перед визуализацией.
    12. Изображение ткани с флуоресцентным микроскопом или флуоресценции читателя с возбуждением набор на 340-380 нм и выбросов на 385-470 нм.
      ВНИМАНИЕ: филиппинские фотоблебы быстро; таким образом, образцы должны быть отображались оперативно.

2. Обогащение ооцитов ксенопуса с использованием обогащенных холестерином рассеивания на основе фосфолипидов (липосомы)

  1. Подготовка решений
    1. Для приготовления запасного раствора холестерина растворите 10 мг порошка холестерина в 1 мл хлороформа в стакане 10 мл или бутылке. Перенесите раствор в стеклянную бутылку с крышкой 1,5 мл.
      ВНИМАНИЕ: В виду токсичности и быстрого испарения хлороформа, работайте в капоте и держите реагенты на льду.
    2. Подготовьте 150 мМ KCl, 10 мм Tris-HEPES, рН 7,4 буфера для обогащенных холестерином фосфолипидов. Для этого растворите в колбе Эрленмейера 5,5905 г KCl и 0,6057 г Tris в двойной дистиллированной воде в общей сложности 0,5 л объема. В другой колбе растворите 5,5905 г KCl и 1.19155 г HEPES в двойной дистиллированной воде в общей сложности 0,5 л объема. Смешайте два решения вместе в колбу 1 L Erlenmeyer, и настроить рН до 7,4 с HCl.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Храните полученный 150 мм KCl, 10 мм Tris-HEPES раствор при 4 градусах Цельсия.
    3. Для подготовки ND96 досреднего ооцита культивирования (низкий K,низкий Ca2 ") буфер, объединить 1 мл 2 M KCl, 1 мл 1 М MgCl2, 45,5 мл 2 M NaCl, и 5 мл 1/1 M NaOH-HEPES в 1 л Эрленмайер колбу. Добавьте 900 мл двойной дистиллированной воды и отрегулируйте рН до 7,4 с HCl. Перенесите раствор на цилиндр объемом 1 л и доведите объем до 1 л с двойной дистиллированной водой. Затем добавьте 1,8 мл 1 M CaCl2 и отфильтруйте раствор.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Незначительные различия в соотношениях между компонентами, используемыми для изготовления решения ND96, не кажутся критическими для обогащения холестерина, возможно, потому, что решение ND96 не используется во время самого шага обогащения, а для хранения. Примером является 1 л раствор, который имеет несколько более низкую концентрацию ионов натрия и хлорида, и производится путем объединения 2 мл 1 М KCl, 1 мл 1 М MgCl2, 82,5 мл 1 M NaCl, 5 мл 1 M HEPES, и 1,8 мл 1 M CaCl2 (Ca2 " опущен для получения Ca 2" бесплатное решение). Отрегулируйте рН раствора до 7,4 с помощью NaOH. Храните полученный ND96 раствор культивирования яйцеклеток при 4 градусах по Цельсию в течение 1 месяца.
  2. Препарат дисперсии на основе фосфолипидов с липосом холестерина
    1. В стеклянной трубке мощностью 12 мл смешайте 200 л/л каждого из следующих 10 мг/мл хлороформрастворимых липидных растворов: L-я-фосфатидидаланоламин, 1-пальмитоил-2-олеоил-сн-глицеро-3-фосфо-л-серин и холестерин.
    2. Испаряйте хлороформ в капоте, чтобы медленно высохнуть под потоком азота. Этот шаг имеет решающее значение.
    3. Приостановить липиды в 800 л буферизированного раствора, состоящего из 150 мм KCl и 10 мм Tris-HEPES на рН 7,4, и накрыть парафина пленкой.
    4. Соняйте осторожно при 80 кГц в течение 10 минут до тех пор, пока не образуется молочная смесь. Этот шаг имеет решающее значение.
      ВНИМАНИЕ: При звуке дисперсия в стеклянной трубке должна мягко вибрировать, образуя небольшие волны. Капли дисперсии не должны прыгать в трубку.
  3. Обогащение яйцеклеток Ксенопуса холестерином
    ПРИМЕЧАНИЕ: Лягушка яичников, содержащих яичники могут быть получены из двух источников: Во-первых, Xenopus laevis женские лягушки могут быть размещены для целей в доме хирургии. Эта процедура должна быть одобрена Институциональным комитетом по уходу за животными и использованию. Во-вторых, целые яичники можно приобрести у коммерческих поставщиков. В качестве альтернативы покупке или изоляции целых яичников, а затем переваривания их, как описано в шагах 2.3.1-2.3.4, отдельные яйцеклетки доступны на коммерческой основе для покупки. При использовании последних можно пропустить шаги 2.3.1-2.3.4.
    1. Храните свежеполученные яичники на уровне 14 градусов по Цельсию в растворе ND96. В этих условиях яичники могут храниться до 1 недели.
    2. Для получения отдельных яйцеклеток, нарушить мешок яичников в нескольких местах с помощью острых щипцы. Поместите куски яичников в 60 мм пластины, с 5 мл Ca2 "бесплатноND96 дополнены 0,5 мг / мл коллагеназы. Встряхните на орбитальном шейкере при 60 колебаниях/мин в течение 15 мин на RT.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Этот шаг обеспечит пищеварение мешка яичников. Чтобы сохранить ферментативную активность, избегайте хранения коллагеназы, содержащей ND96 в течение длительных периодов времени (Nogt;1 ч). Даже краткое хранение должно осуществляться при низких температурах ниже 15 градусов по Цельсию.
    3. Используя передачу пипетки с широким кончиком, энергично пипетка яйцесодержащего раствора вверх и вниз примерно 5-10x, чтобы отделить отдельные ооциты. На этом этапе решение станет темным.
    4. Быстро промыть яйцеклетки с Ca2 "бесплатноND96, пока раствор не станет прозрачным.
    5. Перенесите отдельные ооциты в раствор Ca2',содержащий ND-96, дополненный 2 мг/мл гентамицина с помощью переносной пипетки с узким наконечником.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Этот шаг имеет важное значение, когда необходимо хранить яйцеклетки. Индивидуальные яйцеклетки можно хранить в инкубаторе в течение нескольких дней при 14-17 градусах Цельсия. Тем не менее, мертвые яйцеклетки, которые беловатые должны быть удалены по крайней мере один раз в день, чтобы избежать загрязнения раствора токсичными химическими веществами.
    6. Передача 90 зл и с фосфолипидной дисперсии на основе холестерина в одну скважину на основе 96.
    7. Перенесите до 6 яйцеклеток от среды ND96 к наилучшим образом с как мало средним как по возможности. Этот шаг имеет решающее значение.
      ВНИМАНИЕ: Не подвергайте яйцеклетки воздуху во время передачи, чтобы сохранить ооциты нетронутыми.
    8. Поместите пластину 96 скважин на трехмерный ротатор платформы, чтобы обеспечить небольшое орбитальное движение ооцитов в клетке в течение 5-10 мин.
    9. Добавьте каплю ND96 в колодец и перенесите обогаты, обогащенные холестерином, из пластины 96 скважин в 35-мм пластину с ND96 для немедленного использования. Этот шаг имеет решающее значение.
    10. Используйте коммерчески доступный комплект на основе оксидазы холестерина (см. Таблица материалов)для оценки изменений в уровнях холестерина, следуя инструкциям производителя.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Результаты

Использование циклодекстрин насыщен холестерина в качестве средства для обогащения тканей и клеток с холестерином хорошо установлено. Здесь мы сначала демонстрируем применение этого широко используемого подхода для обогащения крысиных мозговых артерий холестерин...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Обсуждение

Методы обогащения тканей и клеток млекопитающих и ксенопусов холестерином представляют собой мощный инструмент для исследования влияния повышенного уровня холестерина на отдельные молекулярные виды, на сложные макромолекулярные системы (например, белки) и на клеточные и органн...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Раскрытие информации

Д-р А. М. Допико является специальным, неполный рабочий день, федеральный служащий и нынешний член Национального консультативного совета по злоупотреблению алкоголем и алкоголизмом.

Благодарности

Эта работа была поддержана Грант развития ученых (11SDG5190025) от Американской ассоциации сердца (в A.R.-D.), и Национальный институт здравоохранения R01 грантов AA-023764 (до A.N.B.), и HL-104631 и R37 AA-11560 (к A.M.D.).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
Amplex Red Cholesterol Assay KitInvitrogenA12216
Pierce BCA Protein Assay KitThermo Scientific23225
Pre-Diluted Protein Assay Standards BSA setThermo Scientific23208
Brain PE 25Mg in ChloroformAvanti Lipids840022C
16:0-18:1 PS 25Mg ChloroformAvanti Lipids840034C
Cholesterol 100Mg PowderSigmaC8667
KClFisherP217
Trizma baseSigmaT6066
HEPESCorning61-034-RO
MgCl2FisherM33
NaClFisherS271
KH2PO4FisherP285
MgSO4EMD ChemicalsMX0070-1
EDTAVWRE177
Dextrose AnhydrousFisherBP350
NaHCO3SigmaS6014
CaCl2SigmaC3881
Blood Gas TanknexAir
NaOHFisherS318
1.5mL tubesFisherS35818
Gastight Syringe 100uLHamilton1710
Microliter Syringe 25uLHamilton702
12 mL heavy duty conical centrifuge beaded rim tubePyrex8120-12
ChloroformFisherC298
Support StandHomescience ToolsCE-STAN5X8
Universal Clamp, 3-ProngHomescience ToolsCE-CLPUNIV
SonicatorLaboratory SuppliesG112SP1G
3D rotator mixerBenchmark ScientificB3D 1308
96 well plateSigmaBR781602
N2 gasnexAir
Glass beakers 40ml-1LFisher02-540
Ice MachineScotsmanCU1526MA-1
Ice bucketFisher50-136-7764
1X PBSCorning21-031-CM
TritonXFisherBP151-100
Sonic DismembratorFisherModel 100
Eppendorf microcentrifugeEppendorfModel 5417R
Amber bottlesFisher03-251-420
Corning™ Disposable Glass Pasteur PipetsFIsher13-678-4A
ParafilmFIsher50-998-944
Isotemp™ BOD Refrigerated IncubatorFIsher97-990E
OocytesXenoocyte™10005
RatEnvigoSprague Dawleyweight 250g
Methyl-β-cyclodextrinSigmaC4555
Water bath incubator with shakerPrecision51221080Lowest shaker setting O/N 37 °C
FilipinSigmaSAE0088-1ML
DMSOFisherBP231
Paraformaldehyde 4%Mallinckrodt2621
DI H2OUniversity DI source
ProLong Gold antifade reagnetInvitrogenP10144
Microslides 75x25mm FrostedDiaggerG15978A
ForcepsFine Science Tools11255-20
Microscope CoverslipDiaggerG15972B
Clear nail polishRevlon771 Clear
Labeling TapeFisher15-901-20F
Securline Lab Marker IISigmaZ648205-5EA
BD 10mL SyringeFisher14-823-16E
1.2 μm syringe filterVWR28150-958
KimWipesFisher06-666A
pH probeSartoruspy-p112s
pH meterDenver instrumentModel 225
70% ETOHPharmco211USP/NF
TimerFisher02-261-840
Steno bookStaples163485

Ссылки

  1. Yeagle, P. L. Cholesterol and the cell membrane. Biochimica et Biophysica Acta. 822, 267-287 (1985).
  2. Yeagle, P. L. Modulation of membrane function by cholesterol. Biochimie. 73, 1303-1310 (1991).
  3. Gimpl, G., Burger, K., Fahrenholz, F. Cholesterol as modulator of receptor function. Biochemistry. 36, 10959-10974 (1997).
  4. Maxfield, F. R., van Meer, G. Cholesterol, the central lipid of mammalian cells. Current Opinion in Cell Biology. 22, 422-429 (2010).
  5. Goluszko, P., Nowicki, B. Membrane cholesterol: a crucial molecule affecting interactions of microbial pathogens with mammalian cells. Infection and Immunity. 73, 7791-7796 (2005).
  6. Ramprasad, O. G., et al. Changes in cholesterol levels in the plasma membrane modulate cell signaling and regulate cell adhesion and migration on fibronectin. Cell Motility and Cytoskeleton. 64, 199-216 (2007).
  7. Rosenhouse-Dantsker, A., Mehta, D., Levitan, I. Regulation of Ion Channels by Membrane Lipids. Comprehensive Physiology. 2, 31-68 (2012).
  8. Direct mechanisms in cholesterol modulation of protein function. Advances in Experimental Medicine and Biology. Rosenhouse-Dantsker, A., Bukiya, A. N. , Springer Nature. Switzerland. 1135(2019).
  9. Cholesterol modulation of protein function: sterol specificity and indirect mechanisms. Advances in Experimental Medicine and Biology. Rosenhouse-Dantsker, A., Bukiya, A. N. , Springer Nature. Switzerland. 1115(2019).
  10. Kellner-Weibel, G., Geng, Y. J., Rothblat, G. H. Cytotoxic cholesterol is generated by the hydrolysis of cytoplasmic cholesteryl ester and transported to the plasma membrane. Atherosclerosis. 146, 309-319 (1999).
  11. Kruth, H. S. Lipoprotein cholesterol and atherosclerosis. Current Molecular Medicine. 1, 633-653 (2001).
  12. Ross, R. Atherosclerosis--an inflammatory disease. The New England Journal of Medicine. 340, 115-126 (1999).
  13. Steinberg, D. Atherogenesis in perspective: hypercholesterolemia and inflammation as partners in crime. Nature Medicine. 8, 1211-1217 (2002).
  14. Ho, Y. S., Poon, D. C. H., Chan, T. F., Chang, R. C. C. From small to big molecules: How do we prevent and delay the progression of age- related neurodegeneration? Current Pharmaceutical Design. 18, 15-26 (2012).
  15. Stefani, M., Liguri, G. Cholesterol in Alzheimer's disease: Unresolved questions. Current Alzheimer Research. 6, 15-29 (2009).
  16. Ong, W. Y., Halliwell, B. Iron, atherosclerosis, and neurodegeneration: A key role for cholesterol in promoting iron-dependent oxidative damage? Annals of the New York Academy of Sciences. 1012, 51-64 (2004).
  17. Igoumenou, A., Ebmeier, K. P. Diagnosing and managing vascular dementia. Practitioner. 256, 13-16 (2012).
  18. Luu, W., Gelissen, I. C., Brown, A. J. Manipulating Cholesterol Status Within Cells. Methods in Molecular Biology. 1583, 41-52 (2017).
  19. Egom, E. E. A., Hafeez, H. Biochemistry of statins. Advances in Clinical Chemistry. 73, 127-168 (2016).
  20. Igel, M., Sudhop, T., von Bergmann, K. Pharmacology of 3-hydroxy-3-methylglutaryl-coenzyme A reductase inhibitors (statins), including rosuvastatin and pitavastatin. Journal of Clinical Pharmacology. 42, 835-845 (2002).
  21. Nakanishi, M., Goldstein, J. L., Brown, M. S. Multivalent control of 3-hydroxy-3-methylglutaryl coenzyme A reductase. Mevalonate-derived product inhibits translation of mRNA and accelerates degradation of enzyme. The Journal of Biological Chemistry. 263, 8929-8937 (1988).
  22. López, C. A., de Vries, A. H., Marrink, S. J. Molecular Mechanism of Cyclodextrin Mediated Cholesterol Extraction. PLoS Computational Biology. 7, e1002020(2011).
  23. Christian, A. E., Haynes, M. P., Phillips, M. C., Rothblat, G. H. Use of cyclodextrins for manipulating cellular cholesterol content. Journal of Lipid Research. 38, 2264-2272 (1997).
  24. Dai, S., et al. Methyl-β-cyclodextrin restores impaired autophagy flux in Niemann-Pick C1-deficient cells through activation of AMPK. Autophagy. 13, 1435-1451 (2017).
  25. Chen, F. W., Li, C., Ioannou, Y. A. Cyclodextrin induces calcium- dependent lysosomal exocytosis. PLoS One. 5, e15054(2010).
  26. Soga, M., et al. HPGCD outperforms HPBCD as a potential treatment for Niemann-Pick disease type C during disease modeling with iPS cells. Stem Cells. 33, 1075-1088 (2015).
  27. Maetzel, D., et al. Genetic and chemical correction of cholesterol accumulation and impaired autophagy in hepatic and neural cells derived from Niemann-Pick Type C patient-specific iPS cells. Stem Cell Reports. 2, 866-880 (2014).
  28. Sarkar, S., et al. Impaired autophagy in the lipid-storage disorder Niemann-Pick type C1 dis- ease. Cell Reports. 5, 1302-1315 (2013).
  29. Rosenbaum, A. I., Zhang, G., Warren, J. D., Maxfield, F. R. Endocytosis of beta-cyclodextrins is responsible for cholesterol reduction in Niemann-Pick type C mutant cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107, 5477-5482 (2010).
  30. Yu, D., et al. Niemann-Pick Disease Type C: Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Neuronal Cells for Modeling Neural Disease and Evaluating Drug Efficacy. Journal of Biomolecular Screening. 19, 1164-1173 (2014).
  31. Zidovetzki, R., Levitan, I. Use of cyclodextrins to manipulate plasma membrane cholesterol content: evidence, misconceptions and control strategies. Biochimica et Biophysica Acta. 1768, 1311-1324 (2007).
  32. Bukiya, A. N., Durdagi, S., Noskov, S., Rosenhouse-Dantsker, A. Cholesterol up-regulates neuronal G protein-gated inwardly rectifying potassium (GIRK) channel activity in the hippocampus. The Journal of Biological Chemistry. 292, 6135-6147 (2017).
  33. Bukiya, A. N., Vaithianathan, T., Kuntamallappanavar, G., Asuncion-Chin, M., Dopico, A. M. Smooth muscle cholesterol enables BK β1 subunit-mediated channel inhibition and subsequent vasoconstriction evoked by alcohol. Arteriosclerosis, Thrombosis and Vascular Biology. 31, 2410-2423 (2011).
  34. Hegele, R. A. Plasma lipoproteins: genetic influences and clinical implications. Nature Reviews Genetics. 10, 109-121 (2009).
  35. Bisen, S., et al. Distinct mechanisms underlying cholesterol protection against alcohol-induced BK channel inhibition and resulting vasoconstriction. Biochimica et Biophysica Acta. 1861, 1756-1766 (2016).
  36. Santiago, J., et al. Probing the Effects of Membrane Cholesterol in the Torpedo californica Acetylcholine Receptor and the Novel Lipid-exposed Mutation αC418W in Xenopus Oocytes. The Journal of Biological Chemistry. 276, 46523-46532 (2001).
  37. Deng, W., et al. Hypercholesterolemia induces up-regulation of KACh cardiac currents via a mechanism independent of phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate and Gβγ. The Journal of Biological Chemistry. 287, 4925-4935 (2012).
  38. Bukiya, A. N., Blank, P. S., Rosenhouse-Dantsker, A. Cholesterol intake and statin use regulate neuronal G protein-gated inwardly rectifying potassium channels by cholesterol and PI(4,5)P2. Journal of Lipid Research. 60, 19-29 (2019).
  39. Bukiya, A. N., et al. Cholesterol increases the open probability of cardiac KACh currents. Biochimica et Biophysica Acta Biomembranes. 1848, 2406-2413 (2015).
  40. Bukiya, A. N., Rosenhouse-Dantsker, A. Hypercholesterolemia effect on potassium channels. Hypercholesterolemia. Kumar, S. A. , Intech. 95-119 (2015).
  41. Rosenhouse-Dantsker, A., et al. Distant cytosolic residues mediate a two-way molecular switch that controls the modulation of Kir channels by cholesterol and PI(4,5)P2. The Journal of Biological Chemistry. 287, 40266-40278 (2012).
  42. Chun, Y. S., Oh, H. G., Park, M. K., Cho, H., Chung, S. Cholesterol regulates HERG K+ channel activation by increasing phospholipase C β1 expression. Channels. 7, 275-287 (2013).
  43. Luchetti, G., et al. Cholesterol activates the G-protein coupled receptor Smoothened to promote Hedgehog signaling. eLife. 5, e20304(2016).
  44. Sun, S., et al. Cholesterol-dependent modulation of stem cell biomechanics: application to adipogenesis. Journal of Biomechanical Engineering. , In Press (2019).
  45. North, K., Bisen, S., Dopico, A. M., Bukiya, A. N. Tyrosine 450 in the Voltage- and Calcium-Gated Potassium Channel of Large Conductance Channel Pore-Forming (slo1) Subunit Mediates Cholesterol Protection against Alcohol-Induced Constriction of Cerebral Arteries. The Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 367, 234-244 (2018).
  46. Bukiya, A. N., Dopico, A. M. Regulation of BK Channel Activity by Cholesterol and Its Derivatives. Advances in Experimental Medicine and Biology. 1115, 53-75 (2019).
  47. Rosenhouse-Dantsker, A., Leal-Pinto, E., Logothetis, D. E., Levitan, I. Comparative analysis of cholesterol sensitivity of Kir channels: role of the CD loop. Channels. 4, 63-66 (2010).
  48. Rosenhouse-Dantsker, A., Logothetis, D. E., Levitan, I. Cholesterol Sensitivity of Kir2.1 is controlled by a belt of residues around the cytosolic pore. Biophysical Journal. 100, 381-389 (2011).
  49. Rosenhouse-Dantsker, A., Noskov, S. Y., Logothetis, D. E., Levitan, I. Cholesterol sensitivity of Kir2.1 depends on functional inter-links between the N and C termini. Channels. 7, 303-312 (2013).
  50. Rosenhouse-Dantsker, A., Noskov, S., Durdagi, S., Logothetis, D. E., Levitan, I. Identification of novel cholesterol-binding regions in Kir2 channels. The Journal of Biological Chemistry. 288, 31154-31164 (2013).
  51. Bukiya, A. N., Rosenhouse-Dantsker, A. Synergistic activation of G protein-gated inwardly rectifying potassium channels by cholesterol and PI(4,5)P2. Biochimica et Biophysica Acta Biomembranes. 1859, 1233-1241 (2017).
  52. Yi, A., Lin, Y. F., Jan, Y. N., Jan, L. Y. Yeast screen for constitutively active mutant G protein-activated potassium channels. Neuron. 29, 657-667 (2001).
  53. Bukiya, A., Dopico, A. M., Leffler, C. W., Fedinec, A. Dietary cholesterol protects against alcohol-induced cerebral artery constriction. Alcoholism, Clinical and Experimental Research. 38, 1216-1226 (2014).
  54. Simakova, M. N., Bisen, S., Dopico, A. M., Bukiya, A. N. Statin therapy exacerbates alcohol-induced constriction of cerebral arteries via modulation of ethanol-induced BK channel inhibition in vascular smooth muscle. Biochemical Pharmacology. 145, 81-93 (2017).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

157

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены