JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

בלוטת החלב היא מבנה מחודד, המורכב מיואפיתל חיצוני ותאי אפיתל הפנים הפנימיים. המוצג הוא פרוטוקול להכין אורגנואידים. באמצעות טריסיזציה דיפרנציאלית שיטה יעילה זו מאפשרת לחוקרים לטפל באופן נפרד בשני סוגי תאים אלה כדי לחקור שאלות הנוגעות לתפקידם בצורת בלוטת החלב ובתפקוד.

Abstract

בארגון אורגנואידים מציעים מבני רקמה תלת-ממדיים המתארגנים תהליכים פיזיולוגיים בנוחות של מנה. בלוטת החלב מורין מורכבת משני תאים שונים האפיתל תאים, המשרתים פונקציות שונות: החיצוני, תא האפיתל מיוטורי ואת התא הפנימי, הפרשה לומיאל. כאן, אנו מתארים שיטה שבה התאים המרכיבים תאים אלה מבודדים ולאחר מכן משולבים כדי לחקור את התרומה האישית שלהם השושלת כדי בלוטת החלב מורפולגנזה ובידול. השיטה היא פשוטה ויעילה ואינה מצריכה טכנולוגיות הפרדה מתוחכמות כגון מיון תאים המופעל באמצעות קרינה פלואורסצנטית. במקום זאת, אנו הקציר ו אנזימטי מעכל את הרקמה, הזרע את האפיתל על מנות תרבות הרקמה מחסיד, ולאחר מכן להשתמש טריסיזציה דיפרנציאל הפרדה מיואפיתל מתאי הלומיאלים עם ~ 90% טוהר. התאים מצופים לאחר מכן במטריצה מחלבת שם הם מסדרים לתוך בילדו, תלת מימדי (3D) אורגנואידים כי ניתן לבדיל כדי לייצר חלב לאחר 10 ימים בתרבות. כדי לבדוק את ההשפעות של מוטציות גנטיות, תאים ניתן לקצור מסוג פראי או מהונדסים גנטית מודלים העכבר, או שהם יכולים להיות מניפולציות גנטית לפני התרבות 3D. טכניקה זו ניתן להשתמש כדי ליצור אורגנואידים פסיפס המאפשרים חקירה של הפונקציה גן במיוחד ב הלומיאל או מיואפיתל התא.

Introduction

בלוטת החלב (MG) היא כמו עץ, מבנה האפיתל הצינורי המוטבע בתוך משתית עשיר אדיפוציטוטה. האפיתל הביקטיום כולל שכבת הבסיס החיצונית של כריתת המעטפת, תאי האפיתל (מיואקאס) ושכבה פנימית של לומיאל, תאי אפיתל הפרשה (LECs), המקיף לומן מרכזי1. במהלך ההנקה כאשר החוזה החיצוני מיוקל לסחוט חלב מכתשיים למדעי הפנים, ה-MG עובר שינויים רבים הנמצאים תחת שליטתה של גורמי גדילה (למשל, EGF ו-FGF) והורמונים (למשל פרוגסטרון, אינסולין, ו prolactin). שינויים אלה גורמים לבידול של מבנים מיוחדים, מכתשי, אשר מסנתז ומפרישות חלב במהלך ההנקה1. אפיטאליה של הפטמות יכול להיות מניפולציות בשיטות שבהן שברי רקמת אפיתל, תאים, או אפילו תא בסיס אחד מושתלים לתוך מארח מגיני שומן בחלב, מראש על הפטמות של החלב אנדוסוגני, ומותר לגדול כדי להוות מחדש שלמות, עץ אפיתל פונקציונלי2,3,4,5. השתלת היא טכניקה רבת עוצמה, אבל זה זמן רב ובלתי אפשרי אם תוצאות מוטציה בתוך החיים העובריים המוקדמים (לפני E14) המונע הצלה של שתילת שולחן החלב. יתרה מזאת, חוקרים מבקשים לעתים תכופות לחקור את תפקידם של שני התאים השונים, הנגזרים מתאי השושלת המוגבלים. בעוד טכנולוגיית היצור-לקס מאפשר מניפולציה גנטית דיפרנציאלית של מיויואס ו-LECs, זה גם משימה גוזלת זמן ויקר. לפיכך, מאז שנות החמישים, החוקרים השתמשו באורגנואידים מחוץ לבית הספר כדרך קלה ויעילה יחסית לטיפול בשאלות הנוגעות למבנה רקמת החלב ולתפקוד6,7.

בפרוטוקולים המוקדמים המתארים את הבידוד והתרבות של תאי האפיתל הראשוניים של החלב, החוקרים מצאו כי מטריצת קרום המרתף (BME), מורכב קריש פלזמה והעובר לחלץ עוף, נדרש עבור שברי MG גדל על מנה6. בעשורים הבאים, מטריצות של מסחטות (ecms, קולגן, ו מדוזות חלבון מטריצה מופרש על ידי אנגלברב-הולם-נחיל מורטין בתאי סרקומה) פותחו כדי להקל על תרבות 3d ולחקות טוב יותר בסביבה vivo7,8,9,10. תאים culturing בתוך 3d מטריצות מתגלים על ידי קריטריונים מרובים (מורפולוגיה, ביטוי גנים, ואת התגובה הורמון) כי כזה מיקרוסביבה מודלים טובים יותר vivo תהליכים פיזיולוגיים9,10,11,12. מחקר באמצעות תאים murine העיקרי זיהה גורמי צמיחה מפתח מורפולגנים הדרושים תחזוקה מורחבת והבידול של אורגנואידים13. מחקרים אלה קבעו את הבמה לפרוטוקול המוצג כאן, ולתרבות של תאי השדיים האנושיים כמו אורגנואידים 3D, אשר כיום הוא כלי קליני מודרני, המאפשר גילוי סמים ובדיקות סמים על דגימות החולה14. בסך הכל, אורגנואיד culturing מדגיש את היכולות של הארגון העצמי של התאים הראשוניים ואת תרומתם לורפוגנזה ובידול.

מוצג כאן הוא פרוטוקול מורנין התרבות epithelia שניתן לבדיל לתוך חלב מניב. טכניקת טריסיזציה דיפרנציאלית משמשת כדי לבודד את מיויואס ו-LECs המרכיבים את שני תאי התאים הייחודיים של ה-MG. אלה שברים תא מופרדים יכול לאחר מכן להיות מניפולציות גנטית כדי overexpress או מנוק פונקציה גנטית. מכיוון ששושלת-שושלת, הארגון העצמי הוא נכס מולדת של תאים אפיתל הפטמות15,16,17, שילוב מחדש של שברים אלה תאים מאפשר לחוקרים ליצור בילאיל, מארגני פסיפס. אנו מתחילים לעכל את רקמת השומן, ולאחר מכן מריטת את שברי הפטמות על צלחת תרבות הרקמה במשך 24 שעות (איור 1). שברי הרקמה מתפשרים על פוליסטירן מנות כשברים בvivo בארגון: שכבת מיואפיתל חיצונית המקיפה את שכבות הלומיאל הפנימיות. ארגון הסלולר הזה מאפשר לבידוד של היואקאס החיצוני על ידי טריפסין-EDTA (0.05%) טיפול ב3-6 דקות ואחריו סיבוב שני של טריפסין-EDTA (0.05%) טיפול המנתק את הצ הפנימי הנותר (איור 2). לפיכך, סוגי תאים אלה בעלי רגישות טריפסין שונים מבודדים ולאחר מכן יכולים להיות מעורבים ומצופים ב-ECM (איור 3). התאים עוברים ארגון עצמי כדי ליצור כדורים מבהרים, המכילים שכבה חיצונית של החברה הפנימית המקיפה את ה-LECs. היווצרות לומן מתרחשת כאשר התאים גדלים במדיום המכיל קוקטייל של גורמי גדילה (ראה מתכונים עבור צמיחה בינונית)13. לאחר 5 ימים, אורגנואידים יכול להיות מובחנים לייצור חלב על ידי מעבר למדיום מכתשי (לראות מתכונים ואיור 3F) ו מודבטים לעוד 5 ימים. לחילופין, אורגנואידים ימשיך להתרחב ולענף במדיום הצמיחה לפחות 10 ימים. אורגנואידים ניתן לנתח באמצעות immunofluorescence (איור 3D-F) או שוחרר ecm באמצעות פתרון שחזור (ראה טבלת חומרים) וניתח באמצעות שיטות אחרות (למשל, החיסוני, RT-qpcr).

Protocol

כל השיטות המתוארות כאן אושרו על ידי הוועדה לטיפול בבעלי חיים מוסדיים (IACUC) של אוניברסיטת קליפורניה, סנטה קרוז.

1. יום 1: עיכול בלוטת החלב

  1. היכונו למסוק את ה-MGs של עכברים נקבה בוגרת 10-14 שבועות של גיל.
    1. לבצע את הקציר על ספסל פתוח תחת תנאים אספטי.
    2. לחטא את כל חומרי הניתוח, לוחות שעם, סיכות על ידי אוטוקלינג והספיגה ב 70% אלכוהול עבור 20 דקות לפני הניתוח.
    3. בעלי חיים מורדם עם נתרן פנטוברביטל (2X מינון הרדמה של 0.06 מ"ג/g משקל גוף) נמסר באמצעות הזרקה תוך הצפק עם מזרק 0.5 מ ל אינסולין.
    4. לעקוב אחר רמת ההרדמה על ידי צובט את הבהונות של בעל החיים כדי לבדוק תגובה רפלקס ולהתחיל את הפרוטוקול רק לאחר החיה הוא מורדם לחלוטין.
    5. מניחים את החיה על גבו, להצמיד את התוספות שלה לcorkboard, ולנגב את הבטן ואת החזה עם אתנול.
  2. כדי לקצור את ה#2, 3, 4, ו 5 MGs מעכבר אחד (כלומר, 8 MGs, איור 1א), לזהות את קו האמצע בין שתי הרגליים האחוריות ולעשות חתך קטן (1 ס מ) על עור הבטן עם מספריים חדים, ולאחר מכן להאריך את החתך לצוואר18.
  3. בעקבות הפיכת חתכים קטנים לכיוון הרגליים והזרועות כדי לאפשר שחרור של העור באמצעות ספוגית כותנה. למשוך את העור משם למתוח אותו הדוק לפני הצמדת אותו בצד אחד (איור 1B, שלב 1)18. להסיר את ה-MGs על ידי גזירה תחתם, ולהסיר את בלוטות הלימפה מתוך הבלוטות ה#4 (איור 1B, שלבים 2, 3)18. חזור על ההליך בצד השני של הגוף.
  4. לאסוף את רקמת ה-MG ב 50 mL של 4 ° c של בעלות צלזיוס מדיה של הנשר משתנה (DMEM)/תערובת מזון F12 (F12) שיושלם עם 5% סרום העוברי (FBS) ו-1X אנטיביוטי-Antimycotic (Anti-Anti)18.
  5. קוצצים את בלוטות בצלחת 35 מ"מ או על צלחת קרמיקה באמצעות להב תער או מסוק הרקמה. לסובב את הצלחת כל חמש צלעות ידניות או כל סיבוב על המסוק הרקמה עד חתיכות הרקמה יכול להתאים דרך טיפ 1 mL מיקרופיפטה בקלות (~ 0.1 מ"מ/קטע, איור 1ג).
  6. לעכל את המקלעים ב העיכול בינונית (לראות את הטבלה 1) עבור 14 שעות ב 6 היטב הדבקה נמוכה ב 37 ° c, 5% CO2.

2. יום 2: בידוד שברי רקמות האפיתל בפטמות

  1. לאחר 14 שעות של עיכול, לערבב בעדינות על ידי ליטוף את הרקמה מתעכל 10X באמצעות מיקרופיפטה 1 mL כדי לשבור את כל משתית או האדיפוז הנותרים, ולהבטיח כי לא בועות או כוח מכני עודף נוצרות.
    הערה: אם יש עיכול שלם לאחר 14 שעות, זה יכול להיות בגלל הצטברות של DNA הנקרא. במקרה זה, להוסיף 1 μL של 1 מ"ג/mL deאוקסירישכירות אני (DNase I) עבור 2 מ ל של מדיום עיכול. מודטה לעוד 30 דקות ב 37 ° c, 5% CO2.
  2. לאסוף רקמות בצינור 15 מ ל ולשטוף את הטוב המשמש לעיכול עם 2-3 mL של התרבות רקמה כיתה מלוחים באגירה הפוספט של החברה (DPBS) חינם של Ca2 + ו-Mg2 +. צנטריפוגה ב 600 x g עבור 10 דקות.
  3. פנו את הסופרנטאנט המכיל את שכבת השומנים ואת המדיום, ולאחר מכן השהה מחדש את הגלולה ב-5 מ ל של DPBS ועבור לצינור חדש של 15 מ ל. צנטריפוגה ב 600 x g עבור 10 דקות.
  4. במהלך צנטריפוגה place 70 יקרומטר תא ניילון מסננת בצינור 50 ml ו להרטיב מסננת באמצעות 10 mL של 37 ° c/F12.
  5. שברי רקמות מחדש משלב הפרוטוקול 2.4 באמצעות 5 מ ל של dpbs ולעבור את ההשעיה באמצעות מסננת מפרה 70 יקרומטר תא ניילון להסיר תאים סטרומה ותאים בודדים (איור 1ד).
  6. לאסוף את שברי הרקמה על מסננת התא. לשטוף 4X עם 10 מ ל של 37 מעלות צלזיוס/F12 (איור 1ד).
    התראה: שטיפה לא שלמה תגרום לתרבויות הזוהמות בתאים שאינם אפיתל.
  7. שחררו את שברי הרקמה על ידי החזקת הכרטיסייה מסננת עם האצבעות בכפפות, היפוך מסננת על הצלחת 60 מ"מ רקמות הרקמה ועובר 1 mL מדיום של תחזוקה בינונית (לראות את שולחן 1) דרך החלק התחתון של מסננת 4X (איור 1E).
  8. בדוק את מסננת של שרידים מרסיס רקמות, אשר יהיה גלוי על ידי עין בלתי, ולשטוף את מסננת 1X יותר עם 1 mL של מדיום תחזוקה אם שברים כלשהם עדיין לדבוק מסננת. שברי רקמת שוטפים צריך עכשיו להיות חופשי של תאים סטרומה.
  9. בדוק במהירות את המנה 60 mm המכיל את שברי MG משלב הפרוטוקול 2.9 תחת מיקרוסקופ הפוך (4X או 10X המטרה, איור 1F). הכנה טיפוסית של שמונה מMGs התשואות ~ 500 שברי. חפש תאים בודדים או טיפות שומן, בין אם קיימים תאים מזהם.
    הערה: אם ישנם תאים מזהם, לחזור על שלב הסינון על ידי איסוף המדיום ושברי ממנה 60 mm באמצעות הפיפטה 5 מ"ל וסינון הרסיס שוב דרך מסננת חדש 70 יקרומטר, שלבי הפרוטוקול חוזר 2.6, 2.8-2.10.
  10. דגירה 24 h ב 37 ° צ', 5% CO2, המאפשר את רסיס הרקמה לדבוק וליצור שברי בילאיל (איור 2א).
    הערה: אם השברים לא התיישבו על ידי 24 שעות, המשך להמשיך בדגירה עד לדבק. אם השברים אינם נצמדים היטב, הפרדת תאי התא לא תפעל. אם החוקרים מודאגים לגבי הדבקה, לוחות התרבות רקמות ניתן לטפל כדי לקדם את הקובץ המצורף (למשל, פולי-L-ליזין).

3. יום 3: טריסיזציה דיפרנציאלית של תאים אפיתל מיואפיתל ולומיאל

  1. כדי להפריד את מיואיאס מ-LECs, רוקן את המדיה ממנה, שטוף 1x עם 1 מ ל של DPBS והוסף 1 mL של טריפסין-EDTA טריים (0.05%), והצג בזהירות את העיכול תחת מיקרוסקופ הפוך (המטרה 10X או 20X, איור 2B, C, F). התנתקות של שכבת מיוטק החיצונית תדרוש 3-6 דקות, בהתאם לטריפסין-EDTA (0.05%) כוח.
    הערה: ראה איור 2 לתמונות מייצגות המציגות תהליך זה. תחת התאורה הבהירה של שדה, המיואלה מופיעים מעוגלים ויש להם מראה בהיר יותר בהשוואה ל-LECs, אשר נשארים במרכז ומופיעים כהה יותר.
  2. לאסוף את השבר מיוטק בצינור 15 מ"ל המכיל 2 מ"ל 10% FBS/DPBS. מבלי להפריע LECs, לשטוף בעדינות את הצלחת 60 mm עם 2 מ מ של DPBS ולאחר מכן להיפטר DPBS (איור 2H-I).
    הערה: ההתאוששות הרגילה של מיויואס נמצאת בטווח של (3.5 x 106-1.5 x 106) בהתאם לגודל של המקלעים.
  3. כדי להסיר את השבר LEC, הוסף 1 mL של טריפסין-EDTA (0.05%) אל המנה שוב, הדגירה 7-15 דקות, ניטור בקפידה כדי למנוע עיכול יתר. כיבוי טריפסין-אדטה (0.05%) על הצלחת עם 2 מ ל של 10% FBS/DPBS. לאסוף את השבר LEC בצינור חדש 15 מ ל.
    הערה: ההתאוששות הרגילה של LECs היא בטווח (2 x 106-4.2 x 106) בהתאם לגודל של המקלעים. באופן שגרתי, הטוהר של שני השברים כמו הגרורות של אימונוהיסטוכימיה היא ~ 90%19 (איור 2E).
  4. צנטריפוגה כל שבר עבור 5 דקות ב 300 x g כדי להסיר את טריפסין-edta (0.05%). השהה מחדש את הגלולה ב-250 μL של מדיום תחזוקה וספירת כל אוכלוסיית תאים באמצעות הומוציטוטומטר או מונה תאים אוטומטי. מניחים את התאים על הקרח בזמן הספירה.
    הערה: אם מניפולציה גנטית של שברים התא רצוי, התאים הראשוניים ניתן לגדל על מנות הדבקה נמוכה נגוע בווירוס20.

4. יום 3: שילוב והטבעה של שברים בתאים במטריצה מיעלת

הערה: לאחר איסוף וספירה של שברי מיוטק ו-LEC, ניתן לשלבם. יחס אופייני מיוטק/LEC הוא 1:3 (איור 3א)19. ניתן לבצע מחקרים שונים. לדוגמה, כדי לבצע מחקרי פסיפס, שברים ניתן ליצור מסוג פראי (WT) ו מוטציה (מוט) עכברים ומשולבים (מיוטק/LEC: WT/WT; המשך; Mut/WT; Mut/Mut)21, או שברים ניתן לשלב באמצעות יחס שונה של מיופקאס/lecs19.

  1. מבוסס על ספירות תאים, לחשב את מספר הבארות (8 החדר היטב, ראה טבלת חומרים) כי צריך להיות מוכן עבור 12,000 תאים/טוב (למשל 3,000 מיופקאס: 9000 lecs).
  2. לבסס את שכבת הבסיס עבור תרבות תלת-ממד על ידי הוספת 90 μL של 50% ECM (50% ECM/50% Dמאמ/F12, ללא פנול אדום לראות את הטבלה של חומרים) לכל טוב. ודאו שאין בועות והבארות מצופות באופן שווה. כדי לגבש את שכבת הבסיס, מודיית את השקופיות ב 37 ° c, 5% CO2 עבור 30 דקות.
    הערה: ה-ECM צריך להישאר קר-קרח עד לשלב זה, אחרת זה יהיה לפולימו מוקדם יותר ולהוביל לציפוי בסיס אחיד ופולימוניזציה. שימוש ב-ECM בסיס משפר את הגדילה האורגאידית במישור יחיד, המסייע לכידת תמונה. זה גם משיג צמיחה ארגונית מהירה יותר ומשתמש פחות ECM22.
  3. במהלך הפילמור, הכן את מערבב התאים. גלולה מיוטק ו LEC שברים ב 300 x g עבור 5 דקות והשהה מחדש כל שבר תא ב 10% ecm/90% צמיחה בינונית אז כל טוב יש 100 μl (ראה טבלה 1 כיצד להפוך את הצמיחה בינונית).
    הערה: כדי להקל על ההכנה, שכפל בארות באמצעות אותם תערובות תאים. אלה יכולים להיות משולבים ומוכנים בצינור אחד (למשל, ארבע בארות של אותו שילוב תא ניתן להכין ב 400 μL של 10% ECM/90% צמיחה בינונית).
  4. הוסף 100 μL של כל שילוב תא ב 10% ECM/90% בינוני גדילה לכל טוב ולאפשר לאורגנואידים להתפשר על 20 דקות ב 37 ° c, 5% CO2.
  5. לאחר התאים התיישבו, להוסיף בעדינות 100 μL של מדיום צמיחה על ידי ליטוף בעדינות במורד הקיר קאמרית של כל טוב. מודאת השקופיות ב 37 ° צ', 5% CO2 (ראה איור 3A עבור ההרכב הכולל של כל טוב).
    הערה: מעכבי Rho קינאז, R-החתן והNrg1 הם גורמים שזוהו כחשובים לתרבות ארוכת הטווח של האורגנואידים שגדלו הן מתאי החלב העיקריים של מורטין והן מתאי סרטן השד האנושיים13,14. בנוסף, תא גזע גורמים B27 ו N2 להאריך את הזמן שאורגנואידים יכול להיות תרבותי.
  6. תאים תמונה כל 24 h כדי לעקוב אחר הצמיחה שלהם בעדינות לחדש את בינונית צמיחה כל 2-3 ימים באמצעות 100 μL/ובכן (איור 3ב-E).
    הערה: השתמש בזהירות מירבית בעת חידוש המדיום. להטות את השקופיות הקאמרית כדי לאסוף את המדיום בפינה אחת של הבארות. הסר ≤ 100 μL של המדיום ולחדש עם הטיפול להשאיר את שכבת ECM ללא הפרעה.
  7. אם החוקרים מעוניינים לחקור את ההנקה/מכתשי, לעבור מדיום המאואלגנזה (לראות שולחן 1) ביום 5 ולהמשיך לחדש את המדיום כל 2-3 ימים עד יום 10 (איור 3F) או מעבר על ידי המעבר באמצעות פתרון התאוששות (לראות את הטבלה של חומרים)13.
    הערה: בשלב זה, ניתן לבודד אורגנואידים מ-ECM על-ידי הריגדירוג ב-4 ° צ' ב 400 μL של פתרון התאוששות של 4 ° c (ראה טבלת חומרים לפרוטוקול ומידע מגיב).

5. יום 5 או 10: התיקון והנוגדנים האורגנואידים

  1. הסר את המדיום בזהירות על ידי ליטוף בעדינות של המדיה (הנורה מעובד הטוב ביותר). לשטוף כל טוב באמצעות 200 μL של מלוחים באגירה של הפוספט של Dulbecco של 1x (DPBS, ראה מתכונים).
  2. לתקן את האורגנואידים באמצעות קור (4 ° צ') 4% (w/v) פאראפורמלדהיד (למטה, ראה מתכונים) עבור 10 דקות בטמפרטורת החדר.
    התראה: המטה מסוכן. לבשו ציוד הגנה אישי (מעיל מעבדה, כפפות ומשקפי בטיחות). הצעד הזה צריך להתבצע. בתוך מכסה המנוע
    הערה: ה-ECM מומס על-ידי הטיפול באמצעות הה,. הסרת ECM שלמה עלולה להוביל לצביעת הרקע כאשר האורגנואידים מנותח על-ידי immunofluorescence.
  3. הסר את 4% בתחתית ולהוסיף 200 μL של 0.2% (w/v) גליצין/DPBS (ראה שולחן 1) לכל באר. הצבת השקופיות בטמפרטורת החדר עבור 30 דקות או 4 ° c ללילה על משטח נדנדה שנקבע להגדרה איטית.
    הערה: ניתן לאחסן את האורגנואידים במשך 1-3 ימים ב-DPBS ב-4 ° צ' לפני השלב הבא.
  4. הפרראות האורגנואידים באמצעות DPBS + 0.25% טריטון X-100 (PBST, ראה טבלה 1) עבור 10 דקות בטמפרטורת החדר.
  5. לחסום את האורגנואידים באמצעות סרום 5% חמור (DS) (או סרום אחר התואם את מינים של הנוגדן המשני) ב DPBS עבור 1 h על משטח נדנדה.
    הערה: ניתן לבצע שלב זה במשך הלילה ב-4 ° c על משטח נדנדה.
  6. הכינו נוגדנים עיקריים ב-1% DS/DPBS. השתמש ב-125-200 μL עבור כל הבאר. בצע הפחתה על ידי הדגירה של האורגנואידים בנוגדן העיקרי לילה ב 4 ° c על משטח נדנדה.

6. יום 11: אימונולואונציה מלאה

  1. לשטוף כל טוב 2X עם 200 μL PBST עבור 5 דקות. הוסף נוגדן משני ב 1% DS/DPBS באמצעות 125-200 μL עבור כל באר. דגירה בטמפרטורת החדר על משטח נדנדה עבור 45 דקות.
  2. לשטוף כל טוב 2X באמצעות 200 μL PBST לכל הטוב.
  3. הכתם את הגרעינים באמצעות צבע DNA Hoechst ב DPBS (1:2000 ב DPBS) עבור 5 דקות בטמפרטורת החדר.
  4. מסירים את כל הנוזלים שנשארו על הבאר על ידי הסרת ואקום בעדינות.
  5. בזהירות להסיר את התאים והאטם, מקום טיפה אחת (~ 30 μL) של מדיה הרכבה (ראה טבלת חומרים) על כל היטב כיסוי, מטפלת להסיר בועות. אפשר לשקופית להתייבש בחלל חשוך במשך 1-2 ימים. . חותם עם לק בהיר התמונה האורגנואידים על מיקרוסקופ קונפוקלית וקד (איור 3E-F).

תוצאות

הפרוטוקול המוצג כאן מתאר שיטה לחקירת תרומות ספציפיות של שושלת היוחסין בתאי האפיתל של הפטמות על ידי עשיית שימוש באורגנואידים הפסיפס. כדי להשיג תאים murine הראשי עבור אורגנואידים, האפיתל בלוטת החלב צריך להיות הראשון מבודד הadipocyte עשיר המקיף משתית (איור 1). תהלי?...

Discussion

כאן, שיטה מוצגת המפרט כיצד חוקרים יכולים ליצור תרבויות 3D אורגאיד באמצעות תאי MG הראשי. ההבדל בין זה לבין פרוטוקולים אחרים הוא שאנחנו לפרט שיטה להפריד בין שני, ברורים תאים תא מג: מmyoecs הבסיס החיצוני ו LECs הפנימי. השיטה שלנו מעסיקה טריפסין דו-שלבים (0.05%) טיפול שאנו מכנים. טריסינוניזציה משלים

Disclosures

. למחברים אין מה לגלות

Acknowledgements

אנו מודים לבן אברהמס לסיוע טכני ותמיכה ליבה מאוניברסיטת קליפורניה, סנטה קרוז (UCSC) המכון לביולוגיה של תאי גזע (IBSC). אנו מודים סוזן Strome ואת ביל סאקטון לשימוש שלהם Solamere ספינינג דיסק מיקרוסקופ Confocal וקד. עבודה זו היתה נתמכת בחלקו על ידי מענקים ucsc מן המכון הרפואי הווארד יוז באמצעות מלגות ג'יימס ה. גילהם למחקר מתקדם (S.R.), מ nih (nih GM058903) עבור היוזמה למקסם את התפתחות הסטודנטים (בריאות) ומ הקרן הלאומית למדע עבור מלגת מחקר בוגרת (ה1339067) ובמענק מענק (A18-0370) מוועדת התיאום של מחקר הסרטן (LH).

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
15 ml High-Clarity Polypropylene Conical Tube (BD Falcon)Fisher Scientific352096
24 well ultra-low attachment plate (Corning)Fisher ScientificCLS3473-24EA
35 mm TC-treated Easy-Grip Style Cell Culture Dish (BD Falcon)Fisher Scientific353001
50 ml High-Clarity polypropylene conical tube (BD Falcon)Fisher Scientific352098
60 mm TC-treated Easy-Grip Style Cell Culture Dish (BD Falcon)Fisher Scientific353004
70 µM nylon cell strainer (Corning)Fisher Scientific08-771-2
Antibiotic-Antimycotic (100X)Thermo Fisher Scientific15240062Pen/Strep also works
B27 supplement without vitamin A (50x)Thermo Fisher Scientific12587010
B6 ACTb-EGFP miceThe Jackson Laboratory003291
BD Insulin syringe 0.5 mLThermo Fisher Scientific14-826-79
Class 2 Dispase (Roche)Millipore Sigma4942078001
Class 3 CollagenaseWorthington BiochemicalLS004206
Corning Cell Recovery solutionFisher Scientific354253Follow the guidelines for use – Extraction of Three-Dimensional Structures
from Corning Matrigel Matrix
Corning Costar Ultra-Low Attachment 6-wellFisher ScientificCLS3471
DexamethasoneMillipore SigmaD4902-25MG
DMEM/F12, no phenol redThermo Fisher Scientific11039-021
DNase (Deoxyribonuclease I)Worthington BiochemicalLS002007
Donkey anti-Goat 647Thermo Fisher ScientificA21447Use at 1:500, Lot: 1608641, stock 2 mg/mL, RRID:AB_2535864
Donkey anti-Mouse 647Jackson ImmunoResearch715-606-150Use at 1:1000, Lot: 140554, stock 1.4 mg/mL
Dulbecco's Modified Eagle Medium: Nutrient Mixture F-12 (DMEM/F12)Thermo Fisher Scientific11330-057
Dulbecco's phosphate-buffered saline (DPBS)Thermo Fisher Scientific14190-250Without Mg2+/Ca2+
EGFFisher ScientificAF-100-15-100ug
Fetal Bovine SerumVWR97068–085100% US Origin, premium grade, Lot: 059B18
Fluoromount-G (Southern Biotech)Fisher Scientific0100-01Referred to as mounting media in text
GentamicinThermo Fisher Scientific15710064
GlycineFisher ScientificBP381-5
Goat anti-WAPSanta Cruz BiotechSC-14832Use at 1:250, Lot: J1011, stock 200 µg/mL, RRID:AB_677601
Hoechst 33342AnaSpecAS-83218Use 1:2000, stock is 20mM
InsulinMillipore SigmaI6634-100mg
KClFisher ScientificP217-500
KH2PO4Fisher ScientificP285-500
KRT14–CreERtamThe Jackson Laboratory5107
Matrigel Growth Factor Reduced (GFR); Phenol Red-Free; 10 mLFisher ScientificCB-40230CLot: 8204010, stock concentration 8.9 mg/mL
MillexGV Filter Unit 0.22 µmMillipore SigmaSLGV033RS
Millicell EZ SLIDE 8-well glass, sterileMillipore SigmaPEZGS0816These chamber slides are great for gasket removal but other brands can work well (e.g. Lab Tek II).
Mouse anti-SMAMillipore SigmaA2547Use at 1:500, Lot: 128M4881V, stock 5.2 mg/mL, RRID:AB_476701
N-2 Supplement (100x)Thermo Fisher Scientific17502048
NaClFisher ScientificS671-3
NaH2PO4Fisher ScientificS468-500
Nrg1R&D5898-NR-050
Ovine Pituitary ProlactinNational Hormone and Peptide ProgramPurchased from Dr. Parlow at Harbor-UCLA Research and Education Institute
ParaformaldahydeMillipore SigmaPX0055-3
PentobarbitalMillipore SigmaP3761
R26R-EYFPThe Jackson Laboratory6148
Rho inhibitor Y-27632Tocris1254
R-spondinPeprotech120-38
Sodium HydroxideFisher ScientificS318-500
Sterile Filtered Donkey SerumEquitech-Bio Inc.SD30-0500
Sterile Filtered Donkey SerumEquitech-Bio Inc.SD30-0500
Triton X-100Millipore Sigmax100-500MLLaboratory grade
Trypsin EDTA 0.05%Thermo Fisher Scientific25300-062

References

  1. Macias, H., Hinck, L. Mammary gland development. Wiley Interdisciplinary Reviews in Developmental Biology. 1 (4), 533-557 (2012).
  2. Daniel, C. W., De Ome, K. B., Young, J. T., Blair, P. B., Faulkin, L. J. The in vivo life span of normal and preneoplastic mouse mammary glands: a serial transplantation study. Proceedings of the National Academy of Science U S A. 61 (1), 53-60 (1968).
  3. Ip, M. M., Asch, B. B. . Methods in Mammary Gland Biology and Breast Cancer Research. , (2000).
  4. Shackleton, M., et al. Generation of a functional mammary gland from a single stem cell. Nature. 439 (7072), 84-88 (2006).
  5. Stingl, J., et al. Purification and unique properties of mammary epithelial stem cells. Nature. 439 (7079), 993-997 (2006).
  6. Lasfargues, E. Y. Cultivation and behavior in vitro of the normal mammary epithelium of the adult mouse. II. Observations on the secretory activity. Experimental Cell Research. 13 (3), 553-562 (1957).
  7. Simian, M., Bissell, M. J. Organoids: A historical perspective of thinking in three dimensions. Journal of Cell Biology. 216 (1), 31-40 (2017).
  8. Orkin, R. W., et al. A murine tumor producing a matrix of basement membrane. Journal of Experimental Medicine. 145 (1), 204-220 (1977).
  9. Lee, E. Y., Parry, G., Bissell, M. J. Modulation of secreted proteins of mouse mammary epithelial cells by the collagenous substrata. Journal of Cell Biology. 98 (1), 146-155 (1984).
  10. Lee, E. Y., Lee, W. H., Kaetzel, C. S., Parry, G., Bissell, M. J. Interaction of mouse mammary epithelial cells with collagen substrata: regulation of casein gene expression and secretion. Proceedings of the National Academy of Science U S A. 82 (5), 1419-1423 (1985).
  11. Bissell, M. J., Barcellos-Hoff, M. H. The influence of extracellular matrix on gene expression: is structure the message?. Journal of Cell Science. 8 (Suppl), 327-343 (1987).
  12. Petersen, O. W., Ronnov-Jessen, L., Howlett, A. R., Bissell, M. J. Interaction with basement membrane serves to rapidly distinguish growth and differentiation pattern of normal and malignant human breast epithelial cells. Proceedings of the National Academy of Science U S A. 89 (19), 9064-9068 (1992).
  13. Jarde, T., et al. Wnt and Neuregulin1/ErbB signalling extends 3D culture of hormone responsive mammary organoids. Nature Commununications. 7, 13207 (2016).
  14. Sachs, N., et al. A Living Biobank of Breast Cancer Organoids Captures Disease Heterogeneity. Cell. 172 (1-2), 373-386 (2018).
  15. Daniel, C. W., Strickland, P., Friedmann, Y. Expression and functional role of E- and P-cadherins in mouse mammary ductal morphogenesis and growth. Developmental Biology. 169 (2), 511-519 (1995).
  16. Runswick, S. K., O'Hare, M. J., Jones, L., Streuli, C. H., Garrod, D. R. Desmosomal adhesion regulates epithelial morphogenesis and cell positioning. Nature Cell Biology. 3 (9), 823-830 (2001).
  17. Chanson, L., et al. Self-organization is a dynamic and lineage-intrinsic property of mammary epithelial cells. Proceedings of the National Academy of Science U S A. 108 (8), 3264-3269 (2011).
  18. Honvo-Houeto, E., Truchet, S. Indirect Immunofluorescence on Frozen Sections of Mouse Mammary Gland. Journal of Visualized Experiments. (106), e53179 (2015).
  19. Macias, H., et al. SLIT/ROBO1 signaling suppresses mammary branching morphogenesis by limiting basal cell number. Developmental Cell. 20 (6), 827-840 (2011).
  20. Welm, B. E., Dijkgraaf, G. J., Bledau, A. S., Welm, A. L., Werb, Z. Lentiviral transduction of mammary stem cells for analysis of gene function during development and cancer. Cell Stem Cell. 2 (1), 90-102 (2008).
  21. Smith, P., et al. VANGL2 regulates luminal epithelial organization and cell turnover in the mammary gland. Scientific Reports. 9 (1), 7079 (2019).
  22. Lee, G. Y., Kenny, P. A., Lee, E. H., Bissell, M. J. Three-dimensional culture models of normal and malignant breast epithelial cells. Nature Methods. 4 (4), 359-365 (2007).
  23. Campbell, J. J., Davidenko, N., Caffarel, M. M., Cameron, R. E., Watson, C. J. A multifunctional 3D co-culture system for studies of mammary tissue morphogenesis and stem cell biology. PLoS One. 6 (9), e25661 (2011).
  24. Labarge, M. A., Garbe, J. C., Stampfer, M. R. Processing of human reduction mammoplasty and mastectomy tissues for cell culture. Journal of Visualized Experiments. (71), e50011 (2013).
  25. Marlow, R., Dontu, G. Modeling the breast cancer bone metastatic niche in complex three-dimensional cocultures. Methods in Molecular Biology. 1293, 213-220 (2015).
  26. Koledova, Z., Lu, P. A 3D Fibroblast-Epithelium Co-culture Model for Understanding Microenvironmental Role in Branching Morphogenesis of the Mammary Gland. Methods in Molecular Biology. 1501, 217-231 (2017).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

157

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved