通过微分试穿素生成马赛克乳腺有机体

摘要

乳腺是一种双层结构，包括外层皮和内光上皮细胞。提出是一种使用微分锥形制备器官的协议。这种有效的方法允许研究人员分别操作这两种细胞类型，以探索有关它们在乳腺形式和功能中的作用的问题。

摘要

有机体提供自组织、三维组织结构，在菜肴的便利性下重述生理过程。母鼠乳腺由两个不同的上皮细胞隔间组成，具有不同的功能:外层、收缩性近垂体质隔间和内层分泌的发光室。在这里，我们描述了一种方法，其中组成这些隔间的细胞被分离，然后结合，以调查其个体系对乳腺形态和分化的贡献。该方法简单高效，不需要复杂的分离技术，如荧光活性细胞分拣。相反，我们收获和酶消化组织，在粘附组织培养皿上播种上皮，然后用微分试湿法将肌皮与纯度为90%的发光细胞分离。细胞然后镀在细胞外基质中，它们组织成双层三维（3D）器官，在培养10天后可以分化以生产牛奶。为了测试基因突变的影响，可以从野生类型或基因工程小鼠模型中采集细胞，也可以在3D培养之前对其进行基因操纵。该技术可用于生成马赛克器官，允许特别在亮度或骨髓间研究基因功能。

引言

乳腺（MG）是一种树状的管状上皮结构，嵌入于一个多头细胞丰富的血管。双层导管上皮包括外层、基底层收缩层、体外皮细胞（MyoECs）和一层发光、分泌上皮细胞（LECs），环绕着中央流明^1。在哺乳期间，当外部MyoECs收缩从内性醇的牛奶，MG经历许多变化，在生长因子（如，EGF和FGF）和激素（如孕酮，胰岛素和蛋白酶）的控制下。这些变化导致特殊结构，alveoli的分化，在哺乳期合成和分泌牛奶^1。乳房上皮可以实验性地操纵使用技术，其中上皮组织片段，细胞，甚至单个基底细胞移植到宿主乳腺脂肪垫，预清除内源性乳腺皮瘤，并允许生长出来，以重建一个完整的，功能上皮树^2,2，3，4，5。^3,4,5移植是一种强大的技术，但如果突变导致早期胚胎杀伤力（在E14之前）阻止拯救可移植的乳腺，则耗时且不可能。此外，研究人员经常希望研究两个不同隔间的作用，它们来自受血统限制的后代细胞。虽然Cre-lox技术允许对MyoEC和LECs进行微分基因操作，但这也是一项耗时且昂贵的工作。因此，自20世纪50年代以来，研究者一直使用体外乳腺器官作为一种相对容易和有效的方法来解决有关乳腺组织和功能^66，77的问题。

在描述原发性乳腺上皮细胞的分离和培养的早期协议中，研究人员发现，^在6号菜上生长的MG片段需要一个基底膜基质（BME），由血浆血栓和鸡胚胎提取物组成。在接下来的几十年里，开发了恩格尔布雷斯-霍尔姆-斯温-斯温鼠肉瘤细胞分泌的细胞外基质（ECMs、胶原蛋白和果冻状蛋白基质），以促进3D培养，更好地模拟体内环境^{77、8、9、10。8,9,10}培养细胞在3D矩阵中揭示的多种标准（形态、基因表达和激素反应能力），这种微环境更好的模型在体内生理过程^{99，10，11，12。10,11,12}使用原鼠细胞的研究确定了器官的扩展维持和分化所需的关键生长因子和形态原^13。这些研究为这里介绍的协议以及人类乳腺细胞作为3D器官的培养设定了舞台，这是现代的临床工具，允许在患者样本上发现药物和进行药物检测^。总体而言，器官培养突出了原细胞的自我组织能力及其对形态生成和分化的贡献。

这里介绍的是培养鼠上皮的规程，可以分化成产奶的阿基尼。差分试导技术用于分离构成两个不同的MG细胞舱的MyoE和LE。然后，这些分离的细胞分数可以遗传操纵，以过度表达或击倒基因功能。由于系系内在，自组织是乳腺上皮细胞^{15、16、17,17}的先^15,天属性，重新组合这些细胞分数使研究人员能够生成双层的马赛克器官。我们首先酶消化脂肪组织，然后在组织培养皿上孵育乳腺碎片24小时（图1）。组织碎片在聚苯乙烯盘上沉降成双层碎片，其体内组织:内层周围外层皮层。此细胞组织允许通过胰蛋白酶-EDTA （0.05%） 隔离外部 MyoECs治疗3-6分钟，然后进行第二轮胰蛋白酶-EDTA（0.05%）分离其余内部 LEC 的处理（图 2）。因此，这些具有不同胰蛋白酶灵敏度的细胞类型被分离，并随后在ECM中混合和镀层（图3）。细胞通过自我组织形成双层球体，包括围绕内部LECs的MyoECs的外层。流门的形成发生在细胞生长在含有生长因子的混合物的媒介中（见生长中型的食谱）¹³。5天后，通过切换到Alveolo成因介质（见食谱和图3F），再孵育5天，可以分化成产奶的阿基尼。或者，器官将继续扩展，并在生长媒介中分支至少10天。可以使用免疫荧光（图3D-F）分析有机体，或使用恢复溶液（参见材料表）从ECM中释放，并通过其他方法（例如，免疫布洛、RT-qPCR）进行分析。

研究方案

这里描述的所有方法都已获得加州大学圣克鲁斯分校机构动物护理和使用委员会（IACUC）的批准。

1. 第1天:乳腺消化

1. 准备从成熟雌性小鼠10-14周的年龄中收获MG。
   1. 在无菌条件下在开放式长凳上进行收获。
   2. 在手术前20分钟内，通过高压灭菌和浸泡70%酒精，对所有手术用品、软木板和针脚进行消毒。
   3. 用五巴比妥钠（2X麻醉剂量为0.06mg/g体重）对动物进行麻醉，通过腹内注射，使用0.5 mL胰岛素注射器。
   4. 通过捏住动物的脚趾来监测麻醉水平，以检查反射反应，并在动物完全麻醉后启动治疗方案。
   5. 将动物放在背上，将附属物固定在软木板上，并用乙醇擦拭其腹部和胸部。
2. 为了从一只老鼠身上收获#2、3、4和5个MG（即8个MG，图1A），确定两条后腿之间的中线，用锋利的剪刀在腹部皮肤上做一个小切口（1厘米），然后将切口延伸到颈部^18。
3. 接下来，横向向腿部和手臂进行小切口，以便使用棉签释放皮肤。把皮肤拉开，紧紧拉伸，然后把它固定在一侧（图1B，步骤1）18。¹⁸通过切割去除MG，然后从#4腺体上取下淋巴结（图1B，步骤2，步骤2，步骤^3）18。在身体的另一侧重复该过程。
4. 收集MG组织在50 mL的4°CDulbecco的改良鹰的介质（DMEM）/营养混合物F12（F12）补充5%胎儿牛血清（FBS）和1X抗生素抗霉素（抗抗^）18。
5. 使用剃刀刀片或组织切碎器将腺体切碎 35 mm 的盘子或陶瓷板上。每五根手动切碎或组织切碎器上每轮旋转一次板，直到组织片子可以轻松通过 1 mL 微移液笔尖（±0.1 毫米/片段，图 1C）。
6. 在37°C，5%CO₂的6口低粘附盘中消化消化介质中的MG（见表1），14小时。

2. 第2天:乳腺上皮组织片段的分离

1. 消化14小时后，使用1 mL微移液器移液消化的组织10倍，轻轻混合，分解任何剩余的支马或脂肪组织，确保不产生气泡或多余的机械力。
   注:如果14小时后消化不完整，这可能是由于皮肤DNA的积累。在这种情况下，每2 mL消化介质中加入1μL1mg/mL脱氧核糖核酸I（DNase I）。在37°C，5%CO2孵育30分钟。₂
2. 在15 mL管中收集组织，用2-3 mL的组织培养等级1X Dulbecco的磷酸盐缓冲盐水（DPBS）免费卡²⁺和Mg²⁺冲洗用于消化的井。在 600 x g下离心 10 分钟。
3. 排空含有脂质层和介质的上清液，然后在5mLDPBS中重新悬浮颗粒，并切换到新的15 mL管。在 600 x g下离心 10 分钟。
4. 在离心期间，将一个70μm尼龙细胞滤网放在50 mL管中，并使用10 mL的37°C DMEM/F12预湿滤网。
5. 使用 5 mL DPBS 重新悬挂协议步骤 2.4 中的组织片段，并通过预湿 70 μm 尼龙细胞滤网通过悬浮液，去除基质细胞和单个细胞（图 1D）。
6. 收集细胞滤网上的组织碎片。用 10 mL 的 37 °C DMEM/F12（图 1D）冲洗 4X。
   注意:不完全的皮毛会导致被非上皮细胞污染的培养物。
7. 通过用戴手套的手指握住滤网标签，将滤网倒置在 60 mm 的组织培养盘中，并通过滤网底部的 1 mL 等号（见表 1），通过滤网底部 4X（图 1Figure 1E），释放组织碎片。
8. 检查滤网是否有组织碎片残留物（肉眼可见），如果任何碎片仍附着在滤网上，则使用 1 mL 的维护介质冲洗滤网 1 倍。冲洗的组织片段现在应该没有基质细胞。
9. 在倒置显微镜（4X 或 10X 目标，图 1F）下快速检查包含协议步骤 2.9 中的 MG 片段的 60 mm 盘。8个MG的典型制备会产生+500个片段。寻找单个细胞或脂肪滴，以及是否存在污染细胞。
   注:如果存在污染细胞，请重复过滤步骤，使用 5 mL 移液器从 60 mm 盘中收集介质和片段，然后通过新鲜的 70 μm 滤网再次过滤片段，重复协议步骤 2.6、2.8-2.10。
10. 在37°C下孵育24小时_，CO25%，使组织片段粘附并生成双层片段（图2A）。
    注:如果碎片在24小时前尚未沉降，继续孵育，直到粘附。如果碎片粘附良好，细胞室的分离将不起作用。如果研究人员担心粘附，组织培养板可以治疗以促进片段附着（例如，聚L-莱辛）。

3. 第3天:肌皮和光上皮细胞的微分尝试

1. 要将 MyoEC 与 LEC 分离，请从盘中清空介质，用 1 mL DPBS 冲洗 1x，并加入 1 mL 的新鲜胰蛋白酶-EDTA （0.05%），并在倒置显微镜下仔细监测消化（10 倍或 20 倍目标，图 2B、C、F）。外MyoEC层的分离将需要3-6分钟，具体取决于胰蛋白酶-EDTA （0.05%）强度。
   注: 有关显示此过程的代表性图像，请参阅图 2。在明亮场照明下，MyoEC 看起来圆润，与保持在中心且看起来更暗的 LEC 相比，其外观更明亮。
2. 在含有 2 mL 10% FBS/DPBS 的 15 mL 管中收集 MyoEC 分数。在不干扰LEC的情况下，用2 mL DPBS轻轻冲洗60毫米的盘子，然后处理DPBS（图2H-I）。
   注: MyoEC 的通常恢复范围 （3.5 x 10⁶-1.5 x 10⁶）， 具体取决于 MG 的大小。
3. 要删除 LEC 分数，请添加 1 mL 的胰蛋白酶 EDTA （0.05%）再次到菜和孵育7-15分钟，仔细监测，以防止消化过度。绞线-EDTA （0.05%）在 2 mL 的 10% FBS/DPBS 的菜上。在新的 15 mL 管中收集 LEC 分数。
   注:LEC的通常恢复是在一个范围内（2 x 10⁶-4.2 x 10^6），具体取决于MG的大小。 通常，免疫组织化学所测定的两个分数的纯度是±90%19（¹⁹图2E）。
4. 在 300 x g下将每个分数离心 5 分钟，以去除胰蛋白酶-EDTA （0.05%）。在250μL的维持介质中重新悬浮颗粒，并使用造血仪或自动细胞计数器计算每个细胞群。计数时将单元格放在冰上。
   注:如果需要对细胞分数进行基因操作，原细胞可以在低粘附性培养皿上生长，并感染扁病毒^20。

4. 第3天:在细胞外基质中结合和嵌入细胞分数

注:一旦收集并计数 MyoEC 和 LEC 分数，就可以组合它们。典型的MyoEC/LEC比率为1:3（图3A）19。¹⁹可以进行不同的研究。例如，为了进行马赛克研究，可以从野生类型 （WT） 和突变 （Mut） 小鼠生成分数并组合（MyoEC/LEC:WT/WT;WT/Mut;羊肉/WT;穆特/穆特）²¹，或分数可以组合使用不同的比例的MyoECs/LECs¹⁹。

1. 根据细胞计数，计算需要为 12，000 个细胞/孔（例如 3，000 个 MyoECs:9，000 LECs）准备的孔数（8 个井室，参见材料表）。
2. 通过在每个油井中添加 90 μL 50% ECM（50% ECM/50% DMEM/F12，不含苯酚红色 - 参见材料表），建立 3D 培养基层。确保没有气泡，井的涂层均匀。要固化基层，在 37 °C、5% CO₂孵育 30 分钟。
   注:ECM 需要保持冰冷，直到此步骤，否则它会过早聚合，并导致不均匀的基础涂层和聚合。使用基础 ECM 可增强单个平面中的器官生长，从而有助于图像捕获。这也获得更快的器官生长和使用较少的ECM^22。
3. 在聚合过程中，准备细胞混合物。在 300 x g下将 MyoEC 和 LEC 分数在 5 分钟内重悬浮每个细胞分数，并在 10% ECM/90% 生长介质中重新悬浮每个细胞分数，因此每个孔具有 100 μL（有关如何制造生长介质，请参阅表 1）。
   注:为了便于制备，使用相同的细胞混合体复制井。这些可以组合和制备在一个管中（例如，相同的细胞混合物的四口井可以在400μL的10%ECM/90%生长介质中制备）。
4. 在每个孔中加入100 μL的每个细胞混合物，在10%ECM/90%生长介质中加入，让器官在37°C、5%CO2下沉淀20₂分钟。
5. 细胞液位后，通过轻轻移液到每个井的腔壁上，轻轻加入100μL的生长介质。在 37 °C、5% CO₂孵育幻灯片（有关每个井的总组成，参见图 3A）。
   注:Rho Kinase抑制剂、R-spondin和Nrg1是被确定为对从原发性母细胞和人类乳腺癌细胞^13、14,14生长的器官的长期培养中的重要因素。此外，干细胞因子B27和N2延长了组织器官培养的时间。
6. 图像细胞每24小时跟踪其生长，并使用100 μL/well每2-3天轻轻更新生长介质（图3B-E）。
   注:更新介质时，要格外小心。倾斜造型室滑轨以收集井的一角的介质。去除介质 ±100 μL，并小心补充，使 ECM 层不受干扰。
7. 如果研究人员有兴趣研究哺乳/性发育，请在第5天切换到阿尔韦洛形成中（见表1），并每2-3天继续更新介质，直到第10天（图3F）或以后使用恢复溶液（见材料表^）13。
   注:此时，在4°C恢复溶液的400μL下孵育4°C，可以分离出器官与ECM（有关协议和试剂信息的材料表）。

5. 第5天或第10天:修复和免疫染色器官

1. 通过轻轻移液介质（灯泡移液器效果最佳），小心地去除介质。使用 200 μL 的 1x Dulbecco 的磷酸缓冲盐水冲洗每个井（DPBS，见食谱）。
2. 在室温下，使用冷（4°C）4%（w/v）甲醛（PFA，见食谱）固定10分钟。
   注意:PFA 是危险的。佩戴个人防护装备（实验室外套、手套和安全眼镜）。此步骤应在烟雾罩内执行。
   注:ECM 通过 PFA 处理溶解。通过免疫荧光分析器官时，不完全的 ECM 去除可能导致背景染色。
3. 取出 4% 的 PFA，在每个井中加入 200 μL 0.2%（v）甘氨酸/DPBS（见表 1）。在室温下孵育幻灯片 30 分钟或 4 °C，在设置为慢速的岩石表面过夜。
   注:在下一步之前，在4°C下，风琴可以在DPBS中储存1-3天。
4. 在室温下，使用 DPBS 对器官进行渗透 = 0.25% Triton X-100（PBST，参见表 1），10分钟。
5. 在DPBS中使用5%的驴血清（DS）（或其他与次生抗体的物种匹配）的血清在摇摆表面上块1小时。
   注:此步骤可在 4°C 下在摇摆表面上过夜。
6. 在 1% DS/DPBS 中制备主要抗体。每口井均使用125-200μL。通过在摇摆表面上在4°C下通宵孵育原抗体，进行免疫染色。

6. 第11天:完全免疫荧光

1. 用200μL PBST清洗每口井2X5分钟。每口井使用125-200μL在1%DS/DPBS中加入二次抗体。在岩石表面的室温下孵育45分钟。
2. 每口井使用200μL PBST清洗每口井2倍。
3. 在室温下，使用DPBS中的Hoechst DNA染料（DPBS中的1:2，000）染色核5分钟。
4. 用真空轻轻吸气，去除井上遗留的所有液体。
5. 小心地拆下腔室和垫片，在每个井上放置一滴（±30 μL）的安装介质（参见材料表）和盖玻片，注意去除气泡。让幻灯片在黑暗的空间干燥 1-2 天。用透明指甲油密封。在共聚焦显微镜上成像器官（图3E-F）。

结果

此处介绍的协议描述了一种利用马赛克器官研究乳腺上皮细胞特定系系贡献的方法。为了获得器官的原鼠细胞，必须首先从周围多球菌丰富的半胱分离（图1）。这个过程在这里被简要地描述，并在先前发表的研究¹⁸中也进行了描述。要获得足够的单元格，建议删除#2、3、4 和 5 个 MG（图 1A）。分离...

讨论

在这里，介绍了一个详细说明研究人员如何使用原质MG细胞生成3D器官培养物的方法。此协议与其他协议之间的区别是，我们详细介绍了分离两个不同的 MG 细胞舱的方法:外基底 MyoEC 和内部 LEC。我们的方法采用两步胰蛋白酶-EDTA （0.05%）治疗，我们称之为差分尝试^19。此过程允许研究人员分离 MyoE 和 LEC，而无需使用复杂的流细胞学，因此可用于研究从各种哺乳动物物种中采集的 MG...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
15 ml High-Clarity Polypropylene Conical Tube (BD Falcon)	Fisher Scientific	352096
24 well ultra-low attachment plate (Corning)	Fisher Scientific	CLS3473-24EA
35 mm TC-treated Easy-Grip Style Cell Culture Dish (BD Falcon)	Fisher Scientific	353001
50 ml High-Clarity polypropylene conical tube (BD Falcon)	Fisher Scientific	352098
60 mm TC-treated Easy-Grip Style Cell Culture Dish (BD Falcon)	Fisher Scientific	353004
70 µM nylon cell strainer (Corning)	Fisher Scientific	08-771-2
Antibiotic-Antimycotic (100X)	Thermo Fisher Scientific	15240062	Pen/Strep also works
B27 supplement without vitamin A (50x)	Thermo Fisher Scientific	12587010
B6 ACTb-EGFP mice	The Jackson Laboratory	003291
BD Insulin syringe 0.5 mL	Thermo Fisher Scientific	14-826-79
Class 2 Dispase (Roche)	Millipore Sigma	4942078001
Class 3 Collagenase	Worthington Biochemical	LS004206
Corning Cell Recovery solution	Fisher Scientific	354253	Follow the guidelines for use – Extraction of Three-Dimensional Structures from Corning Matrigel Matrix
Corning Costar Ultra-Low Attachment 6-well	Fisher Scientific	CLS3471
Dexamethasone	Millipore Sigma	D4902-25MG
DMEM/F12, no phenol red	Thermo Fisher Scientific	11039-021
DNase (Deoxyribonuclease I)	Worthington Biochemical	LS002007
Donkey anti-Goat 647	Thermo Fisher Scientific	A21447	Use at 1:500, Lot: 1608641, stock 2 mg/mL, RRID:AB_2535864
Donkey anti-Mouse 647	Jackson ImmunoResearch	715-606-150	Use at 1:1000, Lot: 140554, stock 1.4 mg/mL
Dulbecco's Modified Eagle Medium: Nutrient Mixture F-12 (DMEM/F12)	Thermo Fisher Scientific	11330-057
Dulbecco's phosphate-buffered saline (DPBS)	Thermo Fisher Scientific	14190-250	Without Mg2+/Ca2+
EGF	Fisher Scientific	AF-100-15-100ug
Fetal Bovine Serum	VWR	97068–085	100% US Origin, premium grade, Lot: 059B18
Fluoromount-G (Southern Biotech)	Fisher Scientific	0100-01	Referred to as mounting media in text
Gentamicin	Thermo Fisher Scientific	15710064
Glycine	Fisher Scientific	BP381-5
Goat anti-WAP	Santa Cruz Biotech	SC-14832	Use at 1:250, Lot: J1011, stock 200 µg/mL, RRID:AB_677601
Hoechst 33342	AnaSpec	AS-83218	Use 1:2000, stock is 20mM
Insulin	Millipore Sigma	I6634-100mg
KCl	Fisher Scientific	P217-500
KH2PO4	Fisher Scientific	P285-500
KRT14–CreERtam	The Jackson Laboratory	5107
Matrigel Growth Factor Reduced (GFR); Phenol Red-Free; 10 mL	Fisher Scientific	CB-40230C	Lot: 8204010, stock concentration 8.9 mg/mL
MillexGV Filter Unit 0.22 µm	Millipore Sigma	SLGV033RS
Millicell EZ SLIDE 8-well glass, sterile	Millipore Sigma	PEZGS0816	These chamber slides are great for gasket removal but other brands can work well (e.g. Lab Tek II).
Mouse anti-SMA	Millipore Sigma	A2547	Use at 1:500, Lot: 128M4881V, stock 5.2 mg/mL, RRID:AB_476701
N-2 Supplement (100x)	Thermo Fisher Scientific	17502048
NaCl	Fisher Scientific	S671-3
NaH2PO4	Fisher Scientific	S468-500
Nrg1	R&D	5898-NR-050
Ovine Pituitary Prolactin	National Hormone and Peptide Program		Purchased from Dr. Parlow at Harbor-UCLA Research and Education Institute
Paraformaldahyde	Millipore Sigma	PX0055-3
Pentobarbital	Millipore Sigma	P3761
R26R-EYFP	The Jackson Laboratory	6148
Rho inhibitor Y-27632	Tocris	1254
R-spondin	Peprotech	120-38
Sodium Hydroxide	Fisher Scientific	S318-500
Sterile Filtered Donkey Serum	Equitech-Bio Inc.	SD30-0500
Sterile Filtered Donkey Serum	Equitech-Bio Inc.	SD30-0500
Triton X-100	Millipore Sigma	x100-500ML	Laboratory grade
Trypsin EDTA 0.05%	Thermo Fisher Scientific	25300-062