JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

المقدمة هنا هو بروتوكول لاستخدام استخراج الكلي القشرية اعداد وتطبيع البروتين الكلي لإثبات العلاقة بين عامل نمو بطانة الاوعيه الدموية وهرمون ملوتن في الكلي الثدييات.

Abstract

عامل نمو بطانة الاوعيه الدموية (VEGF) يساعد علي التحكم في الاوعيه الدموية والنفاذيه الوعائية في الكلي. الاضطرابات الكلوية ، مثل اعتلال الكلية السكري ، وترتبط مع الخلل VEGF في الكلي. العوامل التي تحكم VEGF في ظل الظروف الفسيولوجية في الكلي ليست مفهومه جيدا. هرمون ملوتن (LH), هرمون الموالية للاوعيه الدموية, يساعد علي تنظيم التعبير VEGF الفسيولوجية في الأعضاء التناسلية. النظر إلى ان مستقبلات LH موجودة في الكلي, ونحن, في معهد البحوث Zietchick, الافتراض هنا ان LH يساعد أيضا علي تنظيم التعبير VEGF في الكلي ، وكذلك. لتقديم الادله ، ونحن تهدف إلى إظهار ان مستويات LH قادره علي التنبؤ بمستويات VEGF في الكلي الثدييات. وقد استخدمت معظم التحقيقات المتعلقة VEGF التي تنطوي علي الكلي اقل الثدييات النظام كنماذج (اي القوارض والأرانب). ولترجمه هذا العمل إلى الجسم البشري ، تقرر دراسة العلاقة بين VEGF و LH في الثدييات عاليه الترتيب (اي نماذج الأبقار والخنازير). يستخدم هذا البروتوكول البروتين الكلي لليات من قشره الكلي. وتشمل مفاتيح نجاح هذا الأسلوب شراء الكلي من المسالخ الحيوانية مباشره بعد الموت ، فضلا عن تطبيع مستويات التحلل (في استخراج الكلي) من قبل مجموع البروتين. تظهر هذه الدراسة بنجاح علاقة خطيه كبيره بين LH و VEGF في كل من الكلي البقري والخنازير. والنتائج قابله للتكرار في نوعين مختلفين. وتقدم الدراسة أدله داعمه علي ان استخدام مقتطفات الكلي من الأبقار والخنازير هي ممتازة واقتصاديه ، وموارد وفيرة لدراسة فسيولوجيا الكلي ، وخاصه لدراسة الارتباط بين VEGF والتحاليل الأخرى.

Introduction

عامل النمو الغشائي الوعائي a (vegf-a) ، يساعد علي تنظيم تولد الاوعيه والنفاذيه الوعائية في الكلي والاجهزه الأخرى1،2 (الاخره ، vegf-a سوف يشار اليها باسم vegf). مستويات VEGF في الكلي تحت سيطرة التماثل الشديد. عندما تكون مستويات VEGF الكلوي مرتفعه أو مكتئبة ، يمكن ان يتعطل الكلي. علي سبيل المثال ، في غضون 3 أسابيع بعد الولادة ، والفئران مع podocyte-الخاصة غير المتجانسة ل VEGF تطوير اندوثيليوسيس والكلي الدموي (اي آلافات الكلوية ينظر في تسمم الحمل البشري) ، والفشل الكلوي المرحلة النهائية يحدث في هذه المتغايرات بنسبه 3 أشهر من العمر. Podocyte-المحددة المقلدة يموتون من موه والفشل الكلوي في غضون 1 يوم من الولادة3,4.

من ناحية أخرى ، الإفراط في التعبير عن الكبد الكلوي يسبب بروتينيه وتضخم الكبيبي3،4. علي سبيل المثال ، الأرانب المحورة وراثيا التي overexpress VEGF المعرض بروتينيه التقدمية مع زيادة معدلات الترشيح الكبيبي في المراحل المبكرة من اعتلال الكلية ، تليها انخفاض معدلات الترشيح الكبيبي في مراحل لاحقه3. اعتلال الكلية السكري ، وهو السبب الرئيسي للمرض الكلوي في نهاية المرحلة في البالغين السكري ، ويرتبط بقوة مع الخلل التنظيمية vegf2،5. وقد تم إيلاء قدر كبير من الاهتمام لدور نقص الأكسجين في حفز التعبير VEGF تحت الظروف المرضية5. ومع ذلك ، فان العوامل التي تحكم vegf تحت الظروف الفسيولوجية (سواء في الكلي والأعضاء الأخرى) ليست مفهومه جيدا2،6. تحديد هذه العوامل (باستثناء الأكسجين) التي تشارك في التنظيم VEGF الفسيولوجية والباثولوجية مهمة هامه.

هرمون ملوتن (LH), هرمون الموالية للاوعيه الدموية, يساعد علي تنظيم التعبير vegf الفسيولوجية في الاجهزه التناسلية مثل المبيض والخصية7,8. وقد قدمت الدراسات السابقة أدله علي ان LH يساعد أيضا علي تنظيم vegf في الأعضاء غير التناسلية ، مثل العينين6،9،10. يتم العثور علي مستقبلات LH في النخاع والقشرة من الكلي11,12. من الملاحظة ، والخلايا الظهاريه أنبوبي الكلي ، فضلا عن مستقبلات LH ، اكسبرس vegf11،12،13،14. أخذ هذه الملاحظات اثنين معا, افترضنا ان LH يساعد أيضا علي تنظيم التعبير vegf في الكلي13,14. لتقديم أدله علي هذه العلاقة LH/VEGF ، يهدف البروتوكول المعروض لإظهار ان مستويات LH قادره علي التنبؤ بمستويات VEGF في الكلي. وقد استخدمت العديد من التحقيقات السابقة المتعلقة بالكلية التي تنطوي علي الكلي نماذج الثدييات اقل من أجل (اي القوارض والأرانب)2. لترجمه هذا العمل إلى الجسم البشري ، تدرس الدراسة العلاقة بين VEGF و LH في اعلي الثدييات النظام (هنا ، ونماذج الأبقار والخنازير). لتنفيذ هذا الهدف ، تم اعداد مجموع البروتين محلله من منطقه القشرة من الكلي البقري والخنازير.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

لم يتم استخدام اي من الكائنات الحية أو التجريبية لهذه الدراسة.

1. التعامل مع الانسجه

  1. شراء الأبقار والخنازير الكلي كامله فورا بعد الذبح من مسلخ. النقل علي الجليد إلى المختبر.
  2. عند الوصول إلى المختبر ، شطف الكلي مع 50 مل من الجليد الباردة الفوسفات مخزنه المالحة (تلفزيوني). كرر هذه الخطوة 2x لأزاله الدم تماما.
  3. الحفاظ علي الكلي علي الجليد (أو المبردة) حتى مزيد من الاستخراج.

2. تشريح الكلي

  1. استخدام مقص معقمه ، ملقط ، سكين ، واطباق بيتري لتشريح الكلي والمكوس جزء الانسجه المطلوبة.
  2. اعداد ريبا تحلل العازلة قبل تشريح الكلي. تذوب 5 مم NaCl ، 0.5 M أدتا ، 1 متر تريس (pH = 8.0) ، NP-40 (ID + جيال CA-630) ، 10 ٪ ديكسيتشوليت الصوديوم ، و 10 ٪ SDS في الماء المقطر المزدوج ، ثم تخلط جيدا. بردت المخزن المؤقت تحلل ريبا عندما لا تكون في الاستخدام.
  3. قطع بلطف الكلي في نصف (السهمي الطائرة) وقطع قطعه من الانسجه (50-70 مم2) من منطقه القشرة في وسط الكلي (وزنها 80-100 ملغ بالوزن الرطب).
  4. فرم كتله الانسجه إلى قطع صغيره بسكين للمساعدة في عمليه التجانس.
  5. بعد فرم الانسجه ، نقلها إلى أنبوب الطارد المجهري مع 1 مل من الجليد الباردة 1x ريبا تحلل استخراج العازلة. ضع الأنابيب في الثلج حتى المزيد من الاستخراج.

3. تجانس الانسجه

  1. تسميه أنابيب الطارد المجهري مع تفاصيل عينه محدده لجمع ماده طافي الانسجه.
  2. باستخدام الخالط المحمولة مع مسبار معقم ، ثم تجانس الانسجه لمده 1-2 دقيقه في الظروف الباردة (عينات علي دلو الجليد) حتى لا أجزاء من الانسجه مرئية.
  3. موضوع مقتطفات الانسجه علي الفور لطرد في جهاز الطرد المركزي المبردة في 9,600 x g لمده 5 دقائق في 4 ° c.
  4. أزاله الأنابيب من جهاز الطرد المركزي ووضعها علي دلو الجليد.
  5. جمع ماده طافي في أنبوب الصغير المسمي جديده وتخزينها علي الجليد. تجاهل بيليه.
  6. اعداد الارصفه منفصلة من supernatants ل LH و VEGF-A الانزيم المرتبطة الاختبارات المناعية (اليسا) وتحليل البروتين الكلي ، علي التوالي ، لتجنب تجميد ذوبان دورات.

4. البقري والخنازير LH اليسا الفحص

  1. تخزين جميع مكونات الفحص ELISA المدرجة في الهرمون المتاح تجاريا (LH) اليسا كيت (انظر جدول المواد) عند 2-8 درجه مئوية. وهذا يشمل الأجسام المضادة ، الاستجابة المناعية ، ولوحه الفحص (96 جيدا) ، والمعايرة ، وغسل العازلة (20x التركيز) ، والركيزة A ، الركيزة B ، والحل التوقف. اعداد جميع الكواشف علي النحو الموصي به من قبل الشركة المصنعة تعليمات.
  2. قبل البدء في الفحص ، وجلب جميع الكواشف وفحص لوحه لدرجه حرارة الغرفة (RT). استخدام العدد المطلوب من الآبار لفحص ، ختم ، والحفاظ علي الآبار غير المستخدمة في 4 درجه مئوية حتى الاستخدام.
  3. تمييع المخزن المؤقت للغسيل (15 مل من التركيز 20x) إلى 300 مل مع الماء المقطر المزدوج
  4. قم باعداد الآبار الفارغة بدون اي حل.
  5. أضافه 50 μL من القياسية أو عينه لكل بئر (ن = 2) ، ثم أضافه آخر 50 μL من البيروكسيديز الفجل (التناسل)-المرافقة لكل بئر. أضافه علي الفور آخر 50 μL من حل الأجسام المضادة لكل بئر. ختم لوحه ، وتخلط جيدا ، واحتضان لمده 1 ساعة في 37 درجه مئوية.
  6. غسل الآبار مع 1x غسل العازلة (200 μL/well) وكرر 4x.
  7. أضافه 50 μL من الركيزة A و 50 μL من الركيزة B لكل بئر ، وتخلط جيدا من خلال التنصت علي لوحه علي الجانب بلطف. ختم لوحه واحتضان لمده 15 دقيقه في 37 درجه مئوية في الظلام لمده 15 دقيقه.
  8. أضافه 50 μL من الحل التوقف لكل بئر ، والاستفادة من لوحه بلطف ، وقراءه لوحه باستخدام مقياس الطيف مجموعه إلى الطول الموجي 450 nm.
  9. تطبيع مستويات LH البقري والخنازير إلى مجموع البروتين (انظر القسم 6).

5. البقري والخنازير VEGF-A اليسا فحص

  1. تخزين جميع مكونات الفحص ELISA المدرجة في المتاحة تجاريا عامل النمو بطانية الاوعيه الدموية-A ELISA مجموعات (انظر جدول المواد) في 2-8 درجه مئوية. وهذا يشمل الأجسام المضادة ، الاستجابة المناعية ، ولوحه الفحص (96 جيدا) ، والمعايرة ، وغسل العازلة (20x التركيز) ، والركيزة A ، الركيزة B ، والحل التوقف. اعداد جميع الكواشف علي النحو الموصي به من قبل الشركة المصنعة تعليمات.
  2. قبل البدء في الفحص ، وجلب جميع الكواشف ولوحه الفحص إلى RT. استخدم العدد المطلوب من الآبار لفحص الآبار وختمها وحافظ علي البئر غير المستخدمة عند درجه حرارة 4 درجات مئوية حتى يتم استخدامها.
  3. تمييع المخزن المؤقت للغسيل (15 مل من التركيز 20x) إلى 300 مل مع الماء المقطر المزدوج
  4. أضافه 100 μL من المعيار أو عينه لكل بئر (ن = 2). ختم لوحه ، وتخلط جيدا ، واحتضان لمده 2 ح في 37 درجه مئوية.
  5. أزاله السائل في كل بئر وأضافه 100 μL من كاشف الكشف A لكل بئر ، ختم لوحه ، واحتضان ل 1 ح في 37 درجه مئوية.
  6. غسل الآبار مع 1x غسل العازلة (400 μL/well) وكرر 4x.
  7. أضافه 100 μL من كاشف كشف B لكل بئر وتخلط جيدا عن طريق التنصت علي لوحه علي الجانب برفق. ختم لوحه واحتضان لوحه لمده 1 ساعة في 37 درجه مئوية.
  8. غسل الآبار مع 1x غسل العازلة (400 μL/well) وكرر 4x.
  9. أضافه 90 μL من محلول الركيزة لكل بئر ، اضغط برفق علي لوحه ، واحتضان ل 1 ح في 37 درجه مئوية.
  10. أضافه 50 μL من الحل التوقف لكل بئر ، والاستفادة من لوحه بلطف ، وقراءه لوحه باستخدام مقياس الطيف مجموعه إلى الطول الموجي 450 nm.
  11. تطبيع الأبقار والخنازير مستويات VEGF-A إلى مجموع البروتين (القسم 6).

6. تقدير البروتين الكلي

  1. تقدير إجمالي البروتين من مستخلصات الكلي البقري والخنازير من قبل الزلال مصل الدم القياسية (بوسنيا) الفحص باستخدام مجموعه تجاريه (انظر جدول المواد) وفقا لتوصيات الشركة المصنعة.

7-التحليل الإحصائي

  1. احسب متوسط الانحراف المعياري والمتوسط لكل من التحاليل.
  2. اختبار الاختلاف في توزيع العينات من الاستخدام العادي Kolmogorov-اختبار سميرنوف ان تقرر ، عند الاستخدام ، بين حدودي مقابل. اختبارات احصائيه غير حدودية. وإذا كانت البيانات توزع عاده ، فقم باجراء اختبار إحصائي عن طريق الاختبارات الحدودية.
  3. في ظل الظروف المناسبة (مثل توزيع البيانات العادي) ، استخدم نماذج الانحدار لفحص العلاقة الخطية بين LH و VEGF-A.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

النتائج

ويبين الجدول 1متوسط ومتوسط مستويات LH و vegf حسب نوع الحيوانية والجنس. بعد التحقق من البيانات الطبيعية من قبل Kolmogorov-سميرنوف اختبار الحياة الطبيعية ، واستخدمت نماذج الانحدار الخطي لدراسة العلاقة بين LH و VEGF. تم العثور علي LH ان يكون مؤشرا قويا وهاما من VEGF في كل من الكلي...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

ان شراء الكلي من المسلخ مباشره بعد موت الماشية هو مفتاح النجاح في هذه المنهجية. وهذه هي الميزة الرئيسية لاستخدام الأعضاء من الأبقار والخنازير بدلا من الجثث البشرية. هناك عاده علي الأقل 12-24 [س] يؤخر من الوقت الموت إلى ان [جثة] انسانيه أجهزه يكون اشتريت. لان التركيب الكيميائي للأعضاء الجسم يتغ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

معهد البحوث zietchick (ZRI) هو معهد البحوث الخاصة (للربح) ، والدكتورة تامي Movsas (مؤسس ومدير ZRI) لديها طلبات براءات الاختراع المعلقة والمصادق عليها لاستخدام مضادات الغدد التناسلية في علاج امراض العين والسكري. وبخلاف كونه موظفا (كيميائيا بيولوجيا) في ZRI ، لا يوجد لدي الدكتور ا. موثوسامي اي نزاعات مالية أخرى للإبلاغ عنها. [ا.]. [اريفلاغان] (فصل صيف متدربه في [زري], طالبه جامعيه في جامعه ميتشيغان) يتلقى ما من أخرى نزاعات مالية ان يبلغ.

Acknowledgements

ويشكر المؤلفون مسلخ شول (بليسفيلد, MI) لتوفير الكلي البقري والخنازير. ولم يستخدم اي تمويل للمنح لهذه الدراسة.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
Bovine LH ELISA KitMyBiosource, San Diego, CA.MBS700951
Bovine VEGF-A ELISA KitMyBiosource, San Diego, CA.MBS2887434
Micro BCA Protein Assay KitThermoFisher Scientific Inc, Columbus, OH.23235
Porcine LH ELISA KitMyBiosource, San Diego, CA.MBS009739
Porcine VEGF-A ELISARay Biotech, Norcross, GA.ELP-VEGFA-1
RIPA Lysis and Extraction BufferThermoFisher Scientific Inc, Columbus, OH.89901

References

  1. Advani, A., et al. Role of VEGF in maintaining renal structure and function under normotensive and hypertensive conditions. Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 104 (36), 14448-14453 (2007).
  2. Majumder, S., Advani, A. VEGF and the diabetic kidney: More than too much of a good thing. Journal of Diabetes and its Complications. 31 (1), 273-279 (2017).
  3. Liu, E., et al. Increased expression of vascular endothelial growth factor in kidney leads to progressive impairment of glomerular functions. Journal of the American Society of Nephrology. 18 (7), 2094-2104 (2007).
  4. Eremina, V., et al. Glomerular-specific alterations of VEGF-A expression lead to distinct congenital and acquired renal diseases. Journal of Clinical Investigation. 111 (5), 707-716 (2003).
  5. Ferrara, N. Vascular endothelial growth factor: basic science and clinical progress. Endocrine Reviews. 25 (4), 581-611 (2004).
  6. Movsas, T. Z., Sigler, R., Muthusamy, A. Vitreous Levels of Luteinizing Hormone and VEGF are Strongly Correlated in Healthy Mammalian Eyes. Current Eye Research. 43 (8), 1041-1044 (2018).
  7. Babitha, V., et al. Luteinizing hormone, insulin like growth factor-1, and epidermal growth factor stimulate vascular endothelial growth factor production in cultured bubaline granulosa cells. General and Comparative Endocrinology. 198, 1-12 (2014).
  8. Trau, H. A., Davis, J. S., Duffy, D. M. Angiogenesis in the Primate Ovulatory Follicle Is Stimulated by Luteinizing Hormone via Prostaglandin E2. Biology of Reproduction. 92 (1), 15(2015).
  9. Movsas, T. Z., et al. Confirmation of Luteinizing Hormone (LH) in Living Human Vitreous and the Effect of LH Receptor Reduction on Murine Electroretinogram. Neuroscience. 385, 1-10 (2018).
  10. Movsas, T. Z., Sigler, R., Muthusamy, A. Elimination of Signaling by the Luteinizing Hormone Receptor Reduces Ocular VEGF and Retinal Vascularization during Mouse Eye Development. Current Eye Research. 43 (10), 1286-1289 (2018).
  11. Hipkin, R. W., Sanchez-Yague, J., Ascoli, M. Identification and characterization of a luteinizing hormone/chorionic gonadotropin (LH/CG) receptor precursor in a human kidney cell line stably transfected with the rat luteal LH/CG receptor complementary DNA. Molecular Endocrinology. 6 (12), 2210-2218 (1992).
  12. Lei, Z. M., et al. Targeted disruption of luteinizing hormone/human chorionic gonadotropin receptor gene. Molecular Endocrinology. 15 (1), 184-200 (2001).
  13. Schrijvers, B. F., Flyvbjerg, A., De Vriese, A. S. The role of vascular endothelial growth factor (VEGF) in renal pathophysiology. Kidney International. 65 (6), 2003-2017 (2004).
  14. Apaja, P. M., Aatsinki, J. T., Rajaniemim, H. J., Petaja-Repo, U. E. Expression of the mature luteinizing hormone receptor in rodent urogenital and adrenal tissues is developmentally regulated at a posttranslational level. Endocrinology. 146 (8), 3224-3232 (2005).
  15. Ondruschka, B., et al. Post-mortem in situ stability of serum markers of cerebral damage and acute phase response. International Journal of Legal Medicine. 133 (3), 871-881 (2019).
  16. Swain, R., et al. Estimation of post-mortem interval: A comparison between cerebrospinal fluid and vitreous humour chemistry. Journal of Forensic and Legal Medicine. 36, 144-148 (2015).
  17. Thompson, C. S., Traynor, I. M., Fodey, T. L., Faulkner, D. V., Crooks, S. R. H. Screening method for the detection of residues of amphenicol antibiotics in bovine, ovine and porcine kidney by optical biosensor. Talanta. 172, 120-125 (2017).
  18. Konstantinou, G. N. Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA). Methods in Molecular Biology. 1592, 79-94 (2017).
  19. Levesque, B. M., et al. Low urine vascular endothelial growth factor levels are associated with mechanical ventilation, bronchopulmonary dysplasia and retinopathy of prematurity. Neonatology. 104 (1), 56-64 (2013).
  20. Leviton, A., et al. Antecedents and early correlates of high and low concentrations of angiogenic proteins in extremely preterm newborns. Clinica Chimica Acta. 471, 1-5 (2017).
  21. Simo-Servat, O., Hernandez, C., Simo, R. Usefulness of the vitreous fluid analysis in the translational research of diabetic retinopathy. Mediators of Inflammation. , 872978(2012).
  22. Sharma, R. K., Rowe-Rendleman, C. L. Validation of molecular and genomic biomarkers of retinal drug efficacy: use of ocular fluid sampling to evaluate VEGF. Neurochemical Research. 36 (4), 655-667 (2011).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

155VEGF

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved