JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Мэммарийская железа представляет собой двухслойную структуру, состоящую из внешних миоэпителиальных и внутренних светящихся эпителиальных клеток. Представлен протокол для подготовки органоидов с использованием дифференциальной трипсинизации. Этот эффективный метод позволяет исследователям отдельно манипулировать этими двумя типами клеток, чтобы исследовать вопросы, касающиеся их роли в форме и функции молочной железы.

Аннотация

Органоиды предлагают самоорганизующиеся, трехмерные структуры тканей, которые повторяют физиологические процессы в удобстве блюда. Мюринная молочная железа состоит из двух различных эпителиальных клеточных отсеков, обслуживающих различные функции: внешний, сократительный миоэпителиальный отсек и внутренний, секреторный светящийся отсек. Здесь мы описываем метод, с помощью которого клетки, составляющие эти отсеки, изолированы, а затем объединены для исследования их индивидуального вклада в родословную для морфогенеза молочной железы и дифференциации. Метод прост и эффективен и не требует сложных технологий разделения, таких как флуоресценция активированной сортировки клеток. Вместо этого, мы урожай и ферментативно переварить ткани, семена эпителия на приверженных тканях культуры блюда, а затем использовать дифференциальной трипсинизации отделить миоэпителия от светящихся клеток с й90% чистоты. Клетки затем покрываются ввнеклеточной матрицы, где они организуются в двухслойные, трехмерные (3D) органоиды, которые могут быть дифференцированы для производства молока после 10 дней в культуре. Чтобы проверить влияние генетических мутаций, клетки могут быть собраны из диких типов или генетически модифицированных моделей мыши, или они могут быть генетически манипулировать до 3D культуры. Этот метод может быть использован для генерации мозаичных органоидов, которые позволяют исследования функции генов именно в светящейся или миоэпителиальной отсеке.

Введение

Мэммарийская железа (MG) представляет собой дерево-как, трубчатая эпителиальная структура встроенных в адипоцит богатых стромы. Двухслойный протоковый эпителий включает в себя внешний, базальный слой сократительных, миоэпителиальных клеток (MyoECs) и внутренний слой светящихся, секреторных эпителиальных клеток (LECs), опоясывая центральный просвет1. Во время лактации, когда внешние MyoECs контракт выжать молоко из внутренних альвеолярных LECs, MG претерпевает многочисленные изменения, которые находятся под контролем факторов роста (например, EGF и FGF) и гормоны (например, прогестерон, инсулин и пролактин). Эти изменения вызывают дифференциацию специализированных структур, альвеолы, которые синтезируют и выделяют молоко во время лактации1. Мэммарий эпителия может быть экспериментально манипулировать с помощью методов, в которых либо эпителиальной ткани фрагменты, клетки, или даже одной базальной клетки пересаживаются в принимающей молочной жировых прокладок, предочищенные эндогенной молочной паренхии, и позволили вырасти, чтобы восстановить весь, функциональный эпителиевдерево дерево2,3,,5.5 Трансплантация является мощным методом, но это отнимает много времени и невозможно, если мутация приводит к ранней эмбриональной летальности (до E14), что предотвращает спасение трансплантации молочной анлечы. Кроме того, исследователи часто хотят исследовать роль двух различных отсеков, которые являются производными от линии ограниченных клеток-прародителей. В то время как технология Cre-lox позволяет дифференциальные генетические манипуляции MyoECs и LECs, это также трудоемкое и дорогостоящее предприятие. Таким образом, с 1950-х годов, исследователи использовали в пробирке молочных органоидов в качестве относительно простого и эффективного способа решения вопросов, касающихся структуры ткани молочной железы и функции6,7.

В ранних протоколах, описывающих изоляцию и культуру первичных эпителиальных клеток молочной железы, исследователи обнаружили, что мембранная матрица подвала (BME), состоящая из плазменного сгустка и экстракта куриного эмбриона, была необходима для фрагментов MG, выращенных на блюде6. В последующие десятилетия, внеклеточные матрицы (ECMs, коллаген, и желеобразная белковая матрица, выделяемая клетками саркомы Engelbreth-Holm-Swarm) были разработаны для облегчения 3D-культуры и лучше имитировать среду vivo7,8,9,10. Культивирование клеток в 3D-матрицах выявлено по нескольким критериям (морфология, экспрессия генов и гормональной реакции), что такая микросреда лучше моделиирует в виво физиологических процессов9,10,11,12. Исследования с использованием первичных муринных клеток определили ключевые факторы роста и морфогены, необходимые для длительного обслуживания и дифференциации органоидов13. Эти исследования задали основу для протокола, представленного здесь, и для культуры клеток молочной железы человека, как 3D органоидов, который в настоящее время современный клинический инструмент, позволяющий для обнаружения наркотиков и тестирования на наркотики на пациента образцов14. В целом, органоидный культивирование подчеркивает возможности самоорганизации первичных клеток и их вклад в морфогенез и дифференциацию.

Представлено здесь протокол к культуре мурин эпителии, которые могут быть дифференцированы в молочно-производящих ацини. Дифференциальная методика трипсинизации используется для изоляции MyoECs и LECs, которые состоят из двух различных отсеков ячейки MG. Эти разделенные фракции клетки можно провести генетические манипуляции, чтобы переэкспрессировать или нокдаун генной функции. Потому что родословная-внутренняя, самоорганизация является врожденным свойством молочных эпителиальных клеток15,,16,,17, рекомбинация этих клеточных фракций позволяет исследователям генерировать двуслойные, мозаичные органоиды. Начинаем с ферментативного переваривания жировой ткани, а затем инкубации фрагментов молочной ткани на блюдо культуры тканей на 24 ч(рисунок 1). Фрагменты ткани оседают на полистироловых посудах в виде двухслойных фрагментов с их организацией in vivo: внешний миоэпителиальный слой, окружающий внутренние светящиеся слои. Эта клеточная организация позволяет изоляции внешних MyoECs трипсин-EDTA (0.05%) лечение 3-6 мин с последующим вторым раундом трипсина-ЭДТА (0.05%) лечение, которое отсоединяет оставшиеся внутренние LECs(Рисунок 2). Таким образом, эти типы клеток с различной чувствительностью трипсина изолированы и впоследствии могут быть смешаны и покрыты eCM(рисунок 3). Клетки подвергаются самоорганизации для формирования двухслойных сфер, включающих внешний слой MyoECs, окружающих внутренние LECs. Образование люмен происходит, как клетки растут в среде, содержащей коктейль факторов роста (см. рецепты для роста Medium)13. После 5 дней, органоиды могут быть дифференцированы в молочно-производящих ацини, переключившись на Alveologenesis Medium (см. рецепты и рисунок 3F) и инкубируется еще на 5 дней. Кроме того, органоиды будут продолжать расширяться и ветвиться в рост средних, по крайней мере 10 дней. Органоиды могут быть проанализированы с помощью иммунофлуоресценции(рисунок 3D-F) или освобождены от ECM с помощью решения восстановления (см. Таблица материалов)и проанализированы с помощью других методов (например, иммуноблот, RT-qPCR).

протокол

Все методы, описанные здесь, были одобрены Институциональным комитетом по уходу за животными и использованию (IACUC) Калифорнийского университета в Санта-Крус.

1. День 1: Пищеварение молочной железы

  1. Приготовьтесь собирать MGs от зрелых самок мышей 10-14 недель возраста.
    1. Выполните уборку на открытой скамейке в асептических условиях.
    2. Стерилизовать все хирургические принадлежности, пробковые доски и булавки путем автоклавирования и замачивания в 70% алкоголя в течение 20 минут до операции.
    3. Анестезия животных с пентобарбиталом натрия (2X анестезирующей дозы 0,06 мг/г массы тела) доставлены через интраперитонеальной инъекции с 0,5 мл инсулина шприца.
    4. Мониторинг уровня анестезии, щипать пятки животного, чтобы проверить на рефлекторный ответ и начать протокол только после того, как животное полностью анестезируется.
    5. Поместите животное на спину, прикрепите его придатки к пробковой доске, и протрите его живот и грудь с этанолом.
  2. Чтобы собрать #2, 3, 4 и 5 MGs от одной мыши (т.е., 8 MGs, Рисунок 1A), определить средней линии между двумя задними ногами и сделать небольшой разрез (1 см) на брюшной коже с острыми ножницами, а затем продлить разрез до шеи18.
  3. Последующие путем принятия небольших сокращений боковой к ногам и рукам, чтобы обеспечить освобождение кожи с помощью ватного тампона. Вытяните кожу прочь и растянуть его плотно, прежде чем прикрепить его вниз на одной стороне (Рисунок 1B, шаг 1)18. Удалите MGs, разрезая под ними, и удалить лимфатические узлы из #4 желез(Рисунок 1B, шаги 2, 3)18. Повторите процедуру на другой стороне тела.
  4. Соберите ткани MG в 50 мл 4 КС Dulbecco в модифицированных Eagle's Media (DMEM) / Питательные смеси F12 (F12) дополнены 5% плода бычьей сыворотки (FBS) и 1X антибиотик-антимикотических (Анти-Анти)18.
  5. Нарезать железы в 35 мм блюдо или на керамической пластине с помощью лезвия бритвы или ткани измельчитель. Поверните пластину каждые пять ручных отбивных или каждый раунд на измельчитель ткани, пока ткани части могут поместиться через 1 мл микропайпет апогея с легкостью (0,1 мм / фрагмент, Рисунок 1C).
  6. Digest MGs в пищеварение medium (см. Таблица 1) для 14 ч в 6 хорошо низкой адгезии блюдо на 37 градусов по Цельсию, 5% CO2.

2. День 2: Изоляция фрагментов эпителиальной ткани молочной железы

  1. После 14 ч пищеварения, аккуратно перемешать путем pipetting переваренной ткани 10X с помощью 1 мл микропайпетта, чтобы сломать все оставшиеся стромы или жировой ткани, гарантируя, что ни пузырьки, ни избыток механической силы генерируются.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Если есть неполное пищеварение после 14 ч, это может быть связано с накоплением сколы ДНК. В этом случае добавьте 1 кл/ 1 мг/мл дезоксирибонулеI I (DNase I) на 2 мл пищеварения Medium. Инкубировать еще 30 мин при 37 градусах Цельсия, 5% CO2.
  2. Соберите ткани в трубке 15 мл и промыть хорошо используется для пищеварения с 2-3 мл ткани культуры класса 1X Dulbecco в фосфат буферный солин (DPBS) без Ca2 "и Mg2 ". Центрифуга при 600 х г в течение 10 мин.
  3. Эвакуируйте супернатант, содержащий липидный слой и средний, а затем приостановите гранулы в 5 мл DPBS и переключитесь на новую трубку 15 мл. Центрифуга при 600 х г в течение 10 мин.
  4. Во время центрифугации поместите 70 мкм нейлоновой сетки в трубку 50 мл и prewet ситечко с помощью 10 мл 37 КС DMEM/F12.
  5. Resuspend фрагменты ткани из протокола шаг 2.4 с помощью 5 мл DPBS и пройти подвески через prewet 70 мкм нейлоновой клетки ситечко для удаления стромальных клеток и одиночных клеток (Рисунок 1D).
  6. Соберите фрагменты ткани на клеточном ситечко. Промыть 4X с 10 мл 37 КК DMEM/F12(рисунок 1D).
    ВНИМАНИЕ: Неполное промывка приведет к культуре, загрязненной неэпителиальными клетками.
  7. Отпустите фрагменты ткани, удерживая ситечко с перчатками пальцами, инвертируя ситечко над 60 мм ткани культуры блюдо и прохождения 1 мл aliquots обслуживания среднего (см. Таблица 1) через дно ситечко 4X (Рисунок 1E).
  8. Проверьте ситечко на наличие остатков фрагмента ткани, которые будут видны невооруженным глазом, и промойте ситечко 1X больше с 1 мл обслуживания среднего, если какие-либо фрагменты все еще придерживаются ситечко. Фрагменты промытых тканей теперь должны быть свободны от стромальных клеток.
  9. Быстро изучить 60 мм блюдо, содержащее фрагменты MG из протокола шаг 2.9 под перевернутым микроскопом (4X или 10X цель, Рисунок 1F). Типичная подготовка восьми MGs дает 500 фрагментов. Ищите одиночные клетки или капли жира и есть ли загрязняющие клетки.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Если есть загрязняющие клетки, повторите этап фильтрации, собрав среду и фрагменты из 60-мм тарелки с помощью пипетки 5 мл и фильтруя фрагмент снова через свежий 70 мкм ситечко, повторяя протокол шаги 2.6, 2.8-2.10.
  10. Инкубировать 24 ч при 37 градусах Цельсия, 5% CO2,что позволяет фрагменту ткани придерживаться и генерировать двуслойные фрагменты(рисунок 2A).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Если фрагменты не поселились на 24 ч, продолжайте инкубировать до тех пор, пока не будут соблюдены. Если фрагменты не прилипают хорошо, разделение клеточных отсеков не будет работать. Если исследователи обеспокоены слипа, пластины культуры тканей можно лечить для содействия фрагмента крепления (например, поли-L-лизин).

3. День 3: Дифференциальная трипсизационизация миоэпителиальных и светящихся эпителиальных клеток

  1. Чтобы отделить MyoECs от LECs, опорожнить средства массовой информации от блюда, промыть 1x с 1 мл DPBS и добавить 1 мл свежего трипсина-EDTA (0,05%), и тщательно контролировать пищеварение под перевернутым микроскопом (10X или 20X цель, Рисунок 2B, C , F). Отслоение внешнего слоя MyoEC потребует 3-6 мин, в зависимости от трипсина-EDTA (0.05%) Силы.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Пожалуйста, смотрите рисунок 2 для репрезентативных изображений, показывающих этот процесс. Под яркой подсветкой поля, MyoECs появляются округлые и имеют более яркий вид по сравнению с LECs, которые остаются придерживаться в центре и появляются темнее.
  2. Соберите фракцию MyoEC в трубке 15 мл, содержащей 2 мл 10% FBS/DPBS. Не нарушая LECs, аккуратно промыть 60 мм блюдо с 2 мл DPBS, а затем распоряжаться DPBS(Рисунок 2H-I).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Обычное восстановление для MyoECs находится в пределах (3,5 х 106-1,5 х 106)в зависимости от размера MGs.
  3. Чтобы удалить фракцию LEC, добавьте 1 мл трипсина-EDTA (0.05%) к блюду снова и инкубировать 7-15 мин, тщательно контролируя, чтобы предотвратить переварение желудка. Утолить трипсин-EDTA (0.05%) на блюдо с 2 мл 10% FBS/DPBS. Соберите фракцию LEC в новой трубке 15 мл.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Обычное восстановление для LECs находится в пределах (2 х 10-4,2х 106) в зависимости от размера MGs. Обычно, чистота обеих фракций, как анализ иммуногистохимии составляет 90%19 (Рисунок 2E).
  4. Центрифуга каждой фракции в течение 5 мин при 300 х г, чтобы удалить трипсин-EDTA (0,05%). Приостановите действие гранул ы в 250 л среднего обслуживания и подсчитайте каждую популяцию клеток с помощью гемоцитометра или автоматизированного счетчика клеток. Поместите клетки на лед во время подсчета.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Если генетическая манипуляция клеточных фракций желательно, первичные клетки могут быть выращены на низких стыковых блюд и инфицированы лентивирусом20.

4. День 3: Объединение и встраивание клеточных фракций во внеклеточной матрице

ПРИМЕЧАНИЕ: После того, как фракции MyoEC и LEC были собраны и подсчитаны, они могут быть объединены. Типичное соотношение MyoEC/LEC составляет 1:3(Рисунок 3А)19. Различные исследования могут быть выполнены. Например, для проведения мозаичных исследований фракции могут образовываться из диких мышей типа (WT) и мутантов (Mut) и комбинированных (MyoEC/LEC: WT/WT; WT/Mut; Mut/WT; Mut/Mut)21, или фракции могут быть объединены с помощью различных соотношений MyoECs / LECs19.

  1. На основе количества клеток, рассчитать количество скважин (8 хорошо камеры, см. Таблица материалов), которые должны быть подготовлены для 12000 ячеек / хорошо (например, 3000 MyoECs:9,000 LECs).
  2. Установите базовый слой для 3D-культуры, добавив 90 кЛ 50% ECM (50% ECM/50% DMEM/F12, без фенола красного - см. Таблицу Материалов) к каждому колодцу. Убедитесь, что нет пузырьков и скважины покрыты равномерно. Чтобы укрепить базовый слой, инкубировать слайды при 37 градусах Цельсия, 5% CO2 в течение 30 мин.
    ПРИМЕЧАНИЕ: ECM должен оставаться ледяной до этого шага, в противном случае он будет полимеризации преждевременно и привести к неравномерному базовому покрытию и полимеризации. Использование базы ECM повышает рост органоидов в одной плоскости, которая помогает захвату изображения. Это также получает более быстрый рост органоидов и использует меньше ECM22.
  3. Во время полимеризации подготовьте клеточные смеси. Пеллет MyoEC и LEC фракций на 300 х г в течение 5 минут и повторной каждой фракции ячейки в 10% ECM/90% Рост Средний так что каждая скважина имеет 100 КЛ (см. Таблица 1 о том, как сделать рост средний).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для удобства приготовления, реплицировать скважины с помощью тех же клеточных смесей. Они могут быть объединены и подготовлены в одной трубке (например, четыре скважины одной и той же клеточной смеси могут быть подготовлены в 400 л 10% ECM/90% Рост Средний).
  4. Добавьте 100 qL каждой смеси клетки в 10% ECM/90% Средний рост к каждому наилучшим образом и позволяют органоиды установить для 20 min на 37 C, 5% CO2.
  5. После того, как клетки поселились, аккуратно добавьте 100 злителк Среднего роста, аккуратно понижая на камерную стенку каждого колодца. Инкубировать слайды при 37 градусах Цельсия, 5% CO2 (см. рисунок 3А для общего состава каждой скважины).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Ингибитор Rho Kinase, R-спондин, и Nrg1 являются факторами, которые были определены как важные для долгосрочной культуры органоидов, выращенных из первичных клеток мюрина молочных и клеток рака молочной железы человека13,14. Кроме того, факторы стволовых клеток B27 и N2 продлевают время культивации органоидов.
  6. Ячейки изображения каждые 24 ч, чтобы отслеживать их рост и осторожно обновлять средний рост каждые 2-3 дня, используя 100 Л/хорошо(рисунок 3B-E).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте крайнюю осторожность при обновлении среды. Наклоните камеры слайды для сбора среды в одном углу скважин. Удалите 100 евро средней и пополнить с осторожностью, чтобы оставить слой ECM спокойно.
  7. Если исследователи заинтересованы в исследовании лактации / альвеологезеза, переключиться на Alveologenesis Medium (см. Таблица 1) на 5 день и продолжать обновлять среду каждые 2-3 дней до дня 10 (Рисунок 3F) или за его путем прохождения с помощью решения восстановления (см. Таблица материалов)13.
    ПРИМЕЧАНИЕ: На данный момент органоиды могут быть изолированы от ECM путем инкубации при 4 градусах Цельсия в 400 кв. м 4-c решения для восстановления (см. Таблица материалов для протокола и информации о реагентах).

5. День 5 или 10: Фиксация и иммуно-пятновающих органоидов

  1. Удалите среду тщательно, аккуратно pipetting от средств массовой информации (лампочка пипетка работает лучше всего). Промыть каждый хорошо с помощью 200 Л 1x Dulbecco в фосфатбуферных солине (DPBS, см. рецепты).
  2. Исправьте органоиды с помощью холодных (4 кв.кв.) 4% (w/v) параформальдегида (PFA, см. рецепты) в течение 10 минут при комнатной температуре.
    ВНИМАНИЕ: PFA является опасным. Носите средства индивидуальной защиты (лабораторное пальто, перчатки и защитные очки). Этот шаг должен быть выполнен внутри дыма капот.
    ПРИМЕЧАНИЕ: ECM растворяется в лечении PFA. Неполное удаление ECM может привести к фоновому окрашиванию, когда органоиды анализируются с помощью иммунофлуоресценции.
  3. Удалите 4% PFA и добавьте 200 qL 0,2% (w/v) глицин /DPBS (см. таблицу 1) к каждому хорошо. Инкубировать слайды при комнатной температуре в течение 30 минут или 4 градусов по Цельсию на ночь на скалодроме, установленном в медленной обстановке.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Органоиды могут храниться в течение 1-3 дней в DPBS при 4 градусах Цельсия до следующего шага.
  4. Пермяки органоидов с помощью DPBS 0,25% Тритон X-100 (PBST, см. Таблица 1) в течение 10 минут при комнатной температуре.
  5. Блок органоидов с помощью 5% осла сыворотки (DS) (или других сыворотки, соответствующие видов вторичного антитела) в DPBS в течение 1 ч на качалке поверхности.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Этот шаг может быть выполнен в одночасье при 4 градусах По Цельсия на поверхности качания.
  6. Подготовка первичных антител в 1% DS / DPBS. Используйте 125-200 л для каждой скважины. Выполните иммуностогирование путем инкубации органоидов в первичных антител ночь на 4 градусов по Цельсию на качалке поверхности.

6. День 11: Полная иммунофлуоресценция

  1. Вымойте каждый колодец 2X с 200 Л PBST в течение 5 мин. Добавить вторичные антитела в 1% DS /DPBS с использованием 125-200 Л для каждой скважины. Инкубировать при комнатной температуре на раскачивной поверхности в течение 45 минут.
  2. Вымойте каждый колодец 2X, используя 200 Л L PBST на скважину.
  3. Пятно ядра с помощью Hoechst ДНК красителя в DPBS (1:2,000 в DPBS) в течение 5 минут при комнатной температуре.
  4. Удалите всю жидкость, оставить на колодце, аккуратно всасывая вакуумом.
  5. Тщательно удалите камеры и прокладку, поместите одну каплю (30 евро) монтажных носителей (см. Таблицу Материалов)на каждую скважину и крышку, заботясь, чтобы удалить пузыри. Дайте слайду высохнуть в темном пространстве в течение 1-2 дней. Печать с прозрачным лаком для ногтей. Изображение органоидов на конфокальный микроскоп(Рисунок 3E-F).

Результаты

Представленный здесь протокол описывает метод исследования конкретных родов молочной эпителиальных клеток с использованием мозаичных органоидов. Для получения первичных клеток морин для органоидов, эпителий молочной железы должны быть сначала изолированы от окру?...

Обсуждение

Здесь представлен метод, в которых подробно описывается, как исследователи могут генерировать 3D органоидные культуры с помощью первичных клеток МГ. Разница между этим и другими протоколами заключается в том, что мы подробно метод, чтобы отделить два, различные отсеки ячейки MG: внешние ?...

Раскрытие информации

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

Мы благодарим Бена Абрамса за техническую помощь и основную поддержку со стороны Калифорнийского университета, Института биологии стволовых клеток (UCSC). Мы благодарим Сьюзан Стром и Билл Сакстон за использование их Solamere спиннинг дискconfocal микроскоп. Эта работа была частично поддержана грантами UCSC от Медицинского института Говарда Хьюза через программу стипендий Джеймса Х. Гиллиама для расширенного обучения (S.R.), от NIH (NIH GM058903) за инициативу по максимизации развития студентов (H.M.) и от Национальный научный фонд для аспирантуры стипендий (O.C. DGE 1339067) и грант (A18-0370) от UC-Cancer Research Координационный комитет (LH).

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
15 ml High-Clarity Polypropylene Conical Tube (BD Falcon)Fisher Scientific352096
24 well ultra-low attachment plate (Corning)Fisher ScientificCLS3473-24EA
35 mm TC-treated Easy-Grip Style Cell Culture Dish (BD Falcon)Fisher Scientific353001
50 ml High-Clarity polypropylene conical tube (BD Falcon)Fisher Scientific352098
60 mm TC-treated Easy-Grip Style Cell Culture Dish (BD Falcon)Fisher Scientific353004
70 µM nylon cell strainer (Corning)Fisher Scientific08-771-2
Antibiotic-Antimycotic (100X)Thermo Fisher Scientific15240062Pen/Strep also works
B27 supplement without vitamin A (50x)Thermo Fisher Scientific12587010
B6 ACTb-EGFP miceThe Jackson Laboratory003291
BD Insulin syringe 0.5 mLThermo Fisher Scientific14-826-79
Class 2 Dispase (Roche)Millipore Sigma4942078001
Class 3 CollagenaseWorthington BiochemicalLS004206
Corning Cell Recovery solutionFisher Scientific354253Follow the guidelines for use – Extraction of Three-Dimensional Structures
from Corning Matrigel Matrix
Corning Costar Ultra-Low Attachment 6-wellFisher ScientificCLS3471
DexamethasoneMillipore SigmaD4902-25MG
DMEM/F12, no phenol redThermo Fisher Scientific11039-021
DNase (Deoxyribonuclease I)Worthington BiochemicalLS002007
Donkey anti-Goat 647Thermo Fisher ScientificA21447Use at 1:500, Lot: 1608641, stock 2 mg/mL, RRID:AB_2535864
Donkey anti-Mouse 647Jackson ImmunoResearch715-606-150Use at 1:1000, Lot: 140554, stock 1.4 mg/mL
Dulbecco's Modified Eagle Medium: Nutrient Mixture F-12 (DMEM/F12)Thermo Fisher Scientific11330-057
Dulbecco's phosphate-buffered saline (DPBS)Thermo Fisher Scientific14190-250Without Mg2+/Ca2+
EGFFisher ScientificAF-100-15-100ug
Fetal Bovine SerumVWR97068–085100% US Origin, premium grade, Lot: 059B18
Fluoromount-G (Southern Biotech)Fisher Scientific0100-01Referred to as mounting media in text
GentamicinThermo Fisher Scientific15710064
GlycineFisher ScientificBP381-5
Goat anti-WAPSanta Cruz BiotechSC-14832Use at 1:250, Lot: J1011, stock 200 µg/mL, RRID:AB_677601
Hoechst 33342AnaSpecAS-83218Use 1:2000, stock is 20mM
InsulinMillipore SigmaI6634-100mg
KClFisher ScientificP217-500
KH2PO4Fisher ScientificP285-500
KRT14–CreERtamThe Jackson Laboratory5107
Matrigel Growth Factor Reduced (GFR); Phenol Red-Free; 10 mLFisher ScientificCB-40230CLot: 8204010, stock concentration 8.9 mg/mL
MillexGV Filter Unit 0.22 µmMillipore SigmaSLGV033RS
Millicell EZ SLIDE 8-well glass, sterileMillipore SigmaPEZGS0816These chamber slides are great for gasket removal but other brands can work well (e.g. Lab Tek II).
Mouse anti-SMAMillipore SigmaA2547Use at 1:500, Lot: 128M4881V, stock 5.2 mg/mL, RRID:AB_476701
N-2 Supplement (100x)Thermo Fisher Scientific17502048
NaClFisher ScientificS671-3
NaH2PO4Fisher ScientificS468-500
Nrg1R&D5898-NR-050
Ovine Pituitary ProlactinNational Hormone and Peptide ProgramPurchased from Dr. Parlow at Harbor-UCLA Research and Education Institute
ParaformaldahydeMillipore SigmaPX0055-3
PentobarbitalMillipore SigmaP3761
R26R-EYFPThe Jackson Laboratory6148
Rho inhibitor Y-27632Tocris1254
R-spondinPeprotech120-38
Sodium HydroxideFisher ScientificS318-500
Sterile Filtered Donkey SerumEquitech-Bio Inc.SD30-0500
Sterile Filtered Donkey SerumEquitech-Bio Inc.SD30-0500
Triton X-100Millipore Sigmax100-500MLLaboratory grade
Trypsin EDTA 0.05%Thermo Fisher Scientific25300-062

Ссылки

  1. Macias, H., Hinck, L. Mammary gland development. Wiley Interdisciplinary Reviews in Developmental Biology. 1 (4), 533-557 (2012).
  2. Daniel, C. W., De Ome, K. B., Young, J. T., Blair, P. B., Faulkin, L. J. The in vivo life span of normal and preneoplastic mouse mammary glands: a serial transplantation study. Proceedings of the National Academy of Science U S A. 61 (1), 53-60 (1968).
  3. Ip, M. M., Asch, B. B. . Methods in Mammary Gland Biology and Breast Cancer Research. , (2000).
  4. Shackleton, M., et al. Generation of a functional mammary gland from a single stem cell. Nature. 439 (7072), 84-88 (2006).
  5. Stingl, J., et al. Purification and unique properties of mammary epithelial stem cells. Nature. 439 (7079), 993-997 (2006).
  6. Lasfargues, E. Y. Cultivation and behavior in vitro of the normal mammary epithelium of the adult mouse. II. Observations on the secretory activity. Experimental Cell Research. 13 (3), 553-562 (1957).
  7. Simian, M., Bissell, M. J. Organoids: A historical perspective of thinking in three dimensions. Journal of Cell Biology. 216 (1), 31-40 (2017).
  8. Orkin, R. W., et al. A murine tumor producing a matrix of basement membrane. Journal of Experimental Medicine. 145 (1), 204-220 (1977).
  9. Lee, E. Y., Parry, G., Bissell, M. J. Modulation of secreted proteins of mouse mammary epithelial cells by the collagenous substrata. Journal of Cell Biology. 98 (1), 146-155 (1984).
  10. Lee, E. Y., Lee, W. H., Kaetzel, C. S., Parry, G., Bissell, M. J. Interaction of mouse mammary epithelial cells with collagen substrata: regulation of casein gene expression and secretion. Proceedings of the National Academy of Science U S A. 82 (5), 1419-1423 (1985).
  11. Bissell, M. J., Barcellos-Hoff, M. H. The influence of extracellular matrix on gene expression: is structure the message?. Journal of Cell Science. 8 (Suppl), 327-343 (1987).
  12. Petersen, O. W., Ronnov-Jessen, L., Howlett, A. R., Bissell, M. J. Interaction with basement membrane serves to rapidly distinguish growth and differentiation pattern of normal and malignant human breast epithelial cells. Proceedings of the National Academy of Science U S A. 89 (19), 9064-9068 (1992).
  13. Jarde, T., et al. Wnt and Neuregulin1/ErbB signalling extends 3D culture of hormone responsive mammary organoids. Nature Commununications. 7, 13207 (2016).
  14. Sachs, N., et al. A Living Biobank of Breast Cancer Organoids Captures Disease Heterogeneity. Cell. 172 (1-2), 373-386 (2018).
  15. Daniel, C. W., Strickland, P., Friedmann, Y. Expression and functional role of E- and P-cadherins in mouse mammary ductal morphogenesis and growth. Developmental Biology. 169 (2), 511-519 (1995).
  16. Runswick, S. K., O'Hare, M. J., Jones, L., Streuli, C. H., Garrod, D. R. Desmosomal adhesion regulates epithelial morphogenesis and cell positioning. Nature Cell Biology. 3 (9), 823-830 (2001).
  17. Chanson, L., et al. Self-organization is a dynamic and lineage-intrinsic property of mammary epithelial cells. Proceedings of the National Academy of Science U S A. 108 (8), 3264-3269 (2011).
  18. Honvo-Houeto, E., Truchet, S. Indirect Immunofluorescence on Frozen Sections of Mouse Mammary Gland. Journal of Visualized Experiments. (106), e53179 (2015).
  19. Macias, H., et al. SLIT/ROBO1 signaling suppresses mammary branching morphogenesis by limiting basal cell number. Developmental Cell. 20 (6), 827-840 (2011).
  20. Welm, B. E., Dijkgraaf, G. J., Bledau, A. S., Welm, A. L., Werb, Z. Lentiviral transduction of mammary stem cells for analysis of gene function during development and cancer. Cell Stem Cell. 2 (1), 90-102 (2008).
  21. Smith, P., et al. VANGL2 regulates luminal epithelial organization and cell turnover in the mammary gland. Scientific Reports. 9 (1), 7079 (2019).
  22. Lee, G. Y., Kenny, P. A., Lee, E. H., Bissell, M. J. Three-dimensional culture models of normal and malignant breast epithelial cells. Nature Methods. 4 (4), 359-365 (2007).
  23. Campbell, J. J., Davidenko, N., Caffarel, M. M., Cameron, R. E., Watson, C. J. A multifunctional 3D co-culture system for studies of mammary tissue morphogenesis and stem cell biology. PLoS One. 6 (9), e25661 (2011).
  24. Labarge, M. A., Garbe, J. C., Stampfer, M. R. Processing of human reduction mammoplasty and mastectomy tissues for cell culture. Journal of Visualized Experiments. (71), e50011 (2013).
  25. Marlow, R., Dontu, G. Modeling the breast cancer bone metastatic niche in complex three-dimensional cocultures. Methods in Molecular Biology. 1293, 213-220 (2015).
  26. Koledova, Z., Lu, P. A 3D Fibroblast-Epithelium Co-culture Model for Understanding Microenvironmental Role in Branching Morphogenesis of the Mammary Gland. Methods in Molecular Biology. 1501, 217-231 (2017).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

1573D

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены