القياس الكمي لمقاومه المضادات الحيوية بوساطة البلازما في نهج التطور التجريبي

Tanita Wein; Fenna  T. Stücker; Nils  F. Hülter; Tal Dagan

doi:10.3791/60749

Summary

نهجنا التجريبي يوفر استراتيجية لمتابعه وفره البلازميد ومقاومه المضادات الحيوية مع مرور الوقت في السكان البكتيرية.

Abstract

البلازميدات تلعب دورا رئيسيا في الإيكولوجيا الميكروبية والتطور كمركبات نقل الجينات الجانبية وخزانات وظائف الجينات التبعي في السكان الميكروبية. هذا هو الحال بشكل خاص في ظل بيئات سريعة التغير مثل تقلب التعرض للمضادات الحيوية. وقد أظهرنا مؤخرا ان البلازميدات الحفاظ علي جينات مقاومه المضادات الحيوية في القولونية ايشيرشيا دون اختيار إيجابي للوجود البلازميد. هنا نحن وصف النظام التجريبي الذي يسمح بعد كل من النمط الجيني البلازميد والنمط الظاهري في تجارب التطور علي المدى الطويل. نحن نستخدم التقنيات الجزيئية لتصميم البلازميد نموذج التي يتم إدخالها لاحقا إلى نهج نظام دفعه التطور التجريبية في المضيف e. كولاي . نحن نتبع التردد البلازميد مع مرور الوقت عن طريق تطبيق النسخ المتماثلة من السكان e. القولونية في حين تحديد الكمية المقاومة للمضادات الحيوية الثبات. الاضافه إلى ذلك ، فاننا نراقب التشكيل من البلازميدات في الخلايا المضيفة عن طريق تحليل مدي تشكيل المولد البلازما بواسطة الوخز بالبلازما والكهربائية هلام اجنشا. مثل هذا النهج يسمح لنا لتصور ليس فقط حجم الجينوم من البلازميدات المتطورة ولكن أيضا التشكيل الخاص بهم السطحية-عامل مهم للغاية لوراثة البلازميد. يجمع نظامنا بين الاستراتيجيات الجزيئية والطرق المجهرية التقليدية ويوفر اعدادا لمتابعه البلازميدات في البكتيريا السكانية لفتره طويلة. ويمكن تطبيق النهج المقدم لدراسة مجموعه واسعه من العناصر الجينية المتنقلة في المستقبل.

Introduction

البلازميدات هي العناصر الجينية الدائرية والمكررة ذاتيا والمنتشرة في كل مكان في النواة. فهي عوامل نقل الجينات الجانبية ، لأنها يمكن ان تنقل الصفات بين السكان الميكروبية ، التالي تعتبر ان تلعب دورا رئيسيا في التطور الميكروبي. البلازميدات هي المحركات للتكيف السريع مع الظروف التي تحد من النمو علي مدي فتره قصيرة (علي سبيل المثال ، في وجود المضادات الحيوية أو المبيدات¹) وهي مسؤوله عن الانتقال علي المدى الطويل إلى أنماط نمط الحياة الأخرى (علي سبيل المثال ، ظهور الامراضيه²). والامثله الأكثر لفتا لتاثير البلازميدات علي نقل الجينات موثقه في النظم الايكولوجيه المعرضة لتقلب مستويات المضادات الحيوية ، مثل العيادات الطبية أو في المزارع الصناعية³. بسبب الاختيار الإيجابي القوي ، البلازميدات ترميز العديد من الجينات لمقاومه مضادات الميكروبات وغالبا ما يتم العثور عليها لتمنح المقاومة المتعددة للمضيف البكتيري. البلازميدات تمكين الهجرة بين السكان أو الأنواع البكتيرية ، مما ادي إلى انتشار سريع لمقاومه مضادات الميكروبات المتعددة. في ظل ظروف غير انتقائية البلازميدات ليست ضرورية للخلية وغالبا ما يشار اليها باسم العناصر الطفيلية. ومع ذلك ، البلازميدات في كل مكان في الطبيعة وتطورها متشابكة للغاية مع الكروموسومات البكتيرية. يظل الثبات في البيئات الطبيعية (المتقلبة وغير الانتقائية) غير مفهوم بشكل سيئ ، ومع ذلك فانه ذو اهميه عاليه لفهمنا لاستمرار جينات مقاومه المضادات الحيوية في الطبيعة.

التطور التجريبي هو أداه قويه لدراسة السكان الميكروبية⁴. وأظهرت التطورات التجريبية ان فرض اختيار قوي للصيانة البلازميد يؤدي إلى التعويضية (اي التكيف) تطور الكروموسوم البلازميد أو المضيف الذي يقلل من تكلفه البلازميد اللياقة البدنية ، التالي ، يسهل البلازميد وفره (اي ، الثبات البلازميد)⁵^،⁶^،⁷. التالي ، فانه بعد التفاعل بين المضيفين بمرور الوقت قد يكشف عن أليات هامه لتكييف كلا العنصرين. وعلاوة علي ذلك ، فان التطور التجريبي يمكن المرء من قياس وفره الخلايا الحاملة بالبلازما بمرور الوقت في ظل ظروف^{مختلفه 8 و}⁹^و¹⁰.

ويمكن رصد ثبات plasmid في تجارب التطور من قبل العديد من الاستراتيجيات بما في ذلك تدفق الخلوية عن طريق الفرز الخلية المنشطة الفلورسنت (FACS)¹¹، pcr الكمية (qpcr)¹¹، أو في الأساليب القائمة علي الزراعة. يتطلب قياس التدفق الخلوي اله FACS وإدخال جين علامة (فلوري) قابل للكشف ، مثل البروتين الفلوري الأخضر (GFP) ، علي plasmid. ومع ذلك ، قد يغير التعبير gfp العديد من الخصائص الخلوية ، وعلاوة علي ذلك تؤثر علي موقع البلازميد في الخلية¹²، والتي بدورها قد تؤثر علي الوراثة البلازميد اثناء انقسام الخلية. نهج qpcr لقياس وفره البلازميد قد تكون متحيزة للغاية من قبل رقم النسخة البلازميد ، والتي يمكن ان تختلف إلى حد كبير علي طول مرحله نمو البكتيريا وعلي مر الزمن¹³. وأخيرا ، فان النهج القائم علي الثقافة والطلاء يتطلب إدخال جينات العلامات القابلة للتحديد. قد يكون هذا الجين مقاومه المضادات الحيوية ، والتي غالبا ما تكون مشفره علي البلازميدات الطبيعية. التالي ، لا ضرورة للتلاعب الوراثي. مقاومه المضادات الحيوية يمكن ان يتبعها أسلوب الطلاء التقليدية المقلدة. وهكذا ، لدراسة ديناميات البلازميد الطبيعية ، والطلاء المقلدة هي مناسبه تماما لرصد البلازميد المشفرة المضادات الحيوية المقاومة¹⁴.

لتصور جزيئات البلازميد (علي سبيل المثال ، لتقييم حجم البلازميد) قد يتم تطبيق عده طرق. يمكن تضخيم البلازميدات الكامل باستخدام نهج المستندة إلى PCR. ومع ذلك ، وهذا يتطلب تصميم الإشعال محدده ، والتي قد تكون صعبه خلال تجربه التطور ، لان تسلسل البلازميد قد تتغير مع مرور الوقت. الاضافه إلى ذلك ، فانه من الصعب تضخيم المولدات البلازميد في نهج المستندة إلى pcr بسبب مواقع ملزمه متعددة لإشعال pcr. يمكن ان تظهر جزيئات بلازميد مولتيميريك بعد إنهاء النسخ المتماثل البلازميد أو من خلال أعاده تركيب جزيئات البلازميد وموجهه في الغالب من الراس إلى الذيل¹⁵. نهج آخر من التصور البلازميد يجمع بين الهضم الانزيمي من جزيئات البلازميد بواسطة الحمض النووي الوحيد النواة التي اما يلتصق أو نك حبلا الحمض النووي البلازميد مع التحليل الكهربائي هلام الاغاروز. نفس البلازميد من احجام مختلفه (علي سبيل المثال ، مونومرات مقابل المولدات) النتائج في التنقلات هلام مختلفه التي يمكن ملاحظتها عند تصور جزيئات البلازميد. هذا النهج يتيح التصور والتقدير الكمي لمختلف التشكيلات البلازميد (اي الدول المولدة). ويمكن استخدام التشكيل البلازميد كمؤشر علي الاستقرار البلازميد ، وغالبا ما تضيع المولدات البلازميد اثناء انقسام الخلية¹⁶.

في العمل الأخير ، تابعنا ثبات البلازميد في الظروف التي لم تكن انتقائية لوفره البلازميد (اي بدون اختيار المضادات الحيوية). قارننا ثبات البلازميد في درجات حرارة مختلفه (20 درجه مئوية و 37 درجه مئوية) وثلاثه احجام السكان (اي معدلات التخفيف). تطبيق معدلات التخفيف المختلفة ، أو اختناقات السكان ، ويسمح للتحقيق في تاثير حجم السكان علي البكتيريا وتطور البلازميد. بناء علي نتائجنا ، نقترح ان البلازميدات يمكن ان تكون محايده للمضيف البكتيرية وقد تتطور الاستقرار دون اي ضغط الاختيار⁸. يتم منح الاستقرار البلازميد المتطورة من خلال الحد من تشكيل مولميد البلازما⁸.

هنا ، نقدم بروتوكولا للقياس الكمي لثبات البلازميد والتحقيق في تطور البلازميد فيما يتعلق بالحفاظ علي جينات مقاومه المضادات الحيوية. الأسلوب لديه عده خطوات ، بما في ذلك إدخال جين مقاومه المضادات الحيوية إلى البلازميد نموذج (والتي يمكن حذفها عند استخدام البلازميد المقاومة الطبيعية) ، تليها استخدام التطور التجريبي لتقييم إمكانات البلازميد للاستمرار في ظل ظروف غير انتقائية في حين تحديد ديناميات التردد البلازميد مع مرور الوقت باستخدام الطلاء المقلدة ، وتحليل الجينوم البلازميد من خلال التصور. تم تصميم البروتوكول الموصوف هنا للتحقيق في تطور واستمرار البلازميدات ، ولكن يمكن تطبيقه أيضا لمتابعه تطور جينات مقاومه الكروموسومات (أو جينات العلامات الأخرى) مع مرور الوقت.

Protocol

1. بناء نموذج البلازميد تحمل جين مقاومه المضادات الحيوية

ملاحظه: تم استخدام سلاله اساشيكيا القولونية ك-12 MG1655 كنموذج الكائن الحي في جميع التجارب (DSM no. 18039 ، مجموعه المانيه من الكائنات الدقيقة والثقافات خليه ، DSMZ). واستخدمت سلاله e. القولونية DH5α¹⁷ خلال البناء البلازميد.

Pcr تضخيم العمود الفقري البلازميد من اختيارك وتضخيم الجينات المقاومة بما في ذلك المنطقة المروج من قبل PCR (الشكل 1).
1. PCR تضخيم العمود الفقري البلازميد باستخدام البوليميرات عاليه الدقة والقلة الكريات الpBBR1_forه (5 '-gcggccaccggctggct-3 ') والpBBR1_rev (5 '-taccggaccbtcctcgtc-3 ') علي قالب البلازميد pLC (جينبانك acc. MH238456)¹⁸.
2. PCR تضخيم المقاومة الجينات الوطنية بما في ذلك المروج Tn5 الأصلي¹⁹ باستخدام البوليميرات عاليه الدقة وقله عدد الكريات الحمر nptII_gib_for (5 '-g CCGGTAGATCTGCTCATGTTGAAGCTTCACGCTGCCGCA-3 ') والnptII_gib_rev (5 '------------------3 '). الجينات المعهد القطري للتكنولوجيا للفوسفونوترانسفيرتاز نيومايسين ويضفي مقاومه لكاناميسين.
  ملاحظه: تصميم الإشعال لجين المقاومة مع ما يقرب من 20 bp من تسلسل التكميلية إلى العمود الفقري البلازميد انه سيتم تنصهر إلى.
نظف كلا من أجزاء PCR باستخدام طقم من اختيارك.
الانضمام إلى تنقيه الجينات المقاومة للمضادات الحيوية PCR المنتج (بما في ذلك المنطقة المروج لها) إلى العمود الفقري المنقي والصمامات المتجانسة المناطق المتماثلة باستخدام متساوي الجمعية²⁰، في 50 درجه مئوية ل 60 دقيقه.
الكترونات المنتج تنصهر في سلاله e. القولونية DH5α.
1. إدخال 2 μL من المنتج من الخطوة 1.3 إلى 40 μL من الخلايا الكهربية في 2 مم cuvettes في 4 ° c و 2.5 kV. أعاده التعليق الخلايا في 1 مل من المرق lysogeny (LB) المتوسطة.
2. نقل الحجم الكلي إلى أنبوب الطارد المجهري واحتضان 1 ح في 37 درجه مئوية تهتز في 250 دوره في الدقيقة في شاكر المدارية للسماح للتعبير عن علامة المقاومة علي plasmid.
3. لوحه 100 μL من الخلايا علي لوحات أجار LB التي تحتوي علي المضادات الحيوية المناسبة (كاناميسين 25 ميكروغرام/مل) لتحديد لجين مقاومه المضادات الحيوية التالي تحديد للخلايا التي تحمل plasmid. تدور بقية ، وأزاله supernatant ، وأعاده تعليق الخلايا في 100 μL LB ولوحه علي لوحه أجار انتقائية. احتضان لوحات في 37 درجه مئوية لمده 24 ساعة.
من أجل التحقق من الاستنساخ ، واستخراج البلازميدات التي شيدت عن طريق التحلل القلوية باستخدام مجموعه مصغره الاعداديه التجارية.
1. حصاد 5 مل من الثقافة الثابتة بين عشيه وضحيها من قبل يطرد في 12,000 x g في درجه حرارة الغرفة. أعاده تعليق الخلايا في حل أعاده التعليق ، ثم lyse وتحييد حل الخلية. الطرد المركزي لمده 5 دقائق في 12,000 x g.
2. نقل ماده طافي إلى عمود ربط الحمض النووي المقدمة في عده وغسل العمود مرتين مع 500 μl محلول الغسيل يطرد 2x قبل التملص من غشاء العمود مع العازلة.
3. تنفيذ تسلسل sanger من البلازميد للتاكد من ان التسلسل هو الصحيح.
مره واحده يتم التحقق من صحة البلازميد ، كهربية البلازميد (الآن pcon) في سلاله e. القولونية MG1655 كما هو موضح أعلاه. وهذا غله سلاله e. القولونية MG1655 pcon.

2. رصد البكتيريا التي تحمل plasmid تحت ظروف مختلفه مع مرور الوقت

ملاحظه: تجري تجربه التطور مع سلالات البلازما الحاملة تحت ظروف غير انتقائية (LB media) في درجه حرارة اثنين (37 درجه مئوية و 20 درجه مئوية) وثلاثه احجام السكان اختناق. ويستخدم التصميم التجريبي لدراسة ثبات البلازميد في ظل ظروف مختلفه.

تصميم تجربه تطور لمتابعه التردد البلازميد مع مرور الوقت (الشكل 2)
1. لوحه البلازما التي شيدت سلاله تحمل (e. كولاي MG1655 pcon) علي لوحات أجار LB تستكمل مع المضادات الحيوية (كاناميسين 25 ميكروغرام/مل) واحتضان بين عشيه وضحيها في 37 درجه مئوية.
2. اعداد 96 لوحات عميقة البئر مع 1 مل من المتوسطة LB في كل بئر. كاسلاف البكتيرية ، واختيار ثماني مستعمرات معزولة عشوائية من لوحه أجار في الآبار المستقلة. احتضان لوحات في 37 درجه مئوية و 450 دوره في الدقيقة علي لوحه شاكر ل 24 ح. اعداد مخزون الجلسرين المجمدة من المستنسخين الأجداد.
3. وفي اليوم التالي ، ينقل السكان الثمانية نسخا متماثلة إلى لوحات عميقة جديده وفقا للتصميم التجريبي (الشكل 2). يتم تخفيف الثقافات 1:100 (اختناق كبير ، L) ، 1:1000 (عنق الزجاجة المتوسطة ، M) ، أو 1:10000 (عنق الزجاجة الصغيرة ، S) في الحجم الإجمالي لل 1 مل LB باستخدام تلفزيوني لتخفيف. حضنت ال يضعف ثقافات علي حد سواء في 37 [ك] و 20 [ك.].
  ملاحظه: انه من المهم للغاية للسيطرة علي التلوث المتبادل في لوحه 96-ديب بئر. التالي ، استخدم تصميم لوحه الشطرنج عن طريق الربط الآبار الملقحة مع البكتيريا خاليه LB المتوسطة. استخدم هذا النمط من خلال تجربه التطور بأكملها.
4. يتم نقل الثقافات المحتضنة في 37 درجه مئوية كل 12 ساعة بينما يتم نقل الثقافات في 20 درجه مئوية كل 24 ساعة.
  ملاحظه: خلال كل حدث نقل يتم تطبيق العلاج حجم اختناق ويتم تكرار النقل التسلسلي أكثر من إجمالي التحويلات 98. سيعتمد عدد التحويلات علي التصميم التجريبي للقراء.
5. اعداد مخزون الجلسرين المجمدة من جميع السكان بانتظام ، 2x في الأسبوع.
مراقبه التردد البلازميد بواسطة الطلاء المتماثلة (الشكل 3)
ملاحظه: خلال تجربه التطور ، يتم تقدير تواتر خلايا البلازما الحاملة في السكان من نسبه المضيفين. يتم عرض بروتوكول الطلاء النسخة المتماثلة في الشكل 3.
1. لتحديد التردد البلازميد في السكان خلال تجربه التطور ، والثقافات ثابته المخفف ومطلي علي لوحات أجار غير انتقائي LB. ضبط التخفيف وفقا لعائد من المستعمرات 250-500 لكل لوحه.
  ملاحظه: اعداد لوحات أجار £ سميكه قبل الطلاء (~ 30 مل أجار).
2. يتم احتضان السكان مطلي للنمو بين عشيه وضحيها وفقا لدرجه حرارة النمو في التجربة.
  ملاحظه: المستعمرات بحاجه إلى ان تكون صغيره ، التالي احتضان < 24 ساعة في 37 درجه مئوية.
3. بعد النمو بين عشيه وضحيها ، عد جميع المستعمرات باستخدام دليل أو محطه العد مستعمره الألى وحساب إجمالي حجم السكان البكتيرية في الثقافات.
  ملاحظه: المستعمرات علي حافه لوحه أجار لا ينبغي ان تدرج في عدد الخلايا البكتيرية الإجمالي.
4. تعقيم القطع المربعة (~ 20 × 20 سم) من المخمل القطني عن طريق التعقيم.
  ملاحظه: القماش المخملية يحتاج إلى ان يكون 100 ٪ من القطن لتكون قابله للتعقيم. من المهم تجفيف القماش بعد التعقيم.
5. بعد التعقيم من القماش المخملية ، ووضع القماش علي كتله مستديرة وإصلاحه مع حلقه معدنيه. من الضروري تجنب التجاعيد. وضع بعناية لوحه مع المستعمرات نمت (أجار التي تواجه أسفل) علي سطح القماش المخملية الثابتة. تاكد من ان جميع المستعمرات تلمس سطح المخملية عن طريق التنصت بعناية علي طبق بيتري بطريقه دائريه.
6. بعناية أزاله لوحه أجار رطل ووضع لوحه انتقائية تستكمل مع المضادات الحيوية (كاناميسين 25 ميكروغرام/مل) علي القماش المخملية. تاكد من ان لوحه لمس كل المخمل عن طريق التنصت بعناية علي طبق بيتري كما هو موضح من قبل. بعد ذلك ، قم بازاله اللوحة. ترك لوحات في درجه حرارة الغرفة للنمو بين عشيه وضحيها.
7. في اليوم التالي ، وتقييم كل من لوحه أجار LB ولوحه انتقائية. وتحسب المستعمرات التي تنمو علي وسائل الاعلام الانتقائية كما المضيفين البلازميد (اي مقاومه المضادات الحيوية) ، في حين ان البقع الخالية من المستعمرات هي مستعمرات التي كانت البلازميد خاليه التالي لا تقاوم المضادات الحيوية (اي ، فقدت البلازميد). ويتم ذلك عن طريق وضع لوحات علي بعضها البعض ومقارنه النمو (اي ، علامة اي المستعمرات المفقودة) وعد عدد مستعمره علي كل لوحات. وهذا يعطي عدد الخلايا التي فقدت البلازميد اثناء تجربه التطور.
8. كرر هذا الاجراء علي طول تجربه التطور بالبالكامل بطريقه منتظمة (علي سبيل المثال ، كل 14 عمليه نقل).

3. التصور من المولدات البلازميد باستخدام الكهربائي هلام

ملاحظه: استخراج Plasmid من البلازميدات النسخ المنخفضة غالبا ما يؤدي إلى التلوث مع الحمض النووي المضيف الكروموسومات التي تحتاج إلى انزيمي هضمها قبل التصور.

استخراج الحمض النووي البلازميد من 5 mL الخلية الثابتة بين عشيه وضحيها الثقافة باستخدام تحلل القلوية كما هو موضح في الخطوة 1.5.
بعد ذلك ، عالج الحمض النووي المستخرج من البلازما مع DNase المعتمد علي ATP والذي يقطع الحمض النووي الصبغي فقط لأزاله التلوث بالحمض النووي الصبغي (انظر جدول المواد). احتضان في 37 درجه مئوية لمده 30 دقيقه. بعد ذلك ، تنظيف الحمض النووي باستخدام مجموعه من اختيارك.
لإنشاء جزيئات دائره مفتوحة من جميع التشكيلات البلازميد (مونومرات أو المولدات) ، احتضان عينات الحمض النووي البلازميد مع انزيم الخداع (Nb. bsrdi) واحتضان لمده 30 دقيقه في 65 درجه مئوية.
في موازاة ذلك ، لإنشاء جزيئات البلازميد الخطية (اي ، لمقارنه حجم البلازميد) ، استخدم انزيم تقييد من اختيارك (علي سبيل المثال ، hindiii) الذي يلتصق البلازميد مره واحده.
ملاحظه: هذه النتائج في مونومرات الحمض النووي الخطية. لا تهاجر جزيئات الدائرة المفتوحة بطريقه خطيه.
لتصور حجم البلازميد والتشكيل ، اليكتروفوريس سرق والخطية البلازميد الحمض النووي عينات لمده 120 دقيقه في 4.3 V/سم في 1 ٪ (ث/الخامس) اجنشا هلام و 1 × العازلة تاي. العينات ملطخه باللون الأخضر Midori ويتم تصور هلام علي نظام التصوير هلام (انظر جدول المواد). استخدام سلم 1 kbp.

النتائج

هنا ، نقدم نهجا لدراسة تطور البلازميد من خلال القياس الكمي الثبات البلازميد في السكان. أولا ، ونحن نظهر كيفيه بناء البلازميد تحمل e. القولونية سلاله MG1655 pcon التي يتم إدخالها في وقت لاحق إلى تجربه التطور. ثانيا ، نقدم طريقه مباشره لمتابعه وفره البلازميد في السكان البكتيرية المتطورة. وأخيرا ، فاننا نظهر كيفيه تصور حجم جزيء البلازميد والتشكيل.

في عملنا السابق⁸ باستخدام النهج المقدمة أجرينا تجربه تطور بعد استمرار البلازميدات مقاومه المضادات الحيوية في كولاي في غياب المضادات الحيوية (الشكل 4). وتظهر نتائجنا التمثيلية تطور السكان عند 37 درجه مئوية ومعدل تخفيف 10^-4. وبعد وفره الخلايا التي تحمل البلازما ، لاحظنا انخفاضا في الخلايا المضيفة التي تحمل البلازما بمرور الوقت (الشكل 4). وقد مكننا نهجنا من اكتشاف ان خسارة البلازميد كانت نتيجة للهندسة المعمارية المكثفة لجينوم البلازما ، مما ادي إلى عدم استقرار البلازما الناجم عن الصراعات التي أدخلت عن طريق نسخ الجينات المقاومة والنسخ المتماثل لل البلازميد نفسها. تصور جزيئات البلازميد مكنتنا من اكتشاف ان هذه الصراعات أدت إلى التكوين البلازميد غير مستقره (اي تشكيل المولد البلازما ، الشكل 5). ومع ذلك ، لاحظنا تطور الاستقرار البلازميد دون التعرض للمضادات الحيوية (الشكل 4). وقد منحت الاستقرار المتطورة من قبل الازدواجية البلازميد المتاصله التي ألغت الصراعات النسخ المتماثل والاستنساخ وأديت إلى تشكيل البلازميدات الموروثة بشكل مستقر. التالي فان نتائجنا تبرهن علي اهميه أعاده الدمج وتضخيم الجينوم في التطور التكيفيه للعناصر الجينية.

figure-results-1734
الشكل 1: تصميم Plasmid من pCON. التمثيل التخطيطي لاستراتيجية الاستنساخ المستخدمة لبناء البلازما pCON. ال [بلميد] عمود فقري (pBBR1) ومضاد للجراثيم مقاومه مورثه ([nptii]) [بكر] يضخم وتنصهر ب [اسثرمل] انصهار²⁰. وهذا يعطي البلازما pcon وسلاله MG1655 pCON. يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.

figure-results-2318
الشكل 2: تصميم تجربه التطور علي المدى الطويل. التمثيل التخطيطي لتجربه النقل التسلسلي. ويتم طلاء السكان الذين يحملون البلازما (pCON) علي وسائل الاعلام الانتقائية. يتم اختيار مستعمرات الأسلاف عشوائيا من اللوحة وإدخالها في نظام النقل التسلسلي. وتجري عمليات النقل بثلاثه نهج تخفيف مختلفه لمحاكاة اختناقات السكان باحجام مختلفه. وتتكرر التخفيفات بصوره متسلسلة. وتجري التجربة في نظامين لدرجات الحرارة. يتم قياس التردد plasmid-المضيف علي طول التجربة عن طريق طلاء النسخة المتماثلة. يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.

figure-results-3090
الشكل 3: طبق الطلاء. التمثيل التخطيطي للخطوات المستخدمة في طلاء النسخ المتماثلة من السكان البكتيرية. يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.

figure-results-3490
الشكل 4: تردد pcon التمثيلي مع مرور الوقت. ويظهر ثبات pCON علي انه نسبه المضيفين (الممثلين الذين يكررون التعداد السكاني) اثناء تجربه التطور. النسبة لعمليات النقل 98 ، تطورت المجموعات السكانية بالبلازما في ظل ظروف غير انتقائية مع عامل تخفيف قدره 10^-4. جميع النسخ المتماثلة التي تحمل البلازما pCON انخفضت في السكان. وبعد ذلك ، تعرض السكان للمضادات الحيوية للحضانة الليلية وكانوا يزرعون مره أخرى في ظل ظروف غير انتقائية لاختبار تطور الاستقرار البلازميد. وقد تم تعديل هذا الرقم من وين وآخرون⁸الرجاء انقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.

figure-results-4313
الشكل 5: التحليل التمثيلي للتشكيل البلازميد. التصور من النموذج بلازميد pCON. تصور هو الحمض النووي البلازميد غير المعالجة مباشره بعد استخراج ، خطي الحمض النووي البلازميد ، وتعامل مع dnase ان يقطع فقط الحمض النووي الصبغي وكذلك الحمض النووي انزيمي سرق (اي ، دائره مفتوحة البلازميد الحمض النووي). يوضح البلازما ان جميع البلازميداتات من نفس الحجم. أزاله الحمض النووي الصبغي والخداع pCON يكشف عن وجود الدمامل وغيرها من المولدات. وقد تم تعديل هذا الرقم من وين وآخرون⁸. يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.

Discussion

في هذا البروتوكول ، ونحن نقدم نهج يجمع بين التقنيات في البيولوجيا الجزيئية ، والتطور التجريبي ، والتصور الحمض النووي للتحقيق في دور التطور البلازميد لاستمرار مقاومه المضادات الحيوية في البكتيريا. علي الرغم من ان النهج المعروض يجمع بين الأساليب من مجالات البحث المختلفة ، فان جميع التقنيات التطبيقية واضحة ويمكن تنفيذها في مختبر الميكروبيولوجيا القياسي.

وتشمل الخطوات الأكثر اهميه في البروتوكول بناء سلاله النظام النموذجي التي تشمل التحقق الوراثي من النمط الجيني الحامل بالبلازما. ولا سيما ، العديد من البلازميدات ترميز بشكل طبيعي جينات مقاومه المضادات الحيوية. التالي ، قد يغفل القارئ الخطوة 1 من البروتوكول والمضي قدما مباشره مع الخطوة 2. وبعد ذلك ، ينبغي ان تشمل تجارب التطور تصميما عشوائيا لتكرار السكان بحيث لا تكون النتائج متحيزة بموقف السكان المتماثلين في الصفيحة العميقة. الاضافه إلى ذلك ، من المهم بشكل خاص اجراء النقل التسلسلي وخطوات التخفيف في تجربه التطور بعناية لان التلوث سيؤدي إلى تزوير النتائج. وأخيرا ، يجب ان تجري الطلاء المقلدة بعناية كبيره. حجم مستعمره كبيره قد يكون مشكله ، ولكن يمكن تجنبها عن طريق احتضان لوحات لمده اقل من 24 ساعة. المثل ، فان عدد المستعمرات علي لوحه واحده قد التحيز نتائج الطلاء النسخة المتماثلة. ولذلك ، يجب تخفيف السكان قبل الطلاء والنسخ المتماثل.

واحده من أكبر مزايا نهجنا هو انه يمكن استنساخها بسهوله دون الحاجة إلى المعدات الثقيلة. الاضافه إلى ذلك ، ميزه أخرى من الطلاء النسخة المتماثلة لاتباع علامة الجينات هو ان يتم تقييم الخلايا الحية فقط ، علي النقيض من التدفق الخلوي أو qPCR في الخلايا الميتة التي يمكن تقييمها علي قيد الحياة. التالي ، الطلاء النسخة المتماثلة يقدم التحيز اقل للعد من الخلايا الحاملة plasmid. ومع ذلك ، قد يكون أحد القيود علي الطلاء النسخة المتماثلة حجم السكان (اي رقم الخلية) التي من الممكن تقييم في تشغيل تجريبي واحد.

باستخدام نهجنا ، لقد أظهرنا مؤخرا ان تطور الاستقرار البلازميد يقوي استمرار جينات مقاومه المضادات الحيوية في البكتيريا. وهكذا ، قمنا بتطوير نهج كاداه لمتابعه المقاومة بوساطة البلازما التي هي ذات اهميه كبيره لمتابعه المقاومة مع مرور الوقت وخاصه في ظل ظروف دون وجود المضادات الحيوية.

Disclosures

وليس لدي المؤلفين ما يفصحون عنه.

Acknowledgements

نشكر غور مارغاريان علي الدعم الإبداعي والمساعدة الفنية. تم دعم هذا العمل من قبل ZMB عالم الشباب منحه 2017/2018 (منحت لTW) وبرنامج التركيز DFG 1819 (منح رقم. DA1202/2-1 الممنوحة إلى TD).

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
96-deep-well plates	Starlab
96-deep-well plates	Roth	EN07.1	2 ml, square
96-deep-well plates (cryo)	Starlab	E1702-8400	Micro-Dilution Tube System
Colony counter	Stuart	SC6+
Cotton velvet	drapery shop		100 % cotton required
Electrophoresis chamber	BioRad		Agarose gel electrophoresis
Electrophoresis power supply	BioRad	1645070	Agarose gel electrophoresis
Electroporation cuvettes	BioRad	1652089	0.1 cm
Electroporator	BioRad	1652660
GeneJet Gel Extraction kit	Thermo Fisher Scientific	K0832	PCR fragment clean-up
GeneJet Plasmid Miniprep kit	Thermo Fisher Scientific	K0503	Plasmid extraction kit
Gibson Assembly	New England Biolabs	E2611S
Incubator	Thermo Fisher Scientific	50125852
Incubator (plate shaker)	Heidolph	1000
Incubator (shaker)	New Brunswick Scientific	Innova 44
Inoculating loops	Sigma-Aldrich
Multi-channel pippetes	Eppendorf	3125000052, 3125000028
Multi-channel pippetes	Capp	ME8-1250R
NanoDrop 2000/2000c	Thermo Fisher Scientific	ND2000
Oligonucleotides	Eurofines
Petri dishes	Sigma-Aldrich
Phusion Polymerase	Thermo Fisher Scientific	F533S
Pipettes	Eppendorf	3123000012, 3123000098, 3123000055, 3123000063,
PlasmidSafe enzyme	Epicentre	10059400
Reaction tubes	Eppendorf	30125150
Replica block & metal ring	VWR	601-3401	PVC cylinder 69 mm; ring 102cm
Resctriction enzymes	New England Biolabs
Thermocycler	BioRad	T100

References

San Millan, A. Evolution of plasmid-mediated antibiotic resistance in the clinical context. Trends in Microbiology. 26 (12), 978-985 (2018).
Bruto, M., James, A., et al. Vibrio crassostreae, a benign oyster colonizer turned into a pathogen after plasmid acquisition. The ISME Journal. 11 (4), 1043-1052 (2017).
von Wintersdorff, C. J. H., et al. Dissemination of antimicrobial resistance in microbial ecosystems through horizontal gene transfer. Frontiers in Microbiology. 7 (110), 305-310 (2016).
Lenski, R. E. Experimental evolution and the dynamics of adaptation and genome evolution in microbial populations. ISME Journal. 11 (10), 2181-2194 (2017).
De Gelder, L., Williams, J. J., Ponciano, J. E. M., Sota, M., Top, E. M. Adaptive plasmid evolution results in host-range expansion of a broad-host-range plasmid. Genetics. 178 (4), 2179-2190 (2008).
Harrison, E., Guymer, D., Spiers, A. J., Paterson, S., Brockhurst, M. A. Parallel compensatory evolution stabilizes plasmids across the parasitism-mutualism continuum. Current Biology. 25 (15), 2034-2039 (2015).
Bouma, J. E., Lenski, R. E. Evolution of a bacteria/plasmid association. Nature. 335 (6188), 351-352 (1988).
Wein, T., Hülter, N. F., Mizrahi, I., Dagan, T. Emergence of plasmid stability under nonselective conditions maintains antibiotic resistance. Nature Communications. 10 (1), 2595(2019).
Loftie-Eaton, W., et al. Compensatory mutations improve general permissiveness to antibiotic resistance plasmids. Nature Ecology & Evolution. 1 (9), 1354-1363 (2017).
Millan, A. S., et al. Positive selection and compensatory adaptation interact to stabilize non-transmissible plasmids. Nature Communications. 5 (1), 1-11 (2014).
Loftie-Eaton, W., Tucker, A., Norton, A., Top, E. M. Flow cytometry and real-time quantitative PCR as tools for assessing plasmid persistence. Applied and Environmental Microbiology. 80 (17), 5439-5446 (2014).
Münch, K. M., et al. Polar fixation of plasmids during recombinant protein production in Bacillus megaterium results in population heterogeneity. Applied and Environmental Microbiology. 81 (17), 5976-5986 (2015).
Jahn, M., Vorpahl, C., Hübschmann, T., Harms, H., Müller, S. Copy number variability of expression plasmids determined by cell sorting and Droplet Digital PCR. Microbial Cell Factories. 15 (1), 211(2016).
Lederberg, J., Lederberg, M. E. Replica plating and indirect selection of bacterial mutants. Journal of Bacteriology. 63, 399-406 (1952).
Summers, D. K., Sherratt, D. J. Multimerization of high copy number plasmids causes instability: ColE1 encodes a determinant essential for plasmid monomerization and stability. Cell. 36 (4), 1097-1103 (1984).
Summers, D. K., Beton, C. W., Withers, H. L. Multicopy plasmid instability: the dimer catastrophe hypothesis. Molecular Microbiology. 8 (6), 1031-1038 (1993).
Hanahan, D. Studies on transformation of Escherichia coli with plasmids. Journal of Molecular Biology. 166 (4), 557-580 (1983).
Ilhan, J., et al. Segregational drift and the interplay between plasmid copy number and evolvability. Molecular Biology and Evolution. 36 (3), 472-486 (2019).
Beck, E., Ludwig, G., Auerswald, E. A., Reiss, B., Schaller, H. Nucleotide sequence and exact localization of the neomycin phosphotransferase gene from transposon Tn5. Gene. 19 (3), 327-336 (1982).
Gibson, D. G., et al. Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases. Nature Methods. 6 (5), 343-345 (2009).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

154

This article has been published

Video Coming Soon

Keep me updated: