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Résumé

Deux méthodes d’enrichissement du cholestérol sont présentées : l’application de cyclodextrine saturée de cholestérol pour enrichir les tissus et les cellules des mammifères, et l’utilisation de dispersions à base de phospholipides enrichies de cholestérol (liposomes) pour enrichir les oocytes Xenopus. Ces méthodes sont instrumentales pour déterminer l’impact des niveaux élevés de cholestérol dans la fonction moléculaire, cellulaire, et d’organe.

Résumé

L’enrichissement du cholestérol des tissus et des cellules des mammifères, y compris les oocytes Xenopus utilisés pour étudier la fonction cellulaire, peut être accompli en utilisant une variété de méthodes. Ici, nous décrivons deux approches importantes utilisées à cette fin. Tout d’abord, nous décrivons comment enrichir les tissus et les cellules avec du cholestérol à l’aide de cyclodextrine saturée de cholestérol à l’aide d’artères cérébrales (tissus) et de neurones hippocampiques (cellules) à titre d’exemples. Cette approche peut être utilisée pour n’importe quel type de tissu, cellules ou lignées cellulaires. Une approche alternative pour l’enrichissement du cholestérol implique l’utilisation de lipoprotéines de faible densité (LDL). L’avantage de cette approche est qu’elle utilise une partie de la machinerie naturelle d’homéostasie de cholestérol de la cellule. Cependant, alors que l’approche de la cyclodextrine peut être appliquée pour enrichir n’importe quel type d’intérêt cellulaire avec le cholestérol, l’approche LDL est limitée aux cellules qui expriment les récepteurs LDL (par exemple, les cellules hépatiques, les cellules dérivées de la moelle osseuse telles que les leucocytes sanguins et les macrophages tissulaires), et le niveau d’enrichissement dépend de la concentration et de la mobilité du récepteur LDL. En outre, les particules de LDL incluent d’autres lipides, ainsi l’accouchement de cholestérol est non spécifique. Deuxièmement, nous décrivons comment enrichir les oocytes Xenopus avec du cholestérol à l’aide d’une dispersion à base de phospholipid (c.-à-d. liposomes) qui comprend le cholestérol. Les ocytes Xenopus constituent un système d’expression hétérologue populaire utilisé pour étudier la fonction cellulaire et protéique. Pour l’approche d’enrichissement du cholestérol à base de cyclodextrine du tissu mammifère (artères cérébrales) et pour l’approche d’enrichissement du cholestérol à base de phospholipid des oocytes Xenopus, nous démontrons que les niveaux de cholestérol atteignent un maximum après 5 min d’incubation. Ce taux de cholestérol demeure constant pendant les périodes prolongées d’incubation (p. ex., 60 min). Ensemble, ces données fournissent la base pour des conditions temporelles optimisées pour l’enrichissement de cholestérol des tissus, des cellules, et des oocytes de Xénoopus pour des études fonctionnelles visant à interroger l’impact de l’enrichissement de cholestérol.

Introduction

Le cholestérol, un lipide cellulaire majeur, joue de nombreux rôles fonctionnels et structurels critiques1,2,3,4,5,6,7,8,9. De la régulation des propriétés physiques de la membrane plasmatique à assurer la viabilité cellulaire, la croissance, la prolifération, et servant de molécule de signalisation et de précurseur dans une pléthore de voies biochimiques, le cholestérol est un composant impératif nécessaire pour la fonction normale de cellules et d’organes. En conséquence, l’insuffisance de cholestérol a comme conséquence des malformations physiques graves et une série de désordres. D’autre part, même une petite augmentation du cholestérol au-dessus des niveaux physiologiques (2-3x) est cytotoxique1,2,10 et a été associée au développement de troubles, y compris cardio-vasculaire11,12,13 et les maladies neurodégénératives14,15,16,17. Ainsi, pour interroger les fonctions critiques du cholestérol et pour déterminer l’effet des changements dans les niveaux de cholestérol, différentes approches qui modifient la teneur en cholestérol dans les tissus, les cellules et les oocytes Xénoopeus ont été développées.

Modification des taux de cholestérol dans les tissus et les cellules des mammifères
Plusieurs approches peuvent être exploitées pour diminuer les niveaux de cholestérol dans les tissus et les cellules18. Une approche implique leur exposition aux statines dissoutes dans le sérum lipoprotéine-déficiente pour inhiber la réductase de HMG-CoA, qui contrôle le taux de synthèse de cholestérol19,20. Cependant, ces médicaments abaissant le cholestérol inhibent également la formation des produits non-sterol le long de la voie de mévalonate. Par conséquent, une petite quantité de mévalonate est ajoutée pour permettre la formation de ces produits21 et d’améliorer la spécificité de cette approche. Une autre approche pour réduire le taux de cholestérol implique l’utilisation de 'cyclodextrines. Ces monomers de glucopyranose possèdent une cavité hydrophobe interne avec un diamètre qui correspond à la taille des stérols22, ce qui facilite l’extraction du cholestérol des cellules, les appauvrissant ainsi de leur teneur en cholestérol indigène23. Un exemple est 2-hydroxypropyl-----cyclodextrine (HP-CD), un médicament préclinique actuellement testé pour le traitement de la maladie de type C Niemann-Pick, un trouble métabolique mortel héréditaire génétiquement héréditaire caractérisé par le stockage lysosomal de cholestérol24. Le niveau d’épuisement du cholestérol dépend du dérivé spécifique utilisé. Par exemple, HP-CD extrait le cholestérol avec une capacité inférieure au dérivé méthylé, méthyle--cyclodextrine (M-CD)24,25,26,27,28,29,30. Notamment, cependant, les cyclodextrines peuvent également extraire d’autres molécules hydrophobes en plus du cholestérol, ce qui peut alors entraîner des effets non spécifiques31. Contrairement à l’épuisement, les cellules et les tissus peuvent être spécifiquement enrichis avec le cholestérol par le traitement avec la cyclodextrine qui a été présaturée avec le cholestérol23. Cette approche peut également être utilisée comme un contrôle de la spécificité des cyclodextrines utilisées pour l’épuisement du cholestérol31. L’épuisement du cholestérol des tissus et des cellules est simple et peut être réalisé en exposant les cellules de 30 à 60 min à 5 mM M-CD dissous dans le milieu utilisé pour stocker les cellules. Cette approche peut entraîner une diminution de 50% de la teneur en cholestérol (par exemple, dans les neurones hippocampal32, les artères cérébrales rat33). D’autre part, la préparation du complexe de l’enrichissement du cholestérol et du cholestérol est plus complexe et sera décrite dans la section du protocole.

Une approche alternative à l’enrichissement des tissus et des cellules à l’aide de la cyclodextrine saturée de cholestérol implique l’utilisation de LDL, qui repose sur les récepteurs LDL exprimés dans les tissus / cellules18. Bien que cette approche offre l’avantage d’utiliser la machinerie naturelle d’homéostasie de cholestérol de la cellule, elle a plusieurs limites. Tout d’abord, les tissus et les cellules qui n’expriment pas le récepteur LDL ne peuvent pas être enrichis en utilisant cette approche. Deuxièmement, les particules LDL contiennent d’autres lipides en plus du cholestérol. Plus précisément, LDL est composé de la protéine ApoB100 (25%) et les lipides suivants (75 %) : 6 à 8 % de cholestérol, 45 à 50 % d’ester de cholestéle, 18 à 24 % de phospholipides et 4 à 8 % de triacylglycerols34. Ainsi, l’administration du cholestérol via les particules LDL n’est pas spécifique. Troisièmement, le pourcentage d’augmentation de la teneur en cholestérol par LDL dans les tissus et les cellules qui expriment le récepteur LDL peut être significativement inférieur à l’augmentation observée à l’aide de cyclodextrine saturée de cholestérol. Par exemple, dans une étude précédente, l’enrichissement des artères cérébrales rongeurs avec le cholestérol par l’intermédiaire de LDL a eu comme conséquence seulement une augmentation de 10-15% des niveaux de cholestérol35. En revanche, l’enrichissement de ces artères avec la cyclodextrine saturée de cholestérol tel que décrit dans la section du protocole a entraîné une augmentation de la teneur en cholestérol de 50 % (Voir la section des résultats représentatifs, figure 1).

Modification des taux de cholestérol chez les oocytes Xenopus
Les ocytes Xénoopeus constituent un système d’expression hétérologue couramment utilisé pour étudier la fonction cellulaire et protéique. Des études antérieures ont montré que le taux de cholestérol à la molaire phospholipide chez les oocytes Xenopus est de 0,5 à 0,136. En raison de ce niveau intrinsèque élevé de cholestérol, l’augmentation de la teneur en cholestérol dans ce système est difficile, mais peut être atteint en utilisant des dispersions faites à partir de phospholipides membranaires et le cholestérol. Les phospholipides que nous avons choisis à cette fin sont similaires à ceux utilisés pour former des bilayers de lipides planaires artificiels et comprennent L-phosphatidylethanolamine (POPE) et 1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phospho-l-serine (POPS), tel que décrit dans la section du protocole. Cette approche peut entraîner une augmentation de la teneur en cholestérol de 50 % (voir la section des résultats représentatifs, figure 2).

Une approche alternative à l’enrichissement des oocytes Xenopus avec des dispersions à base de phospholipid implique l’utilisation de cyclodextrine saturée de cholestérol, qui est similaire à la façon dont les tissus et les cellules sont enrichis. Cependant, nous avons constaté que cette approche était de faible reproductibilité et d’efficacité, avec une augmentation moyenne de 25 % de la teneur en cholestérol. Cela est peut-être dû à la capacité de chargement différente de ces deux approches (voir la section des résultats représentatifs, figure 3). En revanche, il a été démontré que l’utilisation de cyclodextrine pour épuiser le cholestérol des oocytes Xenopus peut entraîner une diminution de 40% de la teneur en cholestérol36.

Ici, nous nous concentrons sur l’enrichissement du cholestérol des tissus et des cellules de mammifères par l’application de cyclodextrine saturée de cholestérol, et des oocytes Xenopus utilisant des liposomes. Les deux approches peuvent être exploitées pour délimiter l’effet de l’augmentation des niveaux de cholestérol sur la fonction protéique. Les mécanismes de modulation de cholestérol de la fonction protéique peuvent impliquer des interactions directes8 et/ou des effets indirects9. Lorsque le cholestérol affecte la fonction protéique par le biais d’interactions directes, l’effet d’une augmentation du taux de cholestérol sur l’activité protéique est probablement indépendant du type cellulaire, du système d’expression ou de l’approche d’enrichissement. Par exemple, nous avons utilisé ces deux approches pour déterminer l’effet du cholestérol sur les canaux de potassium rectifiant intérieurement (GIRK) de G-protéine (GIRK) exprimés dans les myocytes auriculaires37, neurones hippocampiques32,38, HEK29339 cellules, et Oocytes Xenopus 32,37. Les résultats obtenus dans ces études étaient cohérents : dans les trois types de cellules de mammifères et dans les oocytes amphibiens, le cholestérol a augmenté la fonction du canal GIRK (voir la section des résultats représentatifs, figure 4, pour les neurones hippocampiques et les expériences correspondantes dans les oocytes Xenopus). En outre, les observations faites dans ces études étaient également compatibles avec les résultats des études menées dans les myocytes auriculaires37,40 et neurones hippocampiques32,38 fraîchement isolés des animaux soumis à un régime à taux de cholestérol élevé40. Notamment, l’enrichissement du cholestérol des neurones hippocampal à l’aide de M -CD a inversé l’effet de la thérapie d’atorvastatine utilisée pour répondre à l’impact de l’alimentation à taux élevé de cholestérol à la fois sur les niveaux de cholestérol et la fonction GIRK38. Dans d’autres études, nous avons étudié l’effet des mutations sur la sensibilité au cholestérol du canal de potassium rectifiant intérieurement Kir2.1 utilisant les ocytes Xenopus et les cellules HEK29341. Encore une fois, l’effet des mutations sur la sensibilité du canal était similaire dans les deux systèmes.

Les applications des deux méthodes d’enrichissement pour déterminer l’impact des niveaux élevés de cholestérol sur la fonction moléculaire, cellulaire et d’organe sont nombreuses. En particulier, l’utilisation de complexes cyclodextrine-cholestérol pour enrichir les cellules et les tissus est très fréquente en grande partie en raison de sa spécificité. Des exemples récents de cette approche incluent la détermination de l’impact du cholestérol sur l’activation du canal HERG et les mécanismes sous-jacents42, la découverte que le cholestérol active le récepteur couplé à la protéine G Smoothened pour promouvoir la signalisation hérisson43, et l’identification du rôle du cholestérol dans la biomécanique des cellules souches et l’adipogenèse par les protéines linker associées à la membrane44. Dans nos propres travaux, nous avons utilisé l’enrichissement des tissus mammifères avec le complexe de cholestérol M-CD: pour étudier l’effet de l’enrichissement du cholestérol sur la fonction de base et le profil pharmacologique des canaux de grande conductance de calcium et de tension (BK, MaxiK) dans le muscle lisse vasculaire35,45,46. Dans d’autres études, nous avons utilisé l’approche de dispersion à base de phospholipid pour enrichir les oocytes Xenopus avec du cholestérol pour déterminer les rôles des différentes régions dans les canaux Kir2.1 et GIRK dans la sensibilité au cholestérol41,47,48,49, ainsi que pour déterminer les sites de liaison de cholestérol putatif dans ces canaux32,50,51.

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Protocole

Toutes les procédures expérimentales avec des animaux ont été effectuées à l’Université du Tennessee Health Science Center (UTHSC). Les soins aux animaux et les protocoles expérimentaux ont été examinés et approuvés par le Comité de soins et d’utilisation des animaux de l’UTHSC, qui est une institution accréditée par l’Association for Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Care International.

1. Enrichissement des tissus et des cellules à l’aide de méthyle-cyclodextrine saturée de cholestérol

REMARQUE : Le protocole d’enrichissement du cholestérol ci-dessous convient aux tissus, aux cellules et aux lignées cellulaires. À titre d’exemple, nous décrivons les étapes réalisées pour enrichir les artères cérébrales des mammifères. Des résultats représentatifs sont fournis pour les artères cérébrales(figure 1) et les neurones(figure 4).

  1. Préparation de la M-CD saturée de cholestérol
    1. Pesez 0,064 g de M-CD et dissolvez-le dans un flacon contenant 10 ml de solution saline tamponnée par le phosphate (PBS) pour obtenir une concentration finale de 5 mM M-CD. Remuer la solution avec une barre de remuer pour s’assurer que le M-CD est entièrement dissous.
    2. Pesez 0,0024 g de poudre de cholestérol et ajoutez-la au même flacon pour obtenir une concentration de 0,63 mM de cholestérol. Ensuite, remuer la solution vigoureusement. Utilisez une spatule pour briser autant de morceaux de cholestérol que possible (certains morceaux resteront jusqu’à l’incubation).
    3. Couvrir le flacon d’au moins deux couches de film de paraffine et secouer lentement (30 oscillations/min) dans un bain d’eau de 37 oC pendant la nuit. Cette étape est essentielle.
    4. Après 8-16 h, refroidir la solution à température ambiante (RT), puis filtrer à travers un filtre de seringue en polyethersulfone de 0,22 m dans une bouteille en verre.
      REMARQUE : Pour atteindre différentes concentrations de cholestérol en solution, ajustez les quantités de cholestérol et de M-CD par proportion simple. Il est important de maintenir le rapport molaire de M-CD: cholestérol à 8:1 pour obtenir la saturation du porteur de méthyle-cyclodextrine avec le cholestérol. La solution d’enrichissement du cholestérol peut être utilisée immédiatement ou pendant plusieurs jours si elle est stockée à 4 oC. Cependant, la capacité d’enrichissement du cholestérol diminue avec le temps à mesure que les agrégats de cholestérol apparaissent, et la solution devient trouble.
  2. Traitement des artères cérébrales avec M-CD saturé de cholestérol
    1. Euthanifiez un rat Sprague Dawley (250-300 g) en le plaçant dans une chambre avec 2% d’isoflurane. Ensuite, décapiter le rat anesthésié à l’aide d’une guillotine forte ou d’une grande paire de ciseaux pointus.
      REMARQUE : Si l’exécution de ces procédures régulièrement, il est utile d’élaborer un calendrier pour l’affûtage de guillotine. En outre, une paire séparée de ciseaux devrait être dédiée à la décapitation des rongeurs. La décapitation des rongeurs est une procédure terminale; par conséquent, les instruments n’ont pas besoin d’être stériles. Le nettoyage avec de l’eau savonneuse après chaque utilisation est suffisant.
    2. Placez la tête du rat vers l’avant, loin du chercheur. Placez la partie pointue d’une paire de ciseaux de taille moyenne entre le crâne et le tronc cérébral, et coupez latéralement des deux côtés.
    3. Utilisez des forceps pour ouvrir le crâne supérieur en tirant vers le haut sur la base du crâne où les coupures latérales ont été faites et enlevez soigneusement le cerveau. Assurez-vous de couper les nerfs optiques qui tiennent le cerveau dans le crâne.
    4. Mettez le cerveau dans un bécher avec PBS sur la glace après l’enlèvement.
      REMARQUE : Le cerveau peut être stocké sur la glace pendant 4-6 h à 4 oC.
    5. Dans un environnement non stérile transférer le cerveau de rat dans un bol de dissection ciré avec assez de PBS pour le submerger. Épinglez le cerveau vers le bas pour l’empêcher de bouger.
      REMARQUE : L’étape 1.2.5 peut être effectuée à RT si elle est exécutée rapidement. Sinon, il faut le faire sur la glace.
    6. Utilisez des forceps pointus et de petits ciseaux chirurgicaux pour disséquer les artères cérébrales et leurs branches qui forment le Cercle de Willis à la base du cerveau sous le microscope dans PBS à RT. Soyez doux lors de la dissection pour s’assurer que le tissu d’artère n’est pas étiré ou coupé. Cette étape est essentielle.
    7. Rincer brièvement les segments d’artère (jusqu’à 1 cm de long) dans PBS soit dans une assiette de 96 puits ou dans un plat de 35 mm pour enlever les restes de sang, puis les placer pendant 10 min dans la solution suffisamment enrichie de cholestérol (préparée à l’étape 1.1) pour couvrir les segments entiers de l’artère. Utilisez un plat de 35 mm s’il existe une quantité suffisante de solution enrichissante du cholestérol et une assiette de puits de 96 si les artères sont petites ou s’il y a une pénurie de solution enrichissante du cholestérol.
      REMARQUE : La même approche peut être utilisée pour enrichir d’autres tissus et cellules avec le cholestérol en utilisant un temps d’incubation de 60 min. Par exemple, cette approche a été précédemment utilisée pour l’enrichissement du cholestérol des artères cérébrales de souris35,45, neurones hippocampal32, myocytes auriculaires37, et HEK 293 cellules39. Le temps minimal d’incubation doit être déterminé pour chaque tissu ou type cellulaire basé sur la validation de l’enrichissement du cholestérol à différents moments avec un essai sensible au cholestérol (par exemple, la détermination biochimique de la quantité de cholestérol dans le tissu en tachant avec le cholestérol sensible à la fluorescence dye filipin).
  3. Tacher le tissu d’artère avec le filipin de colorant de fluorescence stéroïde-sensible pour déterminer n’importe quelles altérations dans les niveaux de cholestérol.
    REMARQUE : Dans la section résultats représentatifs, nous démontrons les résultats de deux approches pour évaluer les changements dans les niveaux de cholestérol : un essai biochimique effectué par l’application d’un kit à base d’oxidase de cholestérol disponible dans le commerce (voir tableau des matériaux) et la coloration avec le colorant de fluorescence sensible aux stéroïdes. La première approche peut être effectuée en suivant les instructions du fabricant. Le protocole de cette dernière approche est fourni ci-dessous.
    1. À l’aide d’une bouteille de poudre de filipin fraîche, préparez une solution de stock de 10 mg/mL dans du sulfoxide de diméthyle (DMSO). Cette étape est essentielle.
      REMARQUE : La solution qui en résulte est sensible à la lumière. Si elle est préparée correctement, la solution de stock filipin est jaunâtre. Une certaine poudre de filipin peut coller au bouchon de bouteille. Par conséquent, il est important de rincer la bouteille et le bouchon avec du solvant DMSO pour conserver la totalité de la quantité de filipin. Une fois préparé, le stock de filipin doit être utilisé dans les quelques jours. Filipin perd complètement sa capacité de fluorescence après 5 jours, même lorsqu’il est stocké dans l’obscurité à -20 oC.
    2. Retirez les segments d’artère de la solution enrichissante du cholestérol et lavez-les 3x avec PBS pendant 5 min.
    3. Fixer les segments d’artère dans 4% de paraformaldéhyde pendant 15 minutes sur la glace.
      CAUTION : Le paraformaldéhyde est sensible à la lumière. Par conséquent, le travail doit être effectué dans l’obscurité.
    4. Placez les segments d’artère dans 0.5% Triton dans PBS à RT pendant 10 min pour perméabiliser le tissu et faciliter la pénétration de teinture.
    5. Laver les segments d’artère 3x avec PBS pendant 5 minutes sur un shaker. Cette étape est essentielle.
      REMARQUE: Lorsque le Triton a été complètement lavé, il ne devrait pas y avoir de bulles à la surface de la solution PBS.
    6. Diluer la solution de stock filipin dans PBS à une concentration finale de 25 g/mL. Retirez les artères forment la solution PBS et placez-les dans la solution filipin diluée pendant 1 h dans l’obscurité. Cette étape est essentielle.
    7. Laver le filipin en rinçant les segments d’artère 3x avec PBS pendant 5 min sur un shaker. Cette étape est essentielle.
    8. Rincer brièvement les segments d’artère avec de l’eau distillée, absorber le liquide excessif avec une serviette en papier, et monter les artères sur une diapositive à l’aide de supports de montage disponibles dans le commerce (voir Tableau des matériaux).
    9. Couvrez l’artère d’un coverlip évitant le roulement ou la torsion de l’artère et placez les toboggans à sécher dans une zone sombre à RT pendant 24 h.
    10. Après que le milieu de montage sèche, scellez les bords de housse avec du vernis à ongles clair, et laissez le vernis à ongles sécher pendant 10-15 min. Conserver les toboggans dans l’obscurité à -20 oC.
    11. Équilibrez les diapositives à RT avant l’imagerie.
    12. Imagez le tissu avec un microscope à fluorescence ou un lecteur de fluorescence avec l’excitation réglée à 340-380 nm et émission à 385-470 nm.
      CAUTION: Filipin photobleaches rapidement; ainsi, les échantillons doivent être photographiés rapidement.

2. Enrichissement des oocytes Xenopus à l’aide de dispersions à base de phospholipid enrichies de cholestérol (liposomes)

  1. Préparation des solutions
    1. Pour préparer une solution de bouillon de cholestérol, dissoudre 10 mg de poudre de cholestérol dans 1 ml de chloroforme dans un bécher ou une bouteille de verre de 10 ml. Transférer la solution dans une bouteille en verre plafonnée de 1,5 ml.
      CAUTION : Compte tenu de la toxicité et de l’évaporation rapide du chloroforme, travaillez dans le capot et gardez les réactifs sur la glace.
    2. Préparer un KCl de 150 mM, 10 mM Tris-HEPES, pH et 7,4 tampons pour les phospholipides enrichis de cholestérol. Pour ce faire, dissoudre dans un flacon Erlenmeyer 5,5905 g de KCl et 0,6057 g de Tris dans de l’eau à double distillation à un volume total de 0,5 L. Dans un autre flacon, dissoudre 5,5905 g de KCl et 1,19155 g de HEPES dans de l’eau à double distillation à un volume total de 0,5 L. Mélanger les deux solutions dans un flacon 1 L Erlenmeyer, et ajuster le pH à 7,4 avec HCl.
      REMARQUE : Conservez la solution KCl de 150 mM, 10 mM Tris-HEPES à 4 oC.
    3. Pour préparer le culte de l’oocyte pré-moyen ND96 (faible K,faible Ca2 ') tampon, combiner 1 mL de 2 M KCl, 1 mL de 1 M MgCl2, 45,5 mL de 2 M NaCl, et 5 mL de 1/1 M NaOH-HEPES dans un flacon 1 L Erlenmeyer. Ajouter 900 ml d’eau à double distillation et ajuster le pH à 7,4 avec HCl. Transférer la solution à un cylindre de 1 L et porter le volume à 1 L avec de l’eau à double distillation. Ajouter ensuite 1,8 mL de 1 M CaCl2 et filtrer la solution.
      REMARQUE : De légères variations des ratios entre les composants utilisés pour fabriquer une solution ND96 ne semblent pas être essentielles pour l’enrichissement du cholestérol, peut-être parce que la solution ND96 n’est pas utilisée pendant l’étape d’enrichissement elle-même, mais pour le stockage. Un exemple est une solution de 1 L qui a une concentration légèrement plus faible d’ions de sodium et de chlorure, et est fait en combinant 2 mL de 1 M KCl, 1 mL de 1 M MgCl2, 82,5 ml de 1 M NaCl, 5 mL de 1 M HEPES, et 1,8 mL de 1 M CaCl2 (Ca2 est omis d’obtenir une solution libre Ca2). Ajuster le pH de la solution à 7,4 avec NaOH. Conservez la solution de culturation d’oocyte ND96 qui en résulte à 4 oC pour un mois.
  2. Préparation de la dispersion à base de phospholipides avec des liposomes de cholestérol
    1. Dans un tube en verre de 12 ml, combiner 200 lils de chacune des solutions lipidiques dissoutes par chloroforme de 10 mg/mL suivantes : L-phosphatidylethanolamine, 1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phospho-l-serine, et le cholestérol.
    2. Évaporer le chloroforme du capot pour sécher lentement sous un flux d’azote. Cette étape est essentielle.
    3. Suspendre les lipides dans 800 l de solution tampon composée de 150 mM KCl et 10 mM Tris-HEPES à pH 7,4, et couvrir avec le film de paraffine.
    4. Sonicate doucement à 80 kHz pendant 10 min jusqu’à ce qu’un mélange laiteux soit formé. Cette étape est essentielle.
      AVERTISSEMENT : Lorsque vous sonicez, la dispersion dans le tube de verre doit vibrer doucement, formant de petites vagues. Les gouttes de dispersion ne doivent pas sauter dans le tube.
  3. Enrichir les ocytes Xenopus avec du cholestérol
    REMARQUE : Les ovaires oocytes de grenouille peuvent être obtenus à partir de deux sources : premièrement, les grenouilles femelles Xenopus laevis peuvent être logées dans le but de la chirurgie interne. Cette procédure doit être approuvée par le Comité institutionnel de soins et d’utilisation des animaux. Deuxièmement, des ovaires entiers peuvent être achetés auprès de fournisseurs commerciaux. Comme alternative à l’achat ou l’isolement des ovaires entiers, puis les digérer comme décrit dans les étapes 2.3.1-2.3.4, oïts individuels sont disponibles dans le commerce à l’achat. Si ces derniers sont utilisés, les étapes 2.3.1-2.3.4 peuvent être ignorées.
    1. Gardez les ovaires fraîchement obtenus à 14 oC dans une solution ND96. Dans ces conditions, les ovaires peuvent être stockés jusqu’à 1 semaine.
    2. Pour obtenir des ocytes individuels, perturbez le sac ovare à plusieurs endroits à l’aide de forceps pointus. Placer les morceaux d’ovaire dans une plaque de 60 mm, avec 5 ml de ND96 sans Ca2MDcomplété par un collagenase de 0,5 mg/mL. Secouez sur un shaker orbital à 60 oscillations/min pendant 15 min à RT.
      REMARQUE : Cette étape assurera la digestion du sac ovare. Pour préserver l’activité enzymatique, évitez de stocker le collagène contenant ND96 pendant de longues périodes de temps ( 1 h). Même un stockage bref doit être effectué à des températures fraîches inférieures à 15 oC.
    3. À l’aide d’une pipette de transfert avec une large pointe, pipette vigoureusement la solution contenant de l’oocyte de haut en bas d’environ 5-10x pour séparer les oocytes individuels. À cette étape, la solution deviendra sombre.
    4. Rincer rapidement les ocytes avec ca2ND96 gratuit jusqu’à ce que la solution devienne transparente.
    5. Transférer les ocytes individuels verslasolution ND-96 contenant la solution ND-96, complétée par une gentamicine de 2 mg/ml à l’aide d’une pipette de transfert avec une pointe étroite.
      REMARQUE : Cette étape est essentielle lorsqu’il est nécessaire de stocker les oocytes. Les oocytes individuels peuvent être stockés dans un incubateur pendant plusieurs jours à 14-17 oC. Cependant, les ocytes morts qui sont blanchâtres doivent être enlevés au moins une fois par jour pour éviter la contamination de la solution avec des produits chimiques toxiques.
    6. Transférer 90 l’un des phospholipides enrichis en cholestérol en un puits d’une plaque de puits de 96.
    7. Transférer jusqu’à six ocytes du milieu ND96 au puits avec le moins de médium possible. Cette étape est essentielle.
      AVERTISSEMENT: Ne pas exposer les ocytes à l’air pendant le transfert pour garder les oocytes intacts.
    8. Placez la plaque de puits 96 sur un rotateur de plate-forme tridimensionnel pour fournir un petit mouvement orbital aux ocytes dans la cellule pendant 5-10 min.
    9. Ajoutez une goutte de ND96 dans le puits, et transférez les oocytes enrichis de cholestérol de la plaque de puits 96 à une plaque de 35 mm avec ND96 pour une utilisation immédiate. Cette étape est essentielle.
    10. Utilisez un kit à base d’oxidase de cholestérol disponible dans le commerce (voir tableau des matériaux)pour évaluer les changements dans les niveaux de cholestérol en suivant les instructions du fabricant.

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Résultats

L’utilisation de cyclodextrine saturée de cholestérol comme moyen d’enrichir les tissus et les cellules avec le cholestérol est bien établie. Ici, nous démontrons d’abord l’application de cette approche largement utilisée pour enrichir les artères cérébrales de rat avec le cholestérol utilisant M-CD saturé de cholestérol. La figure 1A montre un exemple d’une couche musculaire lisse de l’artère cérébrale image et dé...

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Discussion

Les méthodes d’enrichissement des tissus et des cellules des mammifères et des oocytes Xenopus avec le cholestérol constituent un outil puissant pour étudier l’effet des taux élevés de cholestérol sur les espèces moléculaires individuelles, sur les systèmes macromoléculaires complexes (p. ex. protéines) et sur la fonction cellulaire et des organes. Dans cet article, nous avons décrit deux approches complémentaires qui facilitent de telles études. Tout d’abord, nous avons décrit comment enri...

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Déclarations de divulgation

Le Dr A. M. Dopico est un employé fédéral spécial à temps partiel et membre actuel du Conseil consultatif national sur l’abus et l’alcoolisme.

Remerciements

Ces travaux ont été soutenus par une subvention pour le développement scientifique (11SDG5190025) de l’American Heart Association (à A.R.-D.), et par les subventions AA-023764 (à A.N.B.), et HL-104631 et R37 AA-11560 (à A.M.D.).

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matériels

NameCompanyCatalog NumberComments
Amplex Red Cholesterol Assay KitInvitrogenA12216
Pierce BCA Protein Assay KitThermo Scientific23225
Pre-Diluted Protein Assay Standards BSA setThermo Scientific23208
Brain PE 25Mg in ChloroformAvanti Lipids840022C
16:0-18:1 PS 25Mg ChloroformAvanti Lipids840034C
Cholesterol 100Mg PowderSigmaC8667
KClFisherP217
Trizma baseSigmaT6066
HEPESCorning61-034-RO
MgCl2FisherM33
NaClFisherS271
KH2PO4FisherP285
MgSO4EMD ChemicalsMX0070-1
EDTAVWRE177
Dextrose AnhydrousFisherBP350
NaHCO3SigmaS6014
CaCl2SigmaC3881
Blood Gas TanknexAir
NaOHFisherS318
1.5mL tubesFisherS35818
Gastight Syringe 100uLHamilton1710
Microliter Syringe 25uLHamilton702
12 mL heavy duty conical centrifuge beaded rim tubePyrex8120-12
ChloroformFisherC298
Support StandHomescience ToolsCE-STAN5X8
Universal Clamp, 3-ProngHomescience ToolsCE-CLPUNIV
SonicatorLaboratory SuppliesG112SP1G
3D rotator mixerBenchmark ScientificB3D 1308
96 well plateSigmaBR781602
N2 gasnexAir
Glass beakers 40ml-1LFisher02-540
Ice MachineScotsmanCU1526MA-1
Ice bucketFisher50-136-7764
1X PBSCorning21-031-CM
TritonXFisherBP151-100
Sonic DismembratorFisherModel 100
Eppendorf microcentrifugeEppendorfModel 5417R
Amber bottlesFisher03-251-420
Corning™ Disposable Glass Pasteur PipetsFIsher13-678-4A
ParafilmFIsher50-998-944
Isotemp™ BOD Refrigerated IncubatorFIsher97-990E
OocytesXenoocyte™10005
RatEnvigoSprague Dawleyweight 250g
Methyl-β-cyclodextrinSigmaC4555
Water bath incubator with shakerPrecision51221080Lowest shaker setting O/N 37 °C
FilipinSigmaSAE0088-1ML
DMSOFisherBP231
Paraformaldehyde 4%Mallinckrodt2621
DI H2OUniversity DI source
ProLong Gold antifade reagnetInvitrogenP10144
Microslides 75x25mm FrostedDiaggerG15978A
ForcepsFine Science Tools11255-20
Microscope CoverslipDiaggerG15972B
Clear nail polishRevlon771 Clear
Labeling TapeFisher15-901-20F
Securline Lab Marker IISigmaZ648205-5EA
BD 10mL SyringeFisher14-823-16E
1.2 μm syringe filterVWR28150-958
KimWipesFisher06-666A
pH probeSartoruspy-p112s
pH meterDenver instrumentModel 225
70% ETOHPharmco211USP/NF
TimerFisher02-261-840
Steno bookStaples163485

Références

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