JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

الغدة الثديية هي بنية ثنائية الطبقات ، تتألف من الخلايا الظهارية الداخلية والداخلية. قدم هو بروتوكول لإعداد organoids باستخدام التربسينات التفاضلية. تسمح هذه الطريقة الفعالة للباحثين بالتلاعب بشكل منفصل مع هذين النوعين من الخلايا لاستكشاف الأسئلة المتعلقة بأدوارهم في شكل الغدة الثديية ووظيفتها.

Abstract

تقدم الأرغن ذاتية التنظيم وهياكل الأنسجة ثلاثية الأبعاد التي تلخص العمليات الفسيولوجية في راحة الطبق. تتكون الغدة الثديية المورين من غرفتين منفصلتين للخلايا الظهارية متميزة ، تخدم وظائف مختلفة: المقصورة الخارجية ، الانحلال myoepithelial والمقصورة المضيئة الداخلية الإفرازية. هنا ، نصف طريقة يتم من خلالها عزل الخلايا التي تتألف من هذه الأجزاء ثم دمجها للتحقيق في مساهماتها الفردية في تكوين الغدة الثديية والتمايز. الطريقة بسيطة وفعالة ولا تتطلب تقنيات فصل متطورة مثل فرز الخلايا المنشطة الفلورية. بدلا من ذلك، نحن الحصاد وهضم الأنسجة أنزيمي، بذور ظهارة على أطباق زراعة الأنسجة المنضمة، ومن ثم استخدام التربسال التفاضلية لفصل myoepithelial من الخلايا المضيئة مع ~ 90٪ نقاء. ثم يتم طلاء الخلايا في مصفوفة خارج الخلية حيث تنظم في عضويات ثنائية الأبعاد (3D) يمكن تمييزها لإنتاج الحليب بعد 10 أيام في الثقافة. لاختبار آثار الطفرات الوراثية، يمكن حصاد الخلايا من النوع البري أو نماذج الماوس المعدلة وراثيا، أو يمكن التلاعب بها وراثيا قبل الثقافة ثلاثية الأبعاد. ويمكن استخدام هذه التقنية لتوليد الأورجادات الفسيفساء التي تسمح بالتحقيق في وظيفة الجينات على وجه التحديد في المقصورة المضيئة أو الميوبيلية.

Introduction

الغدة الثديية (MG) هي بنية ظهارية أنبوبية تشبه الشجرة وجزءاً لا يتجزأ من ستروما الغنية بالخلايا الشحمية. تتكون ظهارة القناة ثنائية الطبقات من طبقة خارجية وبازلية من الانقباض والخلايا العضلة المتوسطة (MyoECs) وطبقة داخلية من الخلايا الظهارية الظهارية الظهارية المضيئة (LECs) ، وتطويق تجويف مركزي1. أثناء الرضاعة عندما تعاقدت MyoECs الخارجية على ضغط الحليب من الليكل السنخيالداخلي ، يخضع MG للعديد من التغييرات التي تخضع لسيطرة عوامل النمو (مثل EGF و FGF) والهرمونات (مثل البروجسترون والأنسولين والبرولاكتين). هذه التغيرات تسبب التمايز من الهياكل المتخصصة، الحويصلات الهوائية، والتي توليف وإفراز الحليب أثناء الرضاعة1. يمكن التلاعب بظهارة الثدي بشكل تجريبي باستخدام التقنيات التي يتم فيها إما زرع شظايا الأنسجة الظهارية أو الخلايا أو حتى خلية القاعدية واحدة في منصات الدهون الثديية المضيفة ، وتطهيرها مسبقًا من parenchyma الثديية الذاتية ، والسماح لها بالنمو لإعادة تشكيل شجرة ظهارية وظيفية كاملة2،3،4،5. الزرع هو تقنية قوية، ولكن من الصعب أن تستغرق وقتا طويلا والمستحيل إذا طفرة النتائج في وقت مبكر من الفتك الجنينية (قبل E14) التي تمنع إنقاذ الانج الثديية القابلة للزرع. وعلاوة على ذلك، يرغب المحققون في كثير من الأحيان في البحث عن أدوار الجزأين المختلفين، المستمدين من خلايا السلف المقيدة بالنسب. في حين أن تكنولوجيا Cre-lox تسمح بالتلاعب الجيني التفاضلي لـ MyoECs و LECs ، فإن هذا أيضًا مهمة تستغرق وقتًا طويلاً ومكلفة. وهكذا ، منذ 1950s ، وقد استخدم المحققون في المختبر organoids الثديية كوسيلة سهلة نسبيا وفعالة لمعالجة المسائل المتعلقة بنية الأنسجة الثديية وظيفة6،7.

في البروتوكولات المبكرة التي تصف عزلة وثقافة الخلايا الظهارية الثديية الأولية ، وجد المحققون أن مصفوفة غشاء الطابق السفلي (BME) ، المكونة من جلطة بلازما واستخراج جنين الدجاج ، كانت مطلوبة لشظايا MG التي تزرع على طبق6. في العقود التالية ، تم تطوير المصفوفات خارج الخلية (ECMs ، الكولاجين ، ومصفوفة البروتين هلامي تفرزها خلايا ساركوما Murine Engelbreth-Holm-Swarm) لتسهيل الثقافة ثلاثية الأبعاد وتقليد أفضل في بيئة الجسم الحي7،8،9،10. الخلايا التهيئة في مصفوفات 3D كشفت عن معايير متعددة (مورفولوجيا، والتعبير الجيني، واستجابة الهرمونات) أن مثل هذه البيئة الدقيقة نماذج أفضل فيالعملياتالفسيولوجية الجسم 9،10،11،12. حددت الأبحاث باستخدام خلايا المورين الأولية عوامل النمو الرئيسية ومورفوجينات ضرورية للصيانة الموسعة والتمايز للorganoids13. وقد مهدت هذه الدراسات الطريق للبروتوكول المعروض هنا ، وثقافة خلايا الثدي البشرية وorganoids 3D ، والتي هي الآن أداة سريرية حديثة ، مما يسمح لاكتشاف المخدرات واختبار المخدرات على عينات المريض14. وعموما، يبرز الاستزراع اللواني العضوي قدرات التنظيم الذاتي للخلايا الأولية ومساهماتها في تكوين المورفوجينية والتمايز.

عرض هنا هو بروتوكول لثقافة الظهارة المورين التي يمكن تمييزها في acini المنتجة للحليب. يتم استخدام تقنية التربسة التفاضلية لعزل MyoECs و LECs التي تضم مقصورتي خلية MG متميزتين. ويمكن بعد ذلك أن يتم التلاعب بكسور الخلايا المنفصلة هذه وراثياً إلى وظيفة جينية مفرطة أو ضربة قاضية. لأن النسب الجوهرية، والتنظيم الذاتي هو خاصية فطرية من الخلايا الظهارية الثديية15،16،17، وإعادة دمج هذه الكسور الخلية يسمح للباحثين لتوليد ثنائي الطبقات، والأجهزة الفسيفسائية. نبدأ بهضم الأنسجة الدهنية بشكل أنزيمي ، ثم احتضان شظايا الثديية على طبق زراعة الأنسجة لمدة 24 ساعة(الشكل 1). تستقر شظايا الأنسجة على أطباق البوليسترين كأجزاء ثنائية الطبقات مع تنظيمها في الجسم الحي: طبقة عضلة العين الخارجية المحيطة بالطبقات المضيئة الداخلية. هذه المنظمة الخلوية يسمح لعزل MyoECs الخارجي عن طريق التربسين EDTA (0.05٪) العلاج لمدة 3-6 دقيقة تليها الجولة الثانية من التربسين-EDTA (0.05%). العلاج الذي يفصل LECs الداخلية المتبقية(الشكل 2). وهكذا، يتم عزل هذه الأنواع من الخلايا مع حساسية التربسين مختلفة ويمكن لاحقا أن تكون مختلطة ومطلي في ECM(الشكل 3). وتخضع الخلايا للتنظيم الذاتي لتشكيل مجالات ثنائية الطبقات، تتألف من طبقة خارجية من MyoECs المحيطة بمراكز التجارة المنخفضة الداخلية. تشكيل لومن يحدث كما تنمو الخلايا في وسط يحتوي على مزيج من عوامل النمو (انظر وصفات للنمو المتوسط)13. بعد 5 أيام ، يمكن تمييز الأورجادات الاعضاء في acini المنتجة للحليب عن طريق التحول إلى Alveologenesis Medium (انظر الوصفات والشكل 3F)واحتضانها لمدة 5 أيام أخرى. بدلا من ذلك، سوف تستمر الorganoids للتوسع وفرع في النمو المتوسطة لمدة 10 أيام على الأقل. يمكن تحليل الأرغن باستخدام الفلورة المناعية(الشكل 3D-F)أو تحريرها من ECM باستخدام محلول الاسترداد (انظر جدول المواد)وتحليلها عبر طرق أخرى (على سبيل المثال، المناعة، RT-qPCR).

Protocol

وقد وافقت اللجنة المؤسسية لرعاية الحيوانات واستخدامها (IACUC) التابعة لجامعة كاليفورنيا، سانتا كروز، على جميع الأساليب الموصوفة هنا.

1. اليوم 1: هضم الغدة الثديية

  1. الاستعداد لحصاد MGs من الفئران الإناث ناضجة 10-14 أسبوعا من العمر.
    1. أداء الحصاد على مقعد مفتوح في ظل ظروف معقمة.
    2. قم بتعقيم جميع الإمدادات الجراحية وألواح الفلين والدبابيس عن طريق التعقيم والنقع في الكحول بنسبة 70٪ لمدة 20 دقيقة قبل الجراحة.
    3. تخدير الحيوانات مع بنتوباربيتال الصوديوم (جرعة مخدر 2X من 0.06 ملغ / غرام وزن الجسم) تسليمها عن طريق حقن داخل السربيتون مع حقنة الأنسولين 0.5 مل.
    4. مراقبة مستوى التخدير عن طريق قرص إصبع الحيوان للتحقق من استجابة منعكسة والبدء في البروتوكول فقط بعد تخدير الحيوان بالكامل.
    5. وضع الحيوان على ظهره، دبوس الزوائد إلى الفلين، ومسح أسفل بطنه وصدره مع الإيثانول.
  2. لحصاد #2 و3 و4 و5 MGs من فأر واحد (أي 8 MGs ، الشكل 1A)، حدد خط الوسط بين الساقين الخلفيتين وبعمل شق صغير (1 سم) على جلد البطن بمقص حاد ، ثم قم بتمديد القطع حتى الرقبة18.
  3. اتبع عن طريق إجراء تخفيضات صغيرة بشكل قطعي نحو الساقين والذراعين للسماح للإفراج عن الجلد باستخدام مسحة القطن. سحب الجلد بعيدا وتمتد عليه ضيق قبل تثبيته على جانب واحد(الشكل 1B،الخطوة 1)18. إزالة MGs عن طريق قطع تحتها، وإزالة الغدد الليمفاوية من الغدد #4(الشكل 1B،الخطوات 2، 3)18. كرر الإجراء على الجانب الآخر من الجسم.
  4. جمع الأنسجة MG في 50 مل من 4 درجة مئوية دولبيكو في تعديل النسر وسائل الإعلام (DMEM) / المغذيات خليط F12 (F12) تستكمل مع 5٪ مصل الأبقار الجنين (FBS) و 1X المضادات الحيوية المضادة للميكوتك (المضادة)18.
  5. فرم الغدد في طبق 35 ملم أو على لوحة خزفية باستخدام شفرة حلاقة أو مروحية الأنسجة. تدوير لوحة كل خمسة قطع يدوية أو كل جولة على المروحية الأنسجة حتى قطع الأنسجة يمكن أن يصلح من خلال تلميح ميكروبيبات 1 مل بكل سهولة (~ 0.1 ملم / جزء، الشكل 1C).
  6. هضم MGs في الهضم المتوسطة (انظر الجدول 1)لمدة 14 ساعة في طبق التصاق منخفض جدا 6 في 37 درجة مئوية، 5٪ CO2.

2. اليوم 2: عزل شظايا الأنسجة الظهارية الثديية

  1. بعد 14 ساعة من الهضم، مزيج بلطف عن طريق الأنابيب الأنسجة المهضومة 10X باستخدام ميكروبيبة 1 مل لكسر أي الأنسجة الستروما أو الدهنية المتبقية، وضمان عدم إنشاء فقاعات ولا قوة ميكانيكية زائدة.
    ملاحظة: إذا كان هناك هضم غير مكتمل بعد 14 ساعة، يمكن أن يكون هذا بسبب تراكم الحمض النووي القص. في هذه الحالة، إضافة 1 ميكرولتر من 1 ملغ /مل deoxyribonuclease الأول (DNase I) لكل 2 مل من الهضم المتوسطة. احتضان لمدة 30 دقيقة أخرى في 37 درجة مئوية، 5٪ CO2.
  2. جمع الأنسجة في أنبوب 15 مل وشطف جيدا تستخدم للهضم مع 2-3 مل من الأنسجة ثقافة الصف 1X دولبيكو الفوسفات العازلة المالحة (DPBS) خالية من كاليفورنيا2 + وملغ2 +. جهاز طرد مركزي عند 600 x g لمدة 10 دقيقة.
  3. إخلاء الفوق الذي يحتوي على طبقة الدهون والمتوسطة، ومن ثم إعادة تعليق بيليه في 5 مل من DPBS والتحول إلى أنبوب جديد 15 مل. جهاز طرد مركزي عند 600 x g لمدة 10 دقيقة.
  4. خلال المركزية مكان 70 ميكرومتر مصفاة خلية النايلون في أنبوب 50 مل وprewet مصفاة باستخدام 10 مل من 37 درجة مئوية DMEM/F12.
  5. إعادة تعليق شظايا الأنسجة من خطوة البروتوكول 2.4 باستخدام 5 مل من DPBS وتمرير التعليق من خلال مصفاة خلايا النايلون prewet 70 ميكرومتر لإزالة الخلايا المترالية والخلايا المفردة(الشكل 1D).
  6. جمع شظايا الأنسجة على مصفاة الخلية. شطف 4X مع 10 مل من 37 درجة مئوية DMEM/F12(الشكل 1D).
    تنبيه: الإنارة غير الكامل سيؤدي إلى ثقافات ملوثة بخلايا غير ظهارية.
  7. الافراج عن شظايا الأنسجة عن طريق عقد علامة التبويب مصفاة مع أصابع قفاز، عكس مصفاة أكثر من طبق زراعة الأنسجة 60 ملم وتمرير 1 مل aliquots من الصيانة المتوسطة (انظر الجدول 1)من خلال الجزء السفلي من مصفاة 4X(الشكل 1E).
  8. تحقق من مصفاة لبقايا شظايا الأنسجة، والتي سوف تكون مرئية بالعين المجردة، وشطف مصفاة 1X أكثر مع 1 مل من الصيانة المتوسطة إذا كان أي شظايا لا تزال التمسك مصفاة. يجب أن تكون شظايا الأنسجة المشطفة الآن خالية من الخلايا المترالية.
  9. افحص بسرعة الطبق 60 مم الذي يحتوي على شظايا MG من الخطوة 2.9 البروتوكول تحت المجهر المقلوب (4X أو 10X الهدف، الشكل 1F). إعداد نموذجي من ثمانية MGs تسفر ~ 500 شظايا. ابحث عن خلايا مفردة أو قطرات الدهون وما إذا كانت هناك خلايا ملوثة.
    ملاحظة: إذا كانت هناك خلايا ملوثة، كرر خطوة الترشيح عن طريق جمع الوسط والشظايا من الطبق 60 ملم باستخدام ماصة 5 مل وتصفية الجزء مرة أخرى من خلال مصفاة جديدة 70 ميكرومتر، وتكرار الخطوات البروتوكول 2.6، 2.8-2.10.
  10. احتضان 24 ساعة في 37 درجة مئوية، 5٪ CO2،مما يسمح لشظية الأنسجة إلى التمسك وتوليد شظايا ذات طبقات مزدوجة(الشكل 2A).
    ملاحظة: إذا لم تستقر الأجزاء بمقدار 24 ساعة، استمر في احتضان هاوية حتى يتم الالتزام بها. إذا كانت الشظايا لا تلتزم بشكل جيد، فإن فصل مقصورات الخلية لن يعمل. إذا كان الباحثون قلقين بشأن الالتصاق ، يمكن علاج لوحات زراعة الأنسجة لتعزيز ارتباط الأجزاء (على سبيل المثال ، بولي -L-ليسين).

3. اليوم 3: التبصلات التفاضلية للخلايا الظهارية الزميوية والإنارية

  1. لفصل MyoECs من الـ LECs ، قم بتفريغ الوسائط من الطبق ، وشطف 1x مع 1 مل من DPBS وإضافة 1 مل من التربسين-EDTA الطازج (0.05٪) ، ومراقبة الهضم بعناية تحت المجهر المقلوب (10X أو 20X الهدف ، الشكل 2B ، C ، F). سوف مفرزة من طبقة MyoEC الخارجي تتطلب 3-6 دقيقة، اعتمادا على التربسين-EDTA (0.05٪) قوه.
    ملاحظة: يرجى الاطلاع على الشكل 2 للحصول على صور تمثيلية تعرض هذه العملية. تحت إضاءة برايتفيلد ، تظهر MyoECs مدورة ولها مظهر أكثر إشراقًا بالمقارنة مع الـ LECs ، والتي تظل ملتصقة في الوسط وتظهر أكثر قتامة.
  2. اجمع كسر MyoEC في أنبوب 15 مل يحتوي على 2 مل 10٪ FBS / DPBS. دون إزعاج LECs، بلطف شطف الطبق 60 ملم مع 2 مل من DPBS ومن ثم التخلص من DPBS(الشكل 2H-I).
    ملاحظة: الاسترداد المعتاد لـ MyoECs ضمن نطاق (3.5 × 106-1.5 × 106)اعتماداً على حجم MGs.
  3. لإزالة الكسر LEC، إضافة 1 مل من التربسين-EDTA (0.05%) إلى الطبق مرة أخرى واحتضان 7-15 دقيقة، ورصد بعناية لمنع الإفراط في الهضم. إخماد التربسين-EDTA (0.05%) على الطبق مع 2 مل من 10٪ FBS / DPBS. جمع الكسر LEC في أنبوب جديد 15 مل.
    ملاحظة: الانتعاش المعتاد لـ LECs هو ضمن نطاق (2 × 106-4.2 × 106)اعتمادًا على حجم MGs. بشكل روتيني ، فإن نقاء كلا الكسور كما هو مُحس من قبل الكيمياء المناعية هو ~ 90٪19 (الشكل 2E).
  4. الطرد المركزي كل كسر لمدة 5 دقيقة في 300 × ز لإزالة التربسين-EDTA (0.05٪). إعادة تعليق بيليه في 250 ميكرولتر من الصيانة المتوسطة والعد كل عدد الخلايا باستخدام مقياس الهيموكيتومتر أو عداد الخلية الآلي. وضع الخلايا على الجليد أثناء العد.
    ملاحظة: إذا كان التلاعب الجيني لكسور الخلية مرغوبًا فيه ، يمكن زراعة الخلايا الأولية20على أطباق الالتصاق المنخفضة والإصابة بفيروس اللاتين20.

4. اليوم 3: دمج وتضمين كسور الخلية في مصفوفة خارج الخلية

ملاحظة: بمجرد أن يتم جمع كسور MyoEC و LEC وحسابها، يمكن دمجها. نسبة MyoEC / LEC النموذجية هي 1:3(الشكل 3A)19. يمكن إجراء دراسات مختلفة. على سبيل المثال، لإجراء دراسات الفسيفساء، يمكن توليد الكسور من نوع البرية (WT) والفئران متحولة (موت) والجمع بين (MyoEC / LEC: WT / WT; WT/Mut; موت/WT; Mut/Mut)21، أو يمكن الجمع بين الكسور باستخدام نسب مختلفة من MyoECs /LECs19.

  1. استناداً إلى عدد الخلايا، احسب عدد الآبار (8 غرفة بئر، انظر جدول المواد)التي تحتاج إلى إعداد لـ 12,000 خلية/بئر (على سبيل المثال 3,000 MyoECs:9,000 LECs).
  2. إنشاء طبقة أساسية للثقافة 3D عن طريق إضافة 90 ميكرولتر من 50٪ ECM (50٪ ECM/50٪ DMEM/F12، دون أحمر الفينول - انظر جدول المواد)إلى كل بئر. تأكد من عدم وجود فقاعات والمغلفة الآبار بالتساوي. لترسيخ الطبقة الأساسية، قم باحتضان الشرائح عند درجة حرارة 37 درجة مئوية، 5% ثاني أكسيد الكربون2 لمدة 30 دقيقة.
    ملاحظة: يحتاج ECM إلى البقاء الجليد الباردة حتى هذه الخطوة، وإلا فإنه سوف البلمرة قبل الأوان ويؤدي إلى طلاء قاعدة متفاوتة والبلمرة. استخدام قاعدة ECM يعزز نمو organoid في مستوى واحد، مما يساعد على التقاط الصور. هذا يحصل أيضا أسرع نمو عضوي ويستخدم أقل ECM22.
  3. أثناء البلمرة، وإعداد يمزج الخلية. بيليه وMyoEC وLEC كسور في 300 × ز لمدة 5 دقيقة وإعادة تعليق كل كسر الخلية في 10٪ ECM/90٪ متوسط النمو حتى كل بئر لديه 100 ميكرولتر (انظر الجدول 1 لكيفية جعل النمو المتوسط).
    ملاحظة: لسهولة التحضير، نسخ الآبار باستخدام نفس خلطات الخلية. ويمكن الجمع بين هذه وإعدادها في أنبوب واحد (على سبيل المثال، يمكن إعداد أربعة آبار من نفس المزيج الخلية في 400 ميكرولتر من 10٪ ECM/90٪ متوسط النمو).
  4. إضافة 100 ميكرولتر من كل مزيج الخلية في 10٪ ECM/90٪ متوسط النمو إلى كل بئر والسماح organoids لتسوية لمدة 20 دقيقة في 37 درجة مئوية، 5٪ CO2.
  5. مرة واحدة وقد استقر الخلايا، إضافة بلطف 100 ميكرولتر من متوسط النمو عن طريق الأنابيب بلطف أسفل جدار غرفة كل بئر. احتضان الشرائح عند 37 درجة مئوية، 5٪ CO2 (انظر الشكل 3A للتكوين الكلي لكل بئر).
    ملاحظة: مثبط رو كيناز، R-spondin، وNrg1 هي العوامل التي تم تحديدها على أنها مهمة لثقافة طويلة الأجل من organoids نمت من كل من الخلايا الثديية المورين الأولية وخلايا سرطان الثدي البشري13،14. بالإضافة إلى ذلك ، فإن عوامل الخلايا الجذعية B27 و N2 تمديد الوقت الذي يمكن أن تكون الاعضاء المستزرعة.
  6. خلايا الصور كل 24 ساعة لتتبع نموها وتجديد بلطف متوسط النمو كل 2-3 أيام باستخدام 100 ميكرولتر / جيد(الشكل 3B-E).
    ملاحظة: استخدم الحذر الشديد عند تجديد الوسط. إمالة الشرائح الغرفة لجمع المتوسطة في زاوية واحدة من الآبار. إزالة ≤ 100 ميكرولتر من المتوسط وتجديد بعناية لترك طبقة ECM دون عائق.
  7. إذا كان الباحثون مهتمين بالتحقيق في الرضاعة / الخلايا النزفية ، قم بالتبديل إلى Alveologenesis Medium (انظر الجدول 1)في اليوم 5 واستمر في تجديد الوسيط كل 2-3 أيام حتى اليوم 10(الشكل 3F)أو ما بعده عن طريق تمرير باستخدام حل الاسترداد (انظر جدول المواد)13.
    ملاحظة: عند هذه النقطة، يمكن عزل الأرغن من ECM عن طريق احتضان 4 درجة مئوية في 400 ميكرولتر من محلول استرداد 4 درجات مئوية (انظر جدول المواد للحصول على معلومات البروتوكول والكاشف).

5. يوم 5 أو 10: تحديد وأجهزة المناعة

  1. إزالة المتوسطة بعناية عن طريق الأنابيب بلطف قبالة وسائل الإعلام (ماصة لمبة يعمل بشكل أفضل). شطف كل جيدا باستخدام 200 ميكرولتر من 1x الفوسفات دولبيكو المالحة العازلة (DPBS، انظر وصفات).
  2. إصلاح organoids باستخدام الباردة (4 درجة مئوية) 4٪ (ث / v) paraformaldehyde (PFA، انظر وصفات) لمدة 10 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
    تنبيه: PFA خطرة. ارتداء معدات الحماية الشخصية (معطف المختبر والقفازات ونظارات السلامة). وينبغي أن يتم تنفيذ هذه الخطوة داخل غطاء الدخان.
    ملاحظة: يتم حل ECM بواسطة العلاج PFA. إزالة ECM غير مكتملة يمكن أن يؤدي إلى تلطيخ الخلفية عندما يتم تحليل organoids بواسطة الفلور المناعي.
  3. إزالة PFA 4٪ وإضافة 200 ميكرولتر من 0.2٪ (ث / v) الجليسين / DPBS (انظر الجدول 1)إلى كل بئر. احتضان الشرائح في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة أو 4 درجات مئوية بين عشية وضحاها على سطح هزاز تعيين إلى وضع بطيء.
    ملاحظة: يمكن تخزين الاعضاء لمدة 1-3 أيام في DPBS في 4 درجة مئوية قبل الخطوة التالية.
  4. Permeabilize organoids باستخدام DPBS + 0.25٪ تريتون X-100 (PBST، انظر الجدول 1)لمدة 10 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
  5. منع organoids باستخدام 5٪ مصل حمار (DS) (أو مصل آخر مطابق لأنواع من الأجسام المضادة الثانوية) في DPBS لمدة 1 ساعة على سطح هزاز.
    ملاحظة: يمكن تنفيذ هذه الخطوة بين عشية وضحاها عند 4 درجة مئوية على سطح هزاز.
  6. إعداد الأجسام المضادة الأولية في 1٪ DS / DPBS. استخدام 125-200 ميكرولتر لكل بئر. قم بتلطيخ المناعة عن طريق احتضان الأجسام الاعضاء في الجسم المضاد الأولي بين عشية وضحاها عند 4 درجات مئوية على سطح هزاز.

6. اليوم 11: الفلور المناعي الكامل

  1. غسل كل 2X جيدا مع 200 ميكرولتر PBST لمدة 5 دقيقة. إضافة الأجسام المضادة الثانوية في 1٪ DS / DPBS باستخدام 125-200 ميكرولتر لكل بئر. احتضان في درجة حرارة الغرفة على سطح هزاز لمدة 45 دقيقة.
  2. غسل كل بئر 2X باستخدام 200 ميكرولتر PBST لكل بئر.
  3. الطخ النوى باستخدام صبغة الحمض النووي Hoechst في DPBS (1:2000 في DPBS) لمدة 5 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
  4. إزالة جميع السائل اليسار على البئر عن طريق شفط بلطف مع فراغ.
  5. قم بإزالة الغرف والطوقا بعناية ، ضع قطرة واحدة (~ 30 ميكرولتر) من الوسائط المتصاعدة (انظر جدول المواد)على كل بئر وقسيمة تغطية ، مع الحرص على إزالة الفقاعات. السماح للشريحة لتجف في مساحة مظلمة لمدة 1-2 أيام. ختم مع طلاء الأظافر واضحة. صورة organoids على المجهر البؤري(الشكل 3E-F).

النتائج

يصف البروتوكول المعروض هنا طريقة للتحقيق في مساهمات نسب محددة للخلايا الظهارية الثديية من خلال الاستفادة من الأجهزة الفسيفسائية. للحصول على خلايا المورين الأولية للorganoids ، يجب أولاً عزل ظهارة الغدة الثديية عن ستروما الغنية الدهنية المحيطة(الشكل 1). هذه ا...

Discussion

هنا ، يتم تقديم طريقة بالتفصيل كيف يمكن للباحثين توليد الثقافات الاعضاء 3D باستخدام خلايا MG الأولية. الفرق بين هذا والبروتوكولات الأخرى هو أننا بالتفصيل طريقة لفصل اثنين، متميزة مقصورات الخلية MG: MyoECs القاعدية الخارجية وLECs الداخلية. تستخدم طريقتنا تريبسين-EDTA من خطوتين (0.05%) العلاج الذي نسمي...

Disclosures

وليس لدى صاحبي البلاغ ما يكشفان عنه.

Acknowledgements

نشكر بن أبرامز على المساعدة التقنية والدعم الأساسي من معهد جامعة كاليفورنيا في سانتا كروز لبيولوجيا الخلايا الجذعية (IBSC). نشكر سوزان ستروم وبيل ساكستون لاستخدام Solamere الغزل القرص المجهر كونكورسي. تم دعم هذا العمل جزئيًا من خلال المنح المقدمة إلى UCSC من معهد هوارد هيوز الطبي من خلال زمالات جيمس جيليام للدراسة المتقدمة (S.R.) ، من المعاهد القومية للصحة (NIH GM058903) لمبادرة تحقيق أقصى قدر من تنمية الطلاب (H.M. ومن المؤسسة الوطنية للعلوم للحصول على زمالة أبحاث الدراسات العليا (O.C. DGE 1339067) ومنحة (A18-0370) من لجنة تنسيق أبحاث السرطان في جامعة كاليفورنيا (LH).

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
15 ml High-Clarity Polypropylene Conical Tube (BD Falcon)Fisher Scientific352096
24 well ultra-low attachment plate (Corning)Fisher ScientificCLS3473-24EA
35 mm TC-treated Easy-Grip Style Cell Culture Dish (BD Falcon)Fisher Scientific353001
50 ml High-Clarity polypropylene conical tube (BD Falcon)Fisher Scientific352098
60 mm TC-treated Easy-Grip Style Cell Culture Dish (BD Falcon)Fisher Scientific353004
70 µM nylon cell strainer (Corning)Fisher Scientific08-771-2
Antibiotic-Antimycotic (100X)Thermo Fisher Scientific15240062Pen/Strep also works
B27 supplement without vitamin A (50x)Thermo Fisher Scientific12587010
B6 ACTb-EGFP miceThe Jackson Laboratory003291
BD Insulin syringe 0.5 mLThermo Fisher Scientific14-826-79
Class 2 Dispase (Roche)Millipore Sigma4942078001
Class 3 CollagenaseWorthington BiochemicalLS004206
Corning Cell Recovery solutionFisher Scientific354253Follow the guidelines for use – Extraction of Three-Dimensional Structures
from Corning Matrigel Matrix
Corning Costar Ultra-Low Attachment 6-wellFisher ScientificCLS3471
DexamethasoneMillipore SigmaD4902-25MG
DMEM/F12, no phenol redThermo Fisher Scientific11039-021
DNase (Deoxyribonuclease I)Worthington BiochemicalLS002007
Donkey anti-Goat 647Thermo Fisher ScientificA21447Use at 1:500, Lot: 1608641, stock 2 mg/mL, RRID:AB_2535864
Donkey anti-Mouse 647Jackson ImmunoResearch715-606-150Use at 1:1000, Lot: 140554, stock 1.4 mg/mL
Dulbecco's Modified Eagle Medium: Nutrient Mixture F-12 (DMEM/F12)Thermo Fisher Scientific11330-057
Dulbecco's phosphate-buffered saline (DPBS)Thermo Fisher Scientific14190-250Without Mg2+/Ca2+
EGFFisher ScientificAF-100-15-100ug
Fetal Bovine SerumVWR97068–085100% US Origin, premium grade, Lot: 059B18
Fluoromount-G (Southern Biotech)Fisher Scientific0100-01Referred to as mounting media in text
GentamicinThermo Fisher Scientific15710064
GlycineFisher ScientificBP381-5
Goat anti-WAPSanta Cruz BiotechSC-14832Use at 1:250, Lot: J1011, stock 200 µg/mL, RRID:AB_677601
Hoechst 33342AnaSpecAS-83218Use 1:2000, stock is 20mM
InsulinMillipore SigmaI6634-100mg
KClFisher ScientificP217-500
KH2PO4Fisher ScientificP285-500
KRT14–CreERtamThe Jackson Laboratory5107
Matrigel Growth Factor Reduced (GFR); Phenol Red-Free; 10 mLFisher ScientificCB-40230CLot: 8204010, stock concentration 8.9 mg/mL
MillexGV Filter Unit 0.22 µmMillipore SigmaSLGV033RS
Millicell EZ SLIDE 8-well glass, sterileMillipore SigmaPEZGS0816These chamber slides are great for gasket removal but other brands can work well (e.g. Lab Tek II).
Mouse anti-SMAMillipore SigmaA2547Use at 1:500, Lot: 128M4881V, stock 5.2 mg/mL, RRID:AB_476701
N-2 Supplement (100x)Thermo Fisher Scientific17502048
NaClFisher ScientificS671-3
NaH2PO4Fisher ScientificS468-500
Nrg1R&D5898-NR-050
Ovine Pituitary ProlactinNational Hormone and Peptide ProgramPurchased from Dr. Parlow at Harbor-UCLA Research and Education Institute
ParaformaldahydeMillipore SigmaPX0055-3
PentobarbitalMillipore SigmaP3761
R26R-EYFPThe Jackson Laboratory6148
Rho inhibitor Y-27632Tocris1254
R-spondinPeprotech120-38
Sodium HydroxideFisher ScientificS318-500
Sterile Filtered Donkey SerumEquitech-Bio Inc.SD30-0500
Sterile Filtered Donkey SerumEquitech-Bio Inc.SD30-0500
Triton X-100Millipore Sigmax100-500MLLaboratory grade
Trypsin EDTA 0.05%Thermo Fisher Scientific25300-062

References

  1. Macias, H., Hinck, L. Mammary gland development. Wiley Interdisciplinary Reviews in Developmental Biology. 1 (4), 533-557 (2012).
  2. Daniel, C. W., De Ome, K. B., Young, J. T., Blair, P. B., Faulkin, L. J. The in vivo life span of normal and preneoplastic mouse mammary glands: a serial transplantation study. Proceedings of the National Academy of Science U S A. 61 (1), 53-60 (1968).
  3. Ip, M. M., Asch, B. B. . Methods in Mammary Gland Biology and Breast Cancer Research. , (2000).
  4. Shackleton, M., et al. Generation of a functional mammary gland from a single stem cell. Nature. 439 (7072), 84-88 (2006).
  5. Stingl, J., et al. Purification and unique properties of mammary epithelial stem cells. Nature. 439 (7079), 993-997 (2006).
  6. Lasfargues, E. Y. Cultivation and behavior in vitro of the normal mammary epithelium of the adult mouse. II. Observations on the secretory activity. Experimental Cell Research. 13 (3), 553-562 (1957).
  7. Simian, M., Bissell, M. J. Organoids: A historical perspective of thinking in three dimensions. Journal of Cell Biology. 216 (1), 31-40 (2017).
  8. Orkin, R. W., et al. A murine tumor producing a matrix of basement membrane. Journal of Experimental Medicine. 145 (1), 204-220 (1977).
  9. Lee, E. Y., Parry, G., Bissell, M. J. Modulation of secreted proteins of mouse mammary epithelial cells by the collagenous substrata. Journal of Cell Biology. 98 (1), 146-155 (1984).
  10. Lee, E. Y., Lee, W. H., Kaetzel, C. S., Parry, G., Bissell, M. J. Interaction of mouse mammary epithelial cells with collagen substrata: regulation of casein gene expression and secretion. Proceedings of the National Academy of Science U S A. 82 (5), 1419-1423 (1985).
  11. Bissell, M. J., Barcellos-Hoff, M. H. The influence of extracellular matrix on gene expression: is structure the message?. Journal of Cell Science. 8 (Suppl), 327-343 (1987).
  12. Petersen, O. W., Ronnov-Jessen, L., Howlett, A. R., Bissell, M. J. Interaction with basement membrane serves to rapidly distinguish growth and differentiation pattern of normal and malignant human breast epithelial cells. Proceedings of the National Academy of Science U S A. 89 (19), 9064-9068 (1992).
  13. Jarde, T., et al. Wnt and Neuregulin1/ErbB signalling extends 3D culture of hormone responsive mammary organoids. Nature Commununications. 7, 13207 (2016).
  14. Sachs, N., et al. A Living Biobank of Breast Cancer Organoids Captures Disease Heterogeneity. Cell. 172 (1-2), 373-386 (2018).
  15. Daniel, C. W., Strickland, P., Friedmann, Y. Expression and functional role of E- and P-cadherins in mouse mammary ductal morphogenesis and growth. Developmental Biology. 169 (2), 511-519 (1995).
  16. Runswick, S. K., O'Hare, M. J., Jones, L., Streuli, C. H., Garrod, D. R. Desmosomal adhesion regulates epithelial morphogenesis and cell positioning. Nature Cell Biology. 3 (9), 823-830 (2001).
  17. Chanson, L., et al. Self-organization is a dynamic and lineage-intrinsic property of mammary epithelial cells. Proceedings of the National Academy of Science U S A. 108 (8), 3264-3269 (2011).
  18. Honvo-Houeto, E., Truchet, S. Indirect Immunofluorescence on Frozen Sections of Mouse Mammary Gland. Journal of Visualized Experiments. (106), e53179 (2015).
  19. Macias, H., et al. SLIT/ROBO1 signaling suppresses mammary branching morphogenesis by limiting basal cell number. Developmental Cell. 20 (6), 827-840 (2011).
  20. Welm, B. E., Dijkgraaf, G. J., Bledau, A. S., Welm, A. L., Werb, Z. Lentiviral transduction of mammary stem cells for analysis of gene function during development and cancer. Cell Stem Cell. 2 (1), 90-102 (2008).
  21. Smith, P., et al. VANGL2 regulates luminal epithelial organization and cell turnover in the mammary gland. Scientific Reports. 9 (1), 7079 (2019).
  22. Lee, G. Y., Kenny, P. A., Lee, E. H., Bissell, M. J. Three-dimensional culture models of normal and malignant breast epithelial cells. Nature Methods. 4 (4), 359-365 (2007).
  23. Campbell, J. J., Davidenko, N., Caffarel, M. M., Cameron, R. E., Watson, C. J. A multifunctional 3D co-culture system for studies of mammary tissue morphogenesis and stem cell biology. PLoS One. 6 (9), e25661 (2011).
  24. Labarge, M. A., Garbe, J. C., Stampfer, M. R. Processing of human reduction mammoplasty and mastectomy tissues for cell culture. Journal of Visualized Experiments. (71), e50011 (2013).
  25. Marlow, R., Dontu, G. Modeling the breast cancer bone metastatic niche in complex three-dimensional cocultures. Methods in Molecular Biology. 1293, 213-220 (2015).
  26. Koledova, Z., Lu, P. A 3D Fibroblast-Epithelium Co-culture Model for Understanding Microenvironmental Role in Branching Morphogenesis of the Mammary Gland. Methods in Molecular Biology. 1501, 217-231 (2017).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

157

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved