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In diesem Artikel

  • Zusammenfassung
  • Zusammenfassung
  • Einleitung
  • Protokoll
  • Ergebnisse
  • Diskussion
  • Offenlegungen
  • Danksagungen
  • Materialien
  • Referenzen
  • Nachdrucke und Genehmigungen

Zusammenfassung

Zwei Methoden der Cholesterinanreicherung werden vorgestellt: die Anwendung von Cyclodextrin, das mit Cholesterin gesättigt ist, um Säugetiergewebe und -zellen anzureichern, und die Verwendung von cholesterinangereicherten Phospholipid-basierten Dispersionen (Liposomen) zur Anreicherung von Xenopus-Oozyten. Diese Methoden sind entscheidend für die Bestimmung der Auswirkungen von erhöhten Cholesterinspiegel in molekularen, zellulären, und Organfunktion.

Zusammenfassung

Cholesterin-Anreicherung von Säugetiergeweben und -zellen, einschließlich Xenopus-Oozyten, die zur Untersuchung der Zellfunktion verwendet werden, kann mit einer Vielzahl von Methoden durchgeführt werden. Hier beschreiben wir zwei wichtige Ansätze, die zu diesem Zweck verwendet werden. Zunächst beschreiben wir, wie Gewebe und Zellen mit Cholesterin angereichert werden, indem man Cyclodextrin, das mit Cholesterin gesättigt ist, mit Zerebralen arterienden (Gewebe) und Hippocampus-Neuronen (Zellen) als Beispiele anreichert. Dieser Ansatz kann für jede Art von Gewebe, Zellen oder Zelllinien verwendet werden. Ein alternativer Ansatz für die Cholesterinanreicherung beinhaltet die Verwendung von Low-Density-Lipoprotein (LDL). Der Vorteil dieses Ansatzes ist, dass es einen Teil der natürlichen CholesterinHomöostase-Maschinerie der Zelle verwendet. Während jedoch der Cyclodextrin-Ansatz angewendet werden kann, um jede Zellart des Interesses mit Cholesterin zu bereichern, ist der LDL-Ansatz auf Zellen beschränkt, die LDL-Rezeptoren exprimieren (z. B. Leberzellen, Knochenmark-abgeleitete Zellen wie Blutleukozyten und Gewebemakrophagen), und der Grad der Anreicherung hängt von der Konzentration und der Mobilität des LDL-Rezeptors ab. Darüber hinaus enthalten LDL-Partikel andere Lipide, so dass die Cholesterinabgabe unspezifisch ist. Zweitens beschreiben wir, wie Xenopus-Oozyten mit Cholesterin angereichert werden können, indem man eine phospholipidbasierte Dispersion (d. h. Liposomen) verwendet, die Cholesterin enthält. Xenopus Oozyten bilden ein beliebtes heterologes Expressionssystem, das zur Untersuchung der Zell- und Proteinfunktion verwendet wird. Sowohl für den Cyclodextrin-basierten Cholesterinanreicherungsansatz von Säugetiergewebe (Zerebralenarterien) als auch für den phospholipidbasierten Cholesterinanreicherungsansatz von Xenopus Oozyten zeigen wir, dass der Cholesterinspiegel nach 5 min Inkubation ein Maximum erreicht. Dieser Cholesterinspiegel bleibt während längerer Inkubationszeiten (z.B. 60 min) konstant. Zusammen bilden diese Daten die Grundlage für optimierte zeitliche Bedingungen für die Cholesterinanreicherung von Geweben, Zellen und Xenopus-Oozyten für funktionelle Studien, die darauf abzielen, die Auswirkungen der Cholesterinanreicherung zu hinterfragen.

Einleitung

Cholesterin, ein wichtiges zelluläres Lipid, spielt zahlreiche kritische funktionelle und strukturelle Rollen1,2,3,4,5,6,7,8,9. Von der Regulierung der physikalischen Eigenschaften der Plasmamembran bis hin zur Sicherstellung der Zelllebensfähigkeit, des Wachstums, der Proliferation und der Funktion als Signal- und Vorläufermolekül in einer Vielzahl biochemischer Bahnen ist Cholesterin ein zwingender Bestandteil, der für die normale Zell- und Organfunktion notwendig ist. Als Ergebnis, Cholesterinmangel führt zu schweren körperlichen Fehlbildungen und eine Vielzahl von Störungen. Auf der anderen Seite, auch eine kleine Erhöhung des Cholesterins über physiologischen Niveaus (2-3x) ist zytotoxisch1,2,10 und wurde mit der Entwicklung von Erkrankungen, einschließlich Herz-Kreislauf11,12,13 und neurodegenerative Erkrankungen14,15,16,17verbunden. Um die kritischen Funktionen des Cholesterins zu hinterfragen und die Wirkung von Veränderungen des Cholesterinspiegels zu bestimmen, wurden verschiedene Ansätze entwickelt, die den Cholesteringehalt in Geweben, Zellen und Xenopus-Oozyten verändern.

Veränderung des Cholesterinspiegels in Säugetiergeweben und -zellen
Mehrere Ansätze können genutzt werden, um den Cholesterinspiegel in Geweben und Zellen18zu senken. Ein Ansatz beinhaltet ihre Exposition gegenüber Statinen, die in Lipoprotein-defizigem Serum gelöst werden, um HMG-CoA-Reduktase zu hemmen, die die Rate der Cholesterinsynthesesteuert 19,20. Jedoch, Diese Cholesterin senkenden Medikamente hemmen auch die Bildung von Nicht-Sterol-Produkte entlang der Mevalonat-Weg. Daher wird eine kleine Menge Mevalonat hinzugefügt, um die Bildung dieser Produkte zu ermöglichen21 und die Spezifität dieses Ansatzes zu verbessern. Ein weiterer Ansatz zur Senkung des Cholesterinspiegels beinhaltet die Verwendung von Cyclodextrinen. Diese Glucopyranose-Monomere besitzen eine interne hydrophobe Höhle mit einem Durchmesser, der der Größe der Sterole22entspricht, was die Extraktion von Cholesterin aus Zellen erleichtert und sie dadurch von ihrem nativen Cholesteringehalt23erschöpft. Ein Beispiel ist 2-Hydroxypropyl-Cyclodextrin (HP-CD), ein präklinisches Medikament, das derzeit zur Behandlung der Niemann-Pick-Typ-C-Krankheit getestet wird, einer genetisch vererbten tödlichen Stoffwechselstörung, die durch lysosomale Cholesterinspeicherung gekennzeichnet ist24. Der Grad des Cholesterinmangels hängt von dem verwendeten spezifischen Derivat ab. Zum Beispiel extrahiert HP-CD Cholesterin mit einer geringeren Kapazität als das methylierte Derivat, Methyl-A-Cyclodextrin (M-CD)24,25,26,27,28,29,30. Vor allem aber können neben Cholesterin auch andere hydrophobe Moleküle extrahiert werden, die dann zu unspezifischen Wirkungen führen können31. Im Gegensatz zur Erschöpfung können Zellen und Gewebe durch die Behandlung mit dem mit Cholesterin23vorgesättigten A-Cyclodextrin gezielt mit Cholesterin angereichert werden. Dieser Ansatz kann auch als Kontrolle für die Spezifität von ,,Cyclodextrinen" verwendet werden, die für den Cholesterinmangel verwendet werden31. Der Abbau von Cholesterin aus Geweben und Zellen ist einfach und kann erreicht werden, indem die Zellen für 30-60 min bis 5 mM M'CD in dem Medium, das für die Lagerung der Zellen verwendet wird, gelöst werden. Dieser Ansatz kann zu einer 50%igen Abnahme des Cholesteringehalts führen (z.B. in Hippocampus-Neuronen32, Rattenhirnarterien33). Auf der anderen Seite ist die Vorbereitung des "Cyclodextrin-Cholesterin-Komplexes" für die Cholesterinanreicherung von Gewebe und Zellen komplexer und wird im Protokollabschnitt beschrieben.

Ein alternativer Ansatz zur Anreicherung von Geweben und Zellen mit mit Cholesterin gesättigtem X-Cyclodextrin beinhaltet die Verwendung von LDL, das auf LDL-Rezeptoren beruht, die in den Geweben/Zellen18exprimiert werden. Während dieser Ansatz bietet den Vorteil der Verwendung der natürlichen Cholesterin Homöostase Maschinerie der Zelle, Es hat mehrere Einschränkungen. Erstens können Gewebe und Zellen, die den LDL-Rezeptor nicht ausdrücken, mit diesem Ansatz nicht angereichert werden. Zweitens enthalten LDL-Partikel neben Cholesterin auch andere Lipide. Insbesondere besteht LDL aus dem Protein ApoB100 (25%) und die folgenden Lipide (75%): 6-8% Cholesterin, 45-50% Cholesterylester, 18-24% Phospholipide und 4-8% Triacylglycerole34. Daher ist die Abgabe von Cholesterin über LDL-Partikel unspezifisch. Drittens kann der prozentuale Anstieg des Cholesteringehalts durch LDL in Geweben und Zellen, die den LDL-Rezeptor ausdrücken, signifikant niedriger sein als der Mit dem Cholesteringehalt beobachtete Anstieg. Zum Beispiel, in einer früheren Studie, Anreicherung von Nagetier Hirnarterien mit Cholesterin über LDL führte nur zu einem 10-15% Anstieg des Cholesterinspiegels35. Im Gegensatz dazu führte die Anreicherung dieser Arterien mit Cyclodextrin, das mit Cholesterin gesättigt ist, wie im Protokollabschnitt beschrieben, zu einer >50%igen Erhöhung des Cholesteringehalts (siehe Abschnitt Repräsentative Ergebnisse, Abbildung 1).

Veränderung des Cholesterinspiegels in Xenopus Oozyten
Xenopus Oozyten bilden ein heterologes Expressionssystem, das häufig zur Untersuchung der Zell- und Proteinfunktion verwendet wird. Frühere Studien haben gezeigt, dass das Cholesterin-Zu-Phospholipid-Molaren-Verhältnis in Xenopus-Oozyten 0,5 x 0,136beträgt. Aufgrund dieses intrinsischen hohen Cholesterinspiegels ist die Erhöhung des Cholesterinspiegels in diesem System eine Herausforderung, kann aber mit Dispersionen aus Membranphospholipiden und Cholesterin erreicht werden. Die Phospholipide, die wir für diesen Zweck gewählt haben, ähneln denen, die zur Bildung künstlicher planarer Lipid-Doppelschichten verwendet werden, und umfassen L-A-Phosphatidylethanolamin (POPE) und 1-Palmitoyl-2-Oleoyl-sn-glycero-3-phospho-l-serin (POPS), wie im Protokollabschnitt beschrieben. Dieser Ansatz kann zu >50% Anstieg des Cholesteringehalts führen (siehe Abschnitt Repräsentative Ergebnisse, Abbildung 2).

Ein alternativer Ansatz zur Anreicherung von Xenopus-Oozyten mit phospholipidbasierten Dispersionen beinhaltet die Verwendung von Cyclodextrin, das mit Cholesterin gesättigt ist, was der Art und Weise ähnelt, wie Gewebe und Zellen angereichert werden. Wir haben jedoch festgestellt, dass dieser Ansatz von geringer Reproduzierbarkeit und Effizienz ist, mit einem durchschnittlichen Anstieg des Cholesteringehalts um 25 %. Dies ist möglicherweise auf die unterschiedliche Belastbarkeit dieser beiden Ansätze zurückzuführen (siehe Abschnitt Repräsentative Ergebnisse, Abbildung 3). Im Gegensatz dazu hat sich gezeigt, dass die Verwendung von Cyclodextrin, um Cholesterin aus Xenopus Oozyten zu erschöpfen, zu einer Abnahme des Cholesteringehalts um 40 % führen kann36.

Hier konzentrieren wir uns auf die Cholesterinanreicherung von Säugetiergeweben und -zellen durch die Anwendung von Cyclodextrin, das mit Cholesterin gesättigt ist, und von Xenopus Oozyten mit Liposomen. Beide Ansätze können genutzt werden, um die Wirkung eines erhöhten Cholesterinspiegels auf die Proteinfunktion abzuleiten. Die Mechanismen der Cholesterinmodulation der Proteinfunktion können direkte Wechselwirkungen8 und/oder indirekte Effektebeinhalten 9. Wenn Cholesterin die Proteinfunktion über direkte Wechselwirkungen beeinflusst, ist die Wirkung eines Anstiegs des Cholesterinspiegels auf die Proteinaktivität wahrscheinlich unabhängig vom Zelltyp, Expressionssystem oder Anreicherungsansatz. Zum Beispiel nutzten wir diese beiden Ansätze, um die Wirkung von Cholesterin auf G-Protein-Gated-Innen-Rektifizierenden Kaliumkanälen (GIRK) zu bestimmen, ausgedrückt in Vorhoffnden Myozyten37, Hippocampus-Neuronen32,38, HEK29339 Zellen und Xenopus-Oozyten 32,37. Die in diesen Studien erzielten Ergebnisse waren konsistent: in allen drei Arten von Säugetierzellen und in Amphibien-Oozyten wurde die GIRK-Kanalfunktion von Cholesterin hochreguliert (siehe Abschnitt Repräsentative Ergebnisse, Abbildung 4, für Hippocampus-Neuronen und die entsprechenden Experimente in Xenopus-Oozyten). Darüber hinaus stimmten die in diesen Studien gemachten Beobachtungen auch mit den Ergebnissen von Studien überein, die an den Vorhofmyozyten37,40 und hippocampalneuronen32,38 frisch isoliert von Tieren, die einer hohen Cholesterindiät ausgesetztwaren, 40durchgeführt wurden. Bemerkenswert ist, dass die Cholesterinanreicherung von Hippocampus-Neuronen mit M-CD die Wirkung der Atorvastatin-Therapie, die zur Bekämpfung der Auswirkungen der hohen Cholesterin-Diät sowohl auf den Cholesterinspiegel als auch auf die GIRK-Funktionverwendetwird, umkehrte. In anderen Studien untersuchten wir die Wirkung von Mutationen auf die Cholesterinempfindlichkeit des nach innen korrigierenden Kaliumkanals Kir2.1 mit Xenopus-Oozyten und HEK293-Zellen41. Auch hier war die Wirkung der Mutationen auf die Empfindlichkeit des Kanals in den beiden Systemen ähnlich.

Die Anwendungen beider Anreicherungsmethoden zur Bestimmung der Auswirkungen erhöhter Cholesterinspiegel auf die Molekular-, Zell- und Organfunktion sind zahlreich. Insbesondere die Verwendung von Cyclodextrin-Cholesterin-Komplexen zur Anreicherung von Zellen und Geweben ist aufgrund seiner Spezifität sehr häufig. Jüngste Beispiele für diesen Ansatz sind die Bestimmung der Auswirkungen von Cholesterin auf herG-Kanalaktivierung und zugrunde liegende Mechanismen42, die Entdeckung, dass Cholesterin aktiviert die G-Protein gekoppelt Rezeptor Geglättet, um Hedgehog Signalisierung43zu fördern , und die Identifizierung der Rolle von Cholesterin in Stammzell Biomechanik und Adipogenese durch Membran-assoziierte Linker Proteine44. In unserer eigenen Arbeit nutzten wir die Anreicherung von Säugetiergewebe mit dem M-CD:Cholesterin-Komplex, um die Wirkung der Cholesterinanreicherung auf die Grundfunktion und das pharmakologische Profil von Kalzium- und Spannungskanälen großer Leitfähigkeit (BK, MaxiK) im vaskulären Glattmuskel35,45,46zuuntersuchen. In anderen Studien verwendeten wir den Phospholipid-basierten Dispersionsansatz zur Anreicherung von Xenopus-Oozyten mit Cholesterin, um die Rollen verschiedener Regionen in Kir2.1- und GIRK-Kanälen in der Cholesterinempfindlichkeit41,47,48,49, sowie zur Bestimmung vermeintlicher Cholesterinbindungsstellen in diesen Kanälen32,50,51zubestimmen.

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Protokoll

Alle experimentellen Eingriffe mit Tieren wurden am University of Tennessee Health Science Center (UTHSC) durchgeführt. Die Pflege von Tieren und Versuchsprotokolle wurden vom Animal Care and Use Committee des UTHSC überprüft und genehmigt, einer Einrichtung, die von der Association for Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Care International akkreditiert ist.

1. Anreicherung von Geweben und Zellen mit methyl--cyclodextrin gesättigt mit Cholesterin

HINWEIS: Das nachfolgende Cholesterinanreicherungsprotokoll ist für Gewebe, Zellen und Zelllinien geeignet. Als Beispiel beschreiben wir die Schritte zur Bereicherung der Hirnarterien von Säugetieren. Repräsentative Ergebnisse werden sowohl für hirnarteriende (Abbildung 1) als auch für Neuronen(Abbildung 4) bereitgestellt.

  1. Zubereitung von mit Cholesterin gesättigtem M-CD
    1. Wiegen Sie 0,064 g M-CD und lösen Sie es in einem Kolben, der 10 ml Phosphat-gepufferte Saline-Lösung (PBS) enthält, um eine Endkonzentration von 5 mM M-CD zu erhalten. Rühren Sie die Lösung mit einem Rührstab, um sicherzustellen, dass die M-CD vollständig aufgelöst ist.
    2. Wiegen Sie 0,0024 g Cholesterinpulver und fügen Sie es in den gleichen Kolben, um eine 0,63 mM Cholesterinkonzentration zu erhalten. Dann rühren Sie die Lösung kräftig. Verwenden Sie einen Spachtel, um so viele Cholesterin-Stücke wie möglich zu brechen (einige Brocken bleiben bis zur Inkubation).
    3. Den Kolben mit mindestens zwei Schichten Paraffinfolie bedecken und langsam schütteln (30 Schwingungen/min) in einem 37 °C Wasserbad über Nacht schütteln. Dieser Schritt ist von entscheidender Bedeutung.
    4. Nach 8-16 h die Lösung auf Raumtemperatur (RT) abkühlen lassen und dann durch einen 0,22 m Polyethersulfonspritzenfilter in eine Glasflasche filtern.
      ANMERKUNG: Um unterschiedliche Cholesterinkonzentrationen in Lösung zu erreichen, passen Sie die Mengen von Cholesterin und M-CD durch einfache Proportion. Es ist wichtig, das Molarenverhältnis von M-CD:Cholesterin bei 8:1 beizubehalten, um eine Sättigung des Methyl-Cyclodextrin-Trägers mit Cholesterin zu erhalten. Die cholesterinanreicherende Lösung kann bei 4 °C sofort oder über mehrere Tage verwendet werden. Jedoch, die Cholesterin-anreichernde Fähigkeit sinkt im Laufe der Zeit, wenn die Cholesterinaggregate erscheinen, und die Lösung wird trüb.
  2. Behandlung von Hirnarterien mit Cholesterin gesättigten M-CD
    1. Euthanisieren Sie eine Sprague Dawley Ratte (250-300 g), indem Sie sie in eine Kammer mit 2% Isofluran geben. Enthaupten Sie dann die anästhesierte Ratte mit einer scharfen Guillotine oder einer großen scharfen Schere.
      HINWEIS: Wenn Sie diese Verfahren regelmäßig durchführen, ist es sinnvoll, einen Zeitplan für die Guillotineschärfung zu entwickeln. Außerdem sollte eine separate Schere für die Enthauptung von Nagetieren vorgesehen sein. Die Enthauptung von Nagetieren ist ein terminales Verfahren; Daher müssen die Instrumente nicht steril sein. Die Reinigung mit Seifenwasser nach jedem Gebrauch ist ausreichend.
    2. Positionieren Sie den Kopf der Ratte nach vorne, weg vom Forscher. Legen Sie den spitzen Teil einer mittelgroßen Schere zwischen schädel- und hirnstamm und schneiden Sie seitlich auf beiden Seiten.
    3. Verwenden Sie Zangen, um den oberen Schädel zu hebeln, indem Sie auf der Basis des Schädels nach oben ziehen, wo die seitlichen Schnitte gemacht wurden, und entfernen Sie vorsichtig das Gehirn. Achten Sie darauf, die optischen Nerven zu schneiden, die das Gehirn im Schädel halten.
    4. Legen Sie das Gehirn in einen Becher mit PBS auf Eis nach der Entfernung.
      HINWEIS: Das Gehirn kann auf Eis für 4-6 h bei 4 °C gespeichert werden.
    5. In einer nicht sterilen Umgebung übertragen Sie das Rattenhirn in eine gewachste Sezierschale mit genügend PBS, um es unter Wasser zu setzen. Pin das Gehirn nach unten, um es von der Bewegung zu halten.
      HINWEIS: Schritt 1.2.5 kann bei RT durchgeführt werden, wenn es schnell durchgeführt wird. Andernfalls muss es auf Eis gemacht werden.
    6. Verwenden Sie scharfe Zangen und kleine chirurgische Scheren, um die Zerebralparese und ihre Zweige zu sezieren, die den Kreis von Willis an der Basis des Gehirns unter dem Mikroskop in PBS bei RT bilden. Seien Sie sanft beim Sezieren, um sicherzustellen, dass das Arteriengewebe nicht gedehnt oder geschnitten wird. Dieser Schritt ist von entscheidender Bedeutung.
    7. Spülen Sie die Arteriensegmente (bis zu 1 cm lang) in PBS entweder in einer 96-Well-Platte oder in einer 35-mm-Schale kurz ab, um das übrig gebliebene Blut zu entfernen, und legen Sie sie dann 10 min in genügend Cholesterin anreichernde Lösung (in Schritt 1.1) auf, um die gesamten Arteriensegmente abzudecken. Verwenden Sie eine 35-mm-Schale, wenn es eine ausreichende Menge an Cholesterin-anreichernden Lösung und eine 96-Well-Platte, wenn die Arterien klein sind oder wenn es einen Mangel an Cholesterin-anreichernde Lösung.
      HINWEIS: Derselbe Ansatz kann verwendet werden, um andere Gewebe und Zellen mit Cholesterin mit einer Inkubationszeit von 60 min zu bereichern. Zum Beispiel wurde dieser Ansatz zuvor für die Cholesterinanreicherung von Maus-Hirnarterien35,45, Hippocampus-Neuronen32, Vorhof-Myozyten37und HEK 293 Zellen39verwendet. Die minimale Inkubationszeit muss für jeden Gewebe- oder Zelltyp bestimmt werden, basierend auf der Validierung der Cholesterinanreicherung zu verschiedenen Zeitpunkten mit einem cholesterinempfindlichen Assay (z.B. die biochemische Bestimmung der Cholesterinmenge im Gewebe durch Färbung mit dem cholesterinempfindlichen Fluoreszenzfarbstoff filipin).
  3. Färben Sie das Arteriengewebe mit dem Steroid-sensitiven Fluoreszenz Farbstoff filipin, um Veränderungen im Cholesterinspiegel zu bestimmen.
    HINWEIS: Im Abschnitt Repräsentative Ergebnisse zeigen wir die Ergebnisse von zwei Ansätzen zur Bewertung von Veränderungen des Cholesterinspiegels: einem biochemischen Test, der durch die Anwendung eines kommerziell erhältlichen Cholesterinoxidase-basierten Kits durchgeführt wird (siehe Tabelle der Materialien) und Der Färbung mit dem steroidempfindlichen Fluoreszenzfarbstoff Filipin. Der erste Ansatz kann durch Befolgen der Anweisungen des Herstellers durchgeführt werden. Das Protokoll für den letztgenannten Ansatz ist unten aufgeführt.
    1. Mit einer frischen Flasche Filipinpulver eine 10 mg/ml-Stammlösung in Dimethylsulfoxid (DMSO) zubereiten. Dieser Schritt ist von entscheidender Bedeutung.
      HINWEIS: Die resultierende Lösung ist lichtempfindlich. Bei richtiger Vorbereitung ist die filipin Stocklösung gelblich. Etwas filipin Pulver kann auf der Flaschenkappe kleben. Daher ist es wichtig, die Flasche und den Verschluss mit DMSO Lösungsmittel zu spülen, um die gesamte Menge an Filipin zu behalten. Nach der Herstellung muss der filipin eiserne Bestand innerhalb von mehreren Tagen verwendet werden. Filipin verliert seine Fluoreszenzfähigkeit nach 5 Tagen vollständig, selbst wenn es im Dunkeln bei -20 °C gelagert wird.
    2. Entfernen Sie die Arteriensegmente aus der cholesterinanreichernden Lösung und waschen Sie sie 3x mit PBS für 5 min.
    3. Fixieren Sie die Arteriensegmente in 4% Paraformaldehyd für 15 min auf Eis.
      VORSICHT: Paraformaldehyd ist lichtempfindlich. Daher müssen die Arbeiten im Dunkeln durchgeführt werden.
    4. Legen Sie die Arteriensegmente in 0,5% Triton in PBS bei RT für 10 min, um das Gewebe zu permeabilisieren und die Penetration von Farbstoffen zu erleichtern.
    5. Waschen Sie die Arteriensegmente 3x mit PBS für 5 min auf einem Shaker. Dieser Schritt ist von entscheidender Bedeutung.
      HINWEIS: Wenn der Triton vollständig ausgewaschen wurde, sollte es keine Blasen auf der Oberfläche der PBS-Lösung geben.
    6. Verdünnen Sie die filipin Stocklösung in PBS auf eine Endkonzentration von 25 g/ml. Entfernen Sie die Arterien aus der PBS-Lösung und legen Sie sie in die verdünnte filipin Lösung für 1 h im Dunkeln. Dieser Schritt ist von entscheidender Bedeutung.
    7. Waschen Sie den Filipin aus, indem Sie die Arteriensegmente 3x mit PBS für 5 min auf einem Shaker ausspülen. Dieser Schritt ist von entscheidender Bedeutung.
    8. Spülen Sie die Arteriensegmente kurz mit destilliertem Wasser, absorbieren Sie übermäßige Flüssigkeit mit einer Papierserviette und montieren Sie die Arterien mit handelsüblichen Montagemedien auf einem Dia (siehe Tabelle der Materialien).
    9. Bedecken Sie die Arterie mit einem Deckelschlupf, um das Rollen oder Verdrehen der Arterie zu vermeiden, und stellen Sie die Dias in einem dunklen Bereich bei RT für 24 h zum Trocknen auf.
    10. Nachdem das Montagemedium trocknet, die Abdeckungsrutschkanten mit klarem Nagellack versiegeln und den Nagellack 10-15 min trocknen lassen. Die Dias im Dunkeln bei -20 °C lagern.
    11. Stellen Sie die Dias vor der Bildgebung auf RT ab.
    12. Stellen Sie das Gewebe mit einem Fluoreszenzmikroskop oder einem Fluoreszenzleser mit der Anregung simm 340-380 nm und der Emission bei 385-470 nm dar.
      VORSICHT: Filipin Photobleaches schnell; Daher müssen Proben zeitnah abgebildet werden.

2. Anreicherung von Xenopus-Oozyten mit cholesterinangereicherten Phospholipid-basierten Dispersionen (Liposomen)

  1. Vorbereitung von Lösungen
    1. Um eine Vorratslösung von Cholesterin vorzubereiten, lösen Sie 10 mg Cholesterinpulver in 1 ml Chloroform in einem 10 ml Glasbecher oder einer Flasche auf. Übertragen Sie die Lösung in eine 1,5 ml gekappte Glasflasche.
      VORSICHT: In Anbetracht der Toxizität und schnellen Verdunstung von Chloroform, in der Haube arbeiten und Reagenzien auf Eis halten.
    2. Bereiten Sie einen 150 mM KCl, 10 mM Tris-HEPES, pH = 7,4 Puffer für cholesterinangereicherte Phospholipide vor. Um dies zu tun, in einem Erlenmeyerkolben 5,5905 g KCl und 0,6057 g Tris in doppeldestilliertem Wasser auf insgesamt 0,5 l Volumen auflösen. In einem anderen Kolben 5,5905 g KCl und 1,19155 g HEPES in doppeldestilliertem Wasser auf insgesamt 0,5 l Volumen auflösen. Mischen Sie die beiden Lösungen in einem 1 L Erlenmeyer Kolben zusammen und stellen Sie den pH-Wert mit HCl auf 7,4 ein.
      HINWEIS: Bewahren Sie die resultierende 150 mM KCl, 10 mM Tris-HEPES Lösung bei 4 °C auf.
    3. Zur Vorbereitung nd96 vor-mittlerer Eizelle Kultivierung (niedrige K+, low Ca2+) Puffer, kombinieren 1 ml von 2 M KCl, 1 ml von 1 M MgCl2, 45,5 ml von 2 M NaCl, und 5 ml von 1/1 M NaOH-HEPES in einem 1 L Erlenmeyer Kolben. 900 ml doppeldestilliertes Wasser hinzufügen und den pH-Wert mit HCl auf 7,4 einstellen. Die Lösung auf einen 1 L-Zylinder übertragen und das Volumen mit doppeldestilliertem Wasser auf 1 L bringen. Fügen Sie dann 1,8 ml von 1 M CaCl2 hinzu und filtern Sie die Lösung.
      HINWEIS: Leichte Abweichungen in den Verhältnissen zwischen den Komponenten, die zur Herstellung einer ND96-Lösung verwendet werden, scheinen für die Cholesterinanreicherung nicht entscheidend zu sein, möglicherweise weil die ND96-Lösung nicht während des Anreicherungsschritts selbst, sondern zur Lagerung verwendet wird. Ein Beispiel ist eine 1 L-Lösung, die eine etwas niedrigere Konzentration von Natrium- und Chloridionen aufweist und durch die Kombination von 2 ml 1 M KCl, 1 ml 1 M MgCl2, 82,5 ml von 1 M NaCl, 5 ml 1 M HEPES und 1,8 ml 1 M CaCl2 (Ca2+ wird weggelassen, um eine Ca2+ freie Lösung zu erhalten) hergestellt wird. Stellen Sie den pH-Wert der Lösung mit NaOH auf 7,4 ein. Bewahren Sie die resultierende ND96-Eizellen-Kultivierungslösung bis zu 1 Monat bei 4 °C auf.
  2. Herstellung der Phospholipid-basierten Dispersion mit Cholesterin-Liposomen
    1. Kombinieren Sie in einem 12 ml Glasrohr jeweils 200 l der folgenden 10 mg/ml chloroformgelösten Lipidlösungen: L-Phosphatidylethanolamin, 1-Palmitoyl-2-Oleoyl-Sn-Glycero-3-Phospho-l-Serin und Cholesterin.
    2. Verdampfen Sie die Chloroform in der Haube, um langsam unter einem Stickstoffstrom zu trocknen. Dieser Schritt ist von entscheidender Bedeutung.
    3. Die Lipide in 800 l gepufferter Lösung, bestehend aus 150 mM KCl und 10 mM Tris-HEPES bei pH = 7,4, aufsetzen und mit Paraffinfolie abdecken.
    4. 10 min lang sanft bei 80 kHz beschallen, bis sich eine milchige Mischung bildet. Dieser Schritt ist von entscheidender Bedeutung.
      VORSICHT: Beim Beschallen sollte die Dispersion im Glasrohr sanft vibrieren und kleine Wellen bilden. Dispersionstropfen sollten nicht innerhalb des Rohres springen.
  3. Xenopus-Oozyten mit Cholesterin anreichern
    HINWEIS: Frosch-Oozyten-haltige Eierstöcke können aus zwei Quellen bezogen werden: Erstens können Xenopus laevis weibliche Frösche zum Zwecke der hausinternen Chirurgie untergebracht werden. Dieses Verfahren muss vom Institutionellen Ausschuss für Tierpflege und -nutzung genehmigt werden. Zweitens können ganze Eierstöcke bei kommerziellen Lieferanten erworben werden. Als Alternative zum Kauf oder der Isolierung ganzer Eierstöcke und deren anschließende Verdauung, wie in den Schritten 2.3.1-2.3.4 beschrieben, sind einzelne Eizellen kommerziell erhältlich. Wenn letztere verwendet werden, können die Schritte 2.3.1-2.3.4 übersprungen werden.
    1. Bewahren Sie die frisch erhaltenen Eierstöcke bei 14 °C in einer ND96-Lösung auf. Unter diesen Bedingungen können die Eierstöcke bis zu 1 Woche gelagert werden.
    2. Um einzelne Eizellen zu erhalten, stören Sie den Eierstocksack an mehreren Stellen mit scharfen Zangen. Legen Sie die Eierstöcke in eine 60 mm Platte, mit 5 ml Ca2+-frei ND96 ergänzt mit 0,5 mg/ml Kollagenase. Schütteln Sie auf einem Orbital-Shaker bei 60 Schwingungen/min für 15 min bei RT.
      HINWEIS: Dieser Schritt wird die Verdauung des Eierstocksacks sicherstellen. Um die enzymatische Aktivität zu erhalten, vermeiden Sie die Lagerung von Kollagennase, die ND96 enthält, über einen längeren Zeitraum (>1 h). Auch eine kurze Lagerung sollte bei kühlen Temperaturen unter 15 °C erfolgen.
    3. Mit einer Transferpipette mit breiter Spitze, kräftig Pipetten die Eizelle-haltige Lösung nach oben und unten ca. 5-10x, um einzelne Eizellen zu trennen. In diesem Schritt wird die Lösung dunkel.
    4. Spülen Sie die Eizellen schnell mit Ca2+-free ND96, bis die Lösung transparent wird.
    5. Übertragen Sie einzelne Eizellen auf Ca2+-haltige ND-96 Lösung, ergänzt mit 2 mg/ml Gentamicin mit einer Transferpipette mit einer schmalen Spitze.
      HINWEIS: Dieser Schritt ist wichtig, wenn es notwendig ist, die Eizellen zu speichern. Einzelne Eizellen können mehrere Tage bei 14-17 °C in einem Inkubator gelagert werden. Tote Eizellen, die weißlich sind, müssen jedoch mindestens einmal täglich entfernt werden, um eine Kontamination der Lösung mit giftigen Chemikalien zu vermeiden.
    6. Übertragen Sie 90 l der cholesterinangereicherten Phospholipid-basierten Dispersion in einen Brunnen einer 96-Well-Platte.
    7. Übertragen Sie bis zu sechs Eizellen vom ND96 Medium in den Brunnen mit so wenig Medium wie möglich. Dieser Schritt ist von entscheidender Bedeutung.
      VORSICHT: Setzen Sie die Eizellen während des Transfers nicht der Luft aus, um die Eizellen intakt zu halten.
    8. Platzieren Sie die 96-Well-Platte auf einem dreidimensionalen Plattformrotator, um eine kleine Orbitalbewegung zu den Eizellen in der Zelle für 5-10 min zu liefern.
    9. Fügen Sie einen Tropfen ND96 in den Brunnen und übertragen Sie die cholesterinangereicherten Eizellen von der 96 Well Platte auf eine 35 mm Platte mit ND96 für den sofortigen Gebrauch. Dieser Schritt ist von entscheidender Bedeutung.
    10. Verwenden Sie ein handelsübliches Cholesterinoxidase-basiertes Kit (siehe Tabelle der Materialien), um Veränderungen des Cholesterinspiegels zu bewerten, indem Sie den Anweisungen des Herstellers folgen.

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Ergebnisse

Die Verwendung von mit Cholesterin gesättigtem Cyclodextrin als Mittel zur Anreicherung von Geweben und Zellen mit Cholesterin ist etabliert. Hier zeigen wir zunächst die Anwendung dieses weit verbreiteten Ansatzes zur Anreicherung von Rattenhirnarterien mit Cholesterin unter Verwendung von mit Cholesterin gesättigtem M-CD. Abbildung 1zeigt ein Beispiel für eine abgebildete zerebrale Arterie glatte Muskelschicht und zeigt die konzentratio...

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Diskussion

Methoden zur Anreicherung von Säugetiergeweben und -zellen und Xenopus-Oozyten mit Cholesterin bilden ein wirksames Werkzeug zur Untersuchung der Auswirkungen erhöhter Cholesterinwerte auf einzelne molekulare Arten, auf komplexe makromolekulare Systeme (z. B. Proteine) und auf die Zell- und Organfunktion. In diesem Beitrag haben wir zwei komplementäre Ansätze beschrieben, die solche Studien erleichtern. Zuerst beschrieben wir, wie Gewebe und Zellen mit Cholesterin angereichert werden, indem wir mit Cholester...

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Offenlegungen

Dr. A. M. Dopico ist ein sonderbeschäftigter, Teilzeit-Bundesangestellter und derzeitiges Mitglied des Nationalen Beirats für Alkoholmissbrauch und Alkoholismus.

Danksagungen

Diese Arbeit wurde durch einen Scientist Development Grant (11SDG5190025) der American Heart Association (zu A.R.-D.) und durch das National Institute of Health R01 Zuschüsse AA-023764 (bis A.N.B.) und HL-104631 und R37 AA-11560 (bis A.M.D.) unterstützt.

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Materialien

NameCompanyCatalog NumberComments
Amplex Red Cholesterol Assay KitInvitrogenA12216
Pierce BCA Protein Assay KitThermo Scientific23225
Pre-Diluted Protein Assay Standards BSA setThermo Scientific23208
Brain PE 25Mg in ChloroformAvanti Lipids840022C
16:0-18:1 PS 25Mg ChloroformAvanti Lipids840034C
Cholesterol 100Mg PowderSigmaC8667
KClFisherP217
Trizma baseSigmaT6066
HEPESCorning61-034-RO
MgCl2FisherM33
NaClFisherS271
KH2PO4FisherP285
MgSO4EMD ChemicalsMX0070-1
EDTAVWRE177
Dextrose AnhydrousFisherBP350
NaHCO3SigmaS6014
CaCl2SigmaC3881
Blood Gas TanknexAir
NaOHFisherS318
1.5mL tubesFisherS35818
Gastight Syringe 100uLHamilton1710
Microliter Syringe 25uLHamilton702
12 mL heavy duty conical centrifuge beaded rim tubePyrex8120-12
ChloroformFisherC298
Support StandHomescience ToolsCE-STAN5X8
Universal Clamp, 3-ProngHomescience ToolsCE-CLPUNIV
SonicatorLaboratory SuppliesG112SP1G
3D rotator mixerBenchmark ScientificB3D 1308
96 well plateSigmaBR781602
N2 gasnexAir
Glass beakers 40ml-1LFisher02-540
Ice MachineScotsmanCU1526MA-1
Ice bucketFisher50-136-7764
1X PBSCorning21-031-CM
TritonXFisherBP151-100
Sonic DismembratorFisherModel 100
Eppendorf microcentrifugeEppendorfModel 5417R
Amber bottlesFisher03-251-420
Corning™ Disposable Glass Pasteur PipetsFIsher13-678-4A
ParafilmFIsher50-998-944
Isotemp™ BOD Refrigerated IncubatorFIsher97-990E
OocytesXenoocyte™10005
RatEnvigoSprague Dawleyweight 250g
Methyl-β-cyclodextrinSigmaC4555
Water bath incubator with shakerPrecision51221080Lowest shaker setting O/N 37 °C
FilipinSigmaSAE0088-1ML
DMSOFisherBP231
Paraformaldehyde 4%Mallinckrodt2621
DI H2OUniversity DI source
ProLong Gold antifade reagnetInvitrogenP10144
Microslides 75x25mm FrostedDiaggerG15978A
ForcepsFine Science Tools11255-20
Microscope CoverslipDiaggerG15972B
Clear nail polishRevlon771 Clear
Labeling TapeFisher15-901-20F
Securline Lab Marker IISigmaZ648205-5EA
BD 10mL SyringeFisher14-823-16E
1.2 μm syringe filterVWR28150-958
KimWipesFisher06-666A
pH probeSartoruspy-p112s
pH meterDenver instrumentModel 225
70% ETOHPharmco211USP/NF
TimerFisher02-261-840
Steno bookStaples163485

Referenzen

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