Diferansiyel Tripsinizasyon a göre Mozaik Meme Organoidlerinin Üretimi

Özet

Meme bezi, dış miyoepitelyal ve iç luminal epitel hücrelerinden oluşan çift katmanlı bir yapıdır. Sunulan diferansiyel trippsinizasyon kullanarak organoidler hazırlamak için bir protokoldür. Bu verimli yöntem araştırmacılar ayrı ayrı meme bezi formu ve fonksiyonu rollerini ile ilgili soruları keşfetmek için bu iki hücre türleri işlemek için izin verir.

Özet

Organoidler, fizyolojik süreçleri bir yemeğin rahatlığıyla özetleyen kendi kendini organize eden, üç boyutlu doku yapıları sunar. Murine meme bezi farklı işlevlere hizmet veren iki farklı epitel hücre bölmesi oluşur: dış, kontraktil miyoepitelyal bölmesi ve iç, salgı luminal bölmesi. Burada, bu bölmelerden oluşan hücrelerin izole edildiği ve daha sonra meme bezi morfogenezine ve farklılaşmaya olan bireysel soy katkılarını araştırmak için biraraya geldiği bir yöntemi açıklıyoruz. Yöntem basit ve verimlidir ve floresan aktif hücre sıralama gibi gelişmiş ayırma teknolojileri gerektirmez. Bunun yerine, biz hasat ve enzimatik doku sindirmek, yapışık doku kültürü yemekleri üzerinde epitel tohum, ve sonra ~ 90% saflık ile luminal hücrelerden miyoepitel ayırmak için diferansiyel trippsinizasyon kullanın. Hücreler daha sonra kültürde 10 gün sonra süt üretmek için ayırt edilebilir çift katmanlı, üç boyutlu (3D) organoidler halinde organize bir hücre dışı matris plakalı. Genetik mutasyonların etkilerini test etmek için, hücreler vahşi tip veya genetiği değiştirilmiş fare modellerinden hasat edilebilir, ya da genetik olarak 3D kültürden önce manipüle edilebilir. Bu teknik, özellikle luminal veya miyoepitel bölmesi gen fonksiyonunun araştırılmasına olanak sağlayan mozaik organoidler oluşturmak için kullanılabilir.

Giriş

Meme bezi (MG) bir adiposit zengin stroma içinde gömülü bir ağaç gibi, tübüler epitel yapısıdır. İki katmanlı duktal epitel, kontraktilin dış, bazal tabakası, miyoepitel hücreleri (Myoecs) ve luminal, salgı epitel hücrelerinin (LECs) bir iç tabakası, merkezi bir lümen çevreleyen oluşur¹. Emzirme sırasında dış MiyoECs iç alveoler LECs süt sıkmak için sözleşme, MG büyüme faktörleri (örneğin, EGF ve FGF) ve hormonlar (örneğin progesteron, insülin ve prolaktin kontrolü altında olan çok sayıda değişiklik uğrar, ve prolaktin). Bu değişiklikler, emzirme döneminde sütü sentezleyen ve salgılayan özel yapılar alveollerin farklılaşmasına neden olur^1. Meme epitel deneysel ya epitel doku parçaları, hücreler, hatta tek bir bazal hücre konak meme yağ pedleri içine nakledilir teknikleri kullanılarak manipüle edilebilir, endojen meme parenkim precleared, ve bütün bir yeniden büyümeye izin, fonksiyonel epitel ağacı^2,3,4,5. Transplantasyon güçlü bir tekniktir, ancak bir mutasyonun erken embriyonik öldürücülükle sonuçlanması (E14'ten önce) nakledilebilir meme nin kurtarılmasını önlerse zaman alıcı dır ve imkansızdır. Ayrıca, araştırmacılar sık sık soy kısıtlı ata hücreleri türetilmiştir iki farklı bölmeleri, rolleri araştırmak istiyorum. Cre-lox teknolojisi MyoEC'lerin ve LED'lerin diferansiyel genetik manipülasyonuna olanak sağlarken, bu aynı zamanda zaman alan ve pahalı bir girişimdir. Böylece, 1950'lerden bu yana, araştırmacılar meme dokusu yapısı ve fonksiyonu ile ilgili soruları ele almak için nispeten kolay ve verimli bir yol olarak in vitro meme organoidler kullandık^6,7.

Birincil meme epitel hücrelerinin izolasyon ve kültürünü açıklayan erken protokollerde, araştırmacılar bir plazma pıhtısı ve tavuk embriyoekstresi oluşan bir bazal membran matris (BME), mg parçaları bir çanak yetiştirilen için gerekli olduğunu bulundu⁶. Takip eden yıllarda, hücre dışı matrisler (EcMs, kollajen, ve engelbreth-Holm-Swarm murine sarkomu hücreleri tarafından salgılanan jöle benzeri protein matris) 3D kültürü kolaylaştırmak ve daha iyi in vivo çevre⁷taklit geliştirilmiştir^,8,9,10. Birden fazla kriter (morfoloji, gen ekspresyonu ve hormon duyarlılığı) tarafından ortaya 3D matrislerde culturing hücreleri böyle bir mikroortamda vivo fizyolojik^süreçlerdedaha iyi modeller 9^,10,11,12. Birincil mindik hücreleri kullanılarak yapılan araştırmalarda, organoidlerin uzun süreli bakımı ve farklılaşması için gerekli olan temel büyüme faktörleri ve morfojenler saptandı¹³. Bu çalışmalar burada sunulan protokol için zemin hazırladık, ve 3D organoidler olarak insan meme hücrelerinin kültürü için, şimdi modern bir klinik araçtır, hasta örnekleri üzerinde ilaç keşif ve ilaç testi için izin¹⁴. Genel olarak, organoid culturing birincil hücrelerin kendi kendine organizasyon kapasiteleri ve morfogenez ve farklılaşma katkıları vurgulamaktadır.

Burada sunulan süt üreten acini içine ayırt edilebilir kültür murine epitel için bir protokoldür. İki farklı MG hücre bölmesini oluşturan MiyoEC'leri ve LEC'leri izole etmek için diferansiyel trippsinizasyon tekniği kullanılır. Bu ayrılmış hücre fraksiyonları daha sonra genetik olarak aşırı ifade veya nakavt gen fonksiyonu için manipüle edilebilir. Çünkü soy-içsel, kendi kendine organizasyon meme epitel hücrelerinin doğuştan gelen bir^{özelliğidir 15,16,17}, bu hücre fraksiyonları rekombinerek araştırmacılar çift katmanlı, mozaik organoidler oluşturmak için izin verir. Biz enzimatik yağ dokusu sindirerek başlar, ve daha sonra 24 saat için bir doku kültür çanak üzerinde meme parçaları kuluçka(Şekil 1). Doku parçaları polistiren tabaklar üzerinde iki katmanlı parçalar olarak in vivo organizasyon: iç luminal katmanları çevreleyen dış miyoepitelyal tabaka yerleşmek. Bu hücresel organizasyon, dış MiyoEC'lerin tripsin-EDTA (%0.05) ile izolasyonuna izin verir. tedavi 3-6 dk ve ardından ikinci bir tripsin-EDTA turu (%0.05) kalan iç LEC'leri ayıran tedavi (Şekil 2). Bu nedenle farklı tripsin duyarlılığı olan bu hücre tipleri izole edilir ve daha sonra ECM ile karıştırılarak kaplanabilir (Şekil 3). Hücreler, iç LEC'leri çevreleyen MiyoEC'lerin dış tabakasından oluşan iki katmanlı küreler oluşturmak için kendi kendini örgütlemeden geçerler. Lümen oluşumu hücreler büyüme faktörleri nin bir kokteyl içeren bir ortamda büyümek gibi oluşur (Büyüme Orta için tariflere bakın)¹³. 5 gün sonra, organoidler Alveologenesis Medium'a geçerek süt üreten acini'ye ayrılabilir (bkz. tarifler ve Şekil 3F)ve 5 gün daha kuluçkaya yatırılabilir. Alternatif olarak, organoidler en az 10 gün boyunca Büyüme Ortamı'nda genişlemeye ve dallanmaya devam edecektir. Organoidler immünororesans(Şekil 3D-F)kullanılarak analiz edilebilir veya ecm'den bir kurtarma solüsyonu kullanılarak serbest bırakılabilir (bkz. Malzeme Tablosu)ve diğer yöntemlerle analiz edilebilir (örn. immünoblot, RT-qPCR).

Protokol

Burada açıklanan tüm yöntemler California Üniversitesi, Santa Cruz Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (IACUC) tarafından onaylanmıştır.

1. Gün 1: Meme bezi sindirim

1. 10-14 haftalık olgun dişi farelerden MG'leri hasat etmeye hazırlanın.
   1. Aseptik koşullar altında açık bir bankta hasat gerçekleştirin.
   2. Ameliyattan önce 20 dakika boyunca %70 alkol le otoklavlama ve ıslatma ile tüm cerrahi malzemeleri, mantar panoları ve pimleri sterilize edin.
   3. 0.5 mL insülin şırınga ile intraperitoneal enjeksiyon yoluyla verilen sodyum pentobarbital (0.06 mg/g vücut ağırlığı 2X anestezik doz) ile hayvanları anestezik.
   4. Refleks yanıtı kontrol etmek için hayvanın ayak parmaklarını çimdikleyerek anestezi seviyesini izleyin ve protokolü ancak hayvan tamamen anestezi edildikten sonra başlatın.
   5. Hayvanı sırtına yerleştirin, uzantılarını mantar tahtasına sabitle ve karnını ve göğsünü etanolle silin.
2. Bir fareden (yani 8 MGs, Şekil 1A)#2 3, 4 ve 5 MG'yi hasat etmek için, iki arka bacak arasındaki orta çizgiyi belirleyin ve karın derisinde keskin makaslarla küçük bir kesi (1 cm) yapın, sonra kesiği boynuna kadar uzatın¹⁸.
3. Bir pamuklu bez kullanarak cildin serbest bırakılması için izin vermek için bacaklar ve kollar doğru yanal küçük kesimler yaparak izleyin. Deriyi çekin ve bir tarafa sabitlemeden önce sıkı bir şekilde gerin(Şekil 1B, adım 1)¹⁸. Altlarını keserek MGs çıkarın ve #4 bezlerilenf düğümleri kaldırmak(Şekil 1B, adım 2, 3)¹⁸. Vücudun diğer tarafında prosedürü tekrarlayın.
4. MG dokusunu 4 °C Dulbecco'nun Modifiye Kartal Medyasının (DMEM)/Besin Karışımı F12 (F12) 50 mL'lik kısmını %5 fetal sığır serumu (FBS) ve 1X Antibiyotik Antimikotik (Anti-Anti)¹⁸ile destekletamama .
5. Bezleri 35 mm'lik bir tabakta veya seramik bir tabakta jilet veya doku helikopteri kullanarak doğrayın. Doku parçaları 1 mL mikropipet ucuna kolaylıkla sığabilecek olana kadar plakayı her beş manuel doğrayın veya doku helikopterinin her bir yuvarlarını kolayca (~0,1 mm/fragment, Şekil 1C)döndürün.
6. Sindirim Ortamı'ndaki MG'leri sindirin (tablo 1'ebakınız) 37 °C,%5 CO_2'de6 iyi düşük yapışma kabında 14 saat boyunca .

2. Gün 2: Meme epitel doku parçalarının izolasyonu

1. 14 saat sindirimden sonra, sindirilmiş doku 10X'i 1 mL mikropipet kullanarak, kalan stroma veya yağ dokusunu parçalayarak, ne kabarcıkların ne de aşırı mekanik kuvvetin üretilmesini sağlayarak hafifçe karıştırın.
   NOT: 14 saat sonra eksik sindirim varsa, bu yıkınan DNA birikimi nedeniyle olabilir. Bu durumda, Sindirim Ortamı 2 mL başına 1 mg/mL deoksiribononükle 1 (DNase I) ekleyin. 37 °C'de 30 dk daha kuluçka, %5 CO₂.
2. 15 mL'lik bir tüpte doku ları toplayın ve sindirim için kullanılan 1X Dulbecco'nun Fosfat Tamponlu Salini (DPBS) ca²⁺ ve Mg²⁺içermeyen 2-3 mL doku kültürü ile durulayın. 10 dk için 600 x g santrifüj.
3. Lipid tabakası ve orta içeren supernatant boşaltın ve daha sonra DPBS 5 mL pelet resuspend ve yeni bir 15 mL tüp geçmek. 10 dk için 600 x g santrifüj.
4. Santrifüj sırasında 50 mL'lik bir tüpe 70 m naylon hücreli süzgeç yerleştirin ve süzgeci 10 mL 37 °C DMEM/F12 kullanarak önceden ıslayın.
5. 5 mL DPBS kullanarak protokol adım 2.4 doku parçalarını yeniden askıya alın ve stromal hücreleri ve tek hücreleri temizlemek için süspansiyonu önceden ıslak 70 μm naylon hücresüzden geçirin(Şekil 1D).
6. Hücre süzgecindeki doku parçalarını toplayın. 10 mL 37 °C DMEM/F12(Şekil 1D)ile 4X durulayın.
   DİkKAT: Eksik durulama, epitel olmayan hücrelerle kontamine olmuş kültürlere neden olur.
7. Süzgeç sekmesini eldivenli parmaklarla tutarak, süzgecin 60 mm'lik doku kültür çanağı üzerinde ters çevrilerek ve 1 mL aliquot'u Bakım Ortamı'ndan geçirerek doku parçalarını serbest bırakın (Bkz. Tablo 1) süzgeç 4X'in altından(Şekil 1E).
8. Çıplak gözle görülebilecek doku parçası kalıntıları için süzgecin imasını kontrol edin ve süzgeci 1 mL Bakım Ortamı ile 1 x daha fazla durula. Durulanan doku parçaları artık stromal hücrelerden arındırılmış olmalıdır.
9. Protokol adımı 2.9'dan MG parçalarını içeren 60 mm'lik kabı ters bir mikroskop altında (4X veya 10X objective, Şekil 1F)hızlı bir şekilde inceleyin. Sekiz MGs tipik bir hazırlık ~ 500 parçaları verir. Tek hücre veya yağ damlacıkları ve kirletici hücreler olup olmadığını arayın.
   NOT: Kirlenen hücreler varsa, 60 mm'lik çanaktan orta ve parçaları 5 mL pipet kullanarak toplayarak ve parçayı 70 m'lik taze bir süzgeçten tekrar filtreleyerek 2.6, 2.8-2.10 protokol adımlarını tekrarlayarak filtrasyon adımını tekrarlayın.
10. 37 °C'de 24 saat kuluçka, %5 CO₂, doku parçasının yapışmasını ve çift katmanlı parçalar üretmesini sağlar(Şekil 2A).
    NOT:Parçalar 24 saate kadar yerleşmemişse, yapıştırılınana kadar kuluçkaya yatırmaya devam edin. Parçalar iyi yapışmazsa, hücre bölmelerinin ayrılması çalışmaz. Araştırmacılar yapışma konusunda endişeleriniz varsa, doku kültürü plakaları parça eki (örneğin, poli-L-lizin) teşvik etmek için tedavi edilebilir.

3. Gün 3: Miyoepitelyal ve luminal epitel hücrelerinin diferansiyel tripsinizasyonu

1. MiyoEC'leri LED'lerden ayırmak için, ortamı yemekten boşaltın, 1 mL DPBS ile 1 x durulayın ve 1 mL taze tripsin-EDTA (%0,05) ekleyin ve ters bir mikroskop altında (10X veya 20X hedefi, Şekil 2B,C,F)altında sindirimi dikkatle izleyin. Dış MyoEC tabakasının ayrılması, tripsin-EDTA (%0.05) bağlı olarak 3-6 dakika gerektirir Gücü.
   NOT: Bu işlemi gösteren temsili görüntüler için lütfen Şekil 2'ye bakın. Brightfield aydınlatma altında, MyoECs yuvarlak görünür ve LED'ler ile karşılaştırıldığında daha parlak bir görünüme sahip, hangi merkezinde bağlı kalır ve koyu görünür.
2. 2 mL %10 FBS/DPBS içeren 15 mL'lik bir tüpte MyoEC fraksiyonu toplayın. LED'leri rahatsız etmeden, 60 mm'lik kabı 2 mL DPBS ile hafifçe durulayın ve DPBS'yi atın(Şekil 2H-I).
   NOT: MyoECs için olağan kurtarma (3.5 x 10⁶-1.5 x 10⁶) MGs boyutuna bağlı olarak bir aralık içindedir.
3. LEC fraksiyonu kaldırmak için 1 mL tripsin-EDTA (%0.05) ekleyin tekrar çanak ve kuluçka 7-15 dk, dikkatle aşırı hazımsızlığı önlemek için izleme. Tripsin-EDTA'yı söndürmek (%0.05) %10 FBS/DPBS 2 mL ile çanak üzerinde. Yeni bir 15 mL tüp LEC fraksiyonu toplamak.
   NOT: LED'ler için olağan iyileşme bir aralık içindedir (2 x 10⁶-4.2 x 10⁶) MG'lerin boyutuna bağlı olarak. Rutin olarak, immünohistokimya tarafından titreyen her iki fraksiyonun saflığı ~%90¹⁹ 'dur(Şekil 2E).
4. Tripsin-EDTA'yı (%0.05) çıkarmak için 300 x g'da 5 dk için her fraksiyonu santrifüj edin. 250 μL'lik Maintenance Medium'da peleti yeniden askıya alın ve her hücre popülasyonunu hemositometre veya otomatik hücre sayacı kullanarak sayın. Sayarken hücreleri buzüzerine yerleştirin.
   NOT: Hücre fraksiyonlarının genetik manipülasyonu isteniyorsa, primer hücreler düşük yapışma yemeklerinde yetiştirilebilir ve lentivirus²⁰ile enfekte edilebilir.

4. Gün 3: Hücre fraksiyonlarını hücre dışı bir matriste birleştirme ve yerleştirme

NOT: MyoEC ve LEC fraksiyonları toplandıktan ve sayıldıktan sonra birleştirilebilir. Tipik MyoEC/LEC oranı 1:3 'dür (Şekil 3A)¹⁹. Farklı çalışmalar yapılabilir. Örneğin, mozaik çalışmaları gerçekleştirmek için, kesirler yabani tip (WT) ve mutant (Mut) farelerden oluşturulabilir ve kombine edilebilir (MyoEC/LEC: WT/WT; WT/Mut; Mut/WT; Mut/Mut)²¹veya kesirler MiyoECs/LECs¹⁹farklı oranlarda kullanılarak kombine edilebilir.

1. Hücre sayılarına göre, 12.000 hücre/kuyu için hazırlanması gereken kuyu sayısını (8 kuyu odası, bkz. Malzeme Tablosu)hesaplayın (örn. 3.000 MyoEC:9.000 LEC).
2. Her kuyuya %50 ECM (%50 ECM/50 DMEM/F12) 90 μL ekleyerek 3D kültür için Table of Materialstaban katmanını kurun. Hiçbir kabarcıklar ve kuyular eşit olarak kaplanır olduğundan emin olun. Taban tabakasını sağlamlaştırmak için, slaytları 37 °C'de, %5 CO_2'yi 30 dk'da kuluçkaya yatırın.
   NOT: ECM'nin bu adıma kadar buz gibi kalması gerekir, aksi takdirde erken polimerize olur ve pürüzlü taban kaplamave polimerizasyona yol açar. Bir taban ECM kullanarak tek bir düzlemde organoid büyümesini artırır, hangi görüntü yakalama yardımcı olur. Bu da daha hızlı organoid büyüme elde eder ve daha az ECM^{kullanır 22.}
3. Polimerizasyon sırasında hücre karışımlarını hazırlayın. Pelet MyoEC ve LEC fraksiyonları 300 x g için 5 dakika ve her hücre fraksiyonu askıya 10% ECM/90% Büyüme Orta böylece her iyi 100 μL (Büyüme Orta yapmak için nasıl Tablo 1 bakınız).
   NOT: Hazırlık kolaylığı için, aynı hücre karışımları kullanarak kuyuçoğaltmak. Bunlar bir tüp halinde birleştirilebilir ve hazırlanabilir (örneğin, aynı hücre karışımının dört kuyusu 400 μL %10 ECM/90% Büyüme Ortamı'nda hazırlanabilir).
4. Her hücre karışımından 100 μL'yi %10 ECM/90% Büyüme Ortamı'na ekleyin ve organoidlerin 37 °C'de 20 dk, %5 CO_2'yeyerleşmelerine izin verin.
5. Hücreler yerleştikten sonra, her kuyunun hazne duvarını yavaşça borulayarak 100 μL'lik Büyüme Ortamı ekleyin. Slaytları 37 °C, %5 CO_2'de kuluçkaya yatırın (her kuyunun toplam bileşimi için Şekil 3A'ya bakınız).
   NOT: Rho Kiazaz inhibitörü, R-spondin ve Nrg1 hem primer meme hücreleri hem de insan meme kanseri hücrelerinden yetiştirilen organoidlerin uzun vadeli kültür için önemli olarak tespit edilmiştir faktörlerdir^13,14. Buna ek olarak, kök hücre faktörleri B27 ve N2 organoidler kültürlü olabilir süresini uzatmak.
6. Görüntü hücreleri büyümelerini izlemek ve 100 μL/iyi kullanarak her 2-3 günde bir Büyüme Ortamını yavaşça yenilemek için her 24 saatte bir(Şekil 3B-E).
   NOT: Ortamı yenilerken aşırı özen kullanın. Kuyuların bir köşesinde orta toplamak için oda slaytlar tilt. Ortamın ≤100 μL'sini çıkarın ve ECM tabakasını rahatsız edilmeden bırakmaya özenle doldurulun.
7. Araştırmacılar emzirme/alveologenez araştırmakla ilgileniyorsa,Figure 3F^5. Table 1 Table of Materials
   NOT: Bu noktada, organoidler 4 °C'de 400 μL'lik 4 °C'de kuluçkaya yatarak ECM'den izole edilebilirler (protokol ve reaktif bilgileri için Malzeme Tablosu'na bakınız).

5. Gün 5 veya 10: Sabitleme ve immünboyama organoidler

1. Ortamı hafifçe boruyla çalarak dikkatlice çıkarın (ampul pipeti en iyi şekilde çalışır). 1x Dulbecco'nun Fosfat Tamponlu Salin (DPBS, tariflere bakın) 200 μL'lik 200 μL'lik bir kısmını iyi durula.
2. Organoidleri oda sıcaklığında 10 dakika soğuk (4 °C) 4% (w/v) paraformaldehit (PFA, bkz. tarifler) kullanarak düzeltin.
   DİkKAT: PFA tehlikelidir. Kişisel koruyucu ekipman (laboratuvar önlüğü, eldiven ve güvenlik gözlükleri) giyin. Bu adım bir duman başlık içinde yapılmalıdır.
   NOT: ECM PFA tedavisi ile çözülür. Organoidler immünofloresan siniflar idardi edildiğinde eksik ECM çıkarılması arka plan boyamayol açabilir.
3. %4'lük PFA'yı çıkarın ve her kuyuya %0,2 (w/v) glisin/DPBS 200 μL ekleyin (tablo 1'ebakınız). Slaytları oda sıcaklığında bir gecede 30 dakika veya 4 °C'de sallanan bir yüzeye tüphaline koyun.
   NOT: Organoidler bir sonraki adımdan önce 4 °C'de DPBS'de 1-3 gün saklanabilir.
4. DPBS + %0.25 Triton X-100 (PBST, bakınız Tablo 1)kullanarak organoidleri oda sıcaklığında 10 dakika geçirin.
5. DPBS'de sallanan bir yüzeyde 1 saat boyunca %5 eşek serumu (DS) (veya ikincil antikor türüne uyan başka bir serum) kullanarak organoidleri engelleyin.
   NOT: Bu adım bir gecede 4 °C'de sallanan bir yüzeyüzerinde yapılabilir.
6. Primer antikorları %1 DS/DPBS olarak hazırlayın. Her kuyu için 125-200 μL kullanın. Bir gecede 4 °C'de birincil antikordaki organoidleri sallanan bir yüzeyde kuluçkaya yatırarak immünoboyama yapın.

6. Gün 11: Komple immünofloresans

1. Her 2X'i 5 dk boyunca 200 μL PBST ile yıkayın. Her kuyu için 125-200 μL kullanarak %1 DS/DPBS'de ikincil antikor ekleyin. 45 dakika boyunca sallanan bir yüzeyüzerinde oda sıcaklığında kuluçka.
2. Her 200 μL PBST'yi iyi kullanarak her 2X iyi yıkayın.
3. Oda sıcaklığında 5 dakika boyunca DPBS'de (DPBS'de 1:2.000) Hoechst DNA boyası kullanarak çekirdekleri lekelayın.
4. Bir vakum ile hafifçe emerek kuyuda kalan tüm sıvıyı çıkarın.
5. Odaları ve contayı dikkatlice çıkarın, kabarcıkları temizlemeye özen tayarak, her kuyuya ve kapak kaymasına bir damla montaj ortamı (~30°L) Table of Materialsyerleştirin. 1-2 gün boyunca karanlık bir alanda slayt kurumasını bekleyin. Açık oje ile mühür. Organoidleri konfokal mikroskop üzerinde görüntüleyin (Şekil 3E-F).

Sonuçlar

Burada sunulan protokol, mozaik organoidlerden yararlanılarak meme epitel hücrelerinin belirli soy katkılarını araştırmak için kullanılan bir yöntemi açıklamaktadır. Organoidler için primer minros hücreleri elde etmek için, meme bezi epiteli öncelikle çevredeki adiposit bakımından zengin stromadan izole edilmelidir (Şekil 1). Bu süreç burada kısaca açıklanmıştır ve daha önce yayınlanmış bir çalışmada¹⁸

Tartışmalar

Burada, araştırmacıların birincil MG hücrelerini kullanarak 3D organoid kültürleri nasıl üretebildiğini anlatan bir yöntem sunulmuştur. Bu ve diğer protokoller arasındaki fark, iki ayrı MG hücre bölmesi ayırmak için bir yöntem detay olmasıdır: dış bazal MiyoECs ve iç LECs. Yöntemimiz iki aşamalı tripsin-EDTA (%0.05) kullanır diferansiyel tripsinizasyon dediğimiz tedavi¹⁹. Bu prosedür, araştırmacıların gelişmiş akış sitometrisi kullanmadan MiyoeC'leri ve LEC'l...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
15 ml High-Clarity Polypropylene Conical Tube (BD Falcon)	Fisher Scientific	352096
24 well ultra-low attachment plate (Corning)	Fisher Scientific	CLS3473-24EA
35 mm TC-treated Easy-Grip Style Cell Culture Dish (BD Falcon)	Fisher Scientific	353001
50 ml High-Clarity polypropylene conical tube (BD Falcon)	Fisher Scientific	352098
60 mm TC-treated Easy-Grip Style Cell Culture Dish (BD Falcon)	Fisher Scientific	353004
70 µM nylon cell strainer (Corning)	Fisher Scientific	08-771-2
Antibiotic-Antimycotic (100X)	Thermo Fisher Scientific	15240062	Pen/Strep also works
B27 supplement without vitamin A (50x)	Thermo Fisher Scientific	12587010
B6 ACTb-EGFP mice	The Jackson Laboratory	003291
BD Insulin syringe 0.5 mL	Thermo Fisher Scientific	14-826-79
Class 2 Dispase (Roche)	Millipore Sigma	4942078001
Class 3 Collagenase	Worthington Biochemical	LS004206
Corning Cell Recovery solution	Fisher Scientific	354253	Follow the guidelines for use – Extraction of Three-Dimensional Structures from Corning Matrigel Matrix
Corning Costar Ultra-Low Attachment 6-well	Fisher Scientific	CLS3471
Dexamethasone	Millipore Sigma	D4902-25MG
DMEM/F12, no phenol red	Thermo Fisher Scientific	11039-021
DNase (Deoxyribonuclease I)	Worthington Biochemical	LS002007
Donkey anti-Goat 647	Thermo Fisher Scientific	A21447	Use at 1:500, Lot: 1608641, stock 2 mg/mL, RRID:AB_2535864
Donkey anti-Mouse 647	Jackson ImmunoResearch	715-606-150	Use at 1:1000, Lot: 140554, stock 1.4 mg/mL
Dulbecco's Modified Eagle Medium: Nutrient Mixture F-12 (DMEM/F12)	Thermo Fisher Scientific	11330-057
Dulbecco's phosphate-buffered saline (DPBS)	Thermo Fisher Scientific	14190-250	Without Mg2+/Ca2+
EGF	Fisher Scientific	AF-100-15-100ug
Fetal Bovine Serum	VWR	97068–085	100% US Origin, premium grade, Lot: 059B18
Fluoromount-G (Southern Biotech)	Fisher Scientific	0100-01	Referred to as mounting media in text
Gentamicin	Thermo Fisher Scientific	15710064
Glycine	Fisher Scientific	BP381-5
Goat anti-WAP	Santa Cruz Biotech	SC-14832	Use at 1:250, Lot: J1011, stock 200 µg/mL, RRID:AB_677601
Hoechst 33342	AnaSpec	AS-83218	Use 1:2000, stock is 20mM
Insulin	Millipore Sigma	I6634-100mg
KCl	Fisher Scientific	P217-500
KH2PO4	Fisher Scientific	P285-500
KRT14–CreERtam	The Jackson Laboratory	5107
Matrigel Growth Factor Reduced (GFR); Phenol Red-Free; 10 mL	Fisher Scientific	CB-40230C	Lot: 8204010, stock concentration 8.9 mg/mL
MillexGV Filter Unit 0.22 µm	Millipore Sigma	SLGV033RS
Millicell EZ SLIDE 8-well glass, sterile	Millipore Sigma	PEZGS0816	These chamber slides are great for gasket removal but other brands can work well (e.g. Lab Tek II).
Mouse anti-SMA	Millipore Sigma	A2547	Use at 1:500, Lot: 128M4881V, stock 5.2 mg/mL, RRID:AB_476701
N-2 Supplement (100x)	Thermo Fisher Scientific	17502048
NaCl	Fisher Scientific	S671-3
NaH2PO4	Fisher Scientific	S468-500
Nrg1	R&D	5898-NR-050
Ovine Pituitary Prolactin	National Hormone and Peptide Program		Purchased from Dr. Parlow at Harbor-UCLA Research and Education Institute
Paraformaldahyde	Millipore Sigma	PX0055-3
Pentobarbital	Millipore Sigma	P3761
R26R-EYFP	The Jackson Laboratory	6148
Rho inhibitor Y-27632	Tocris	1254
R-spondin	Peprotech	120-38
Sodium Hydroxide	Fisher Scientific	S318-500
Sterile Filtered Donkey Serum	Equitech-Bio Inc.	SD30-0500
Sterile Filtered Donkey Serum	Equitech-Bio Inc.	SD30-0500
Triton X-100	Millipore Sigma	x100-500ML	Laboratory grade
Trypsin EDTA 0.05%	Thermo Fisher Scientific	25300-062