JoVE Logo
Yazarlar
Bize Ulaşın

Oturum Aç

Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Bu Makalede

  • Özet
  • Özet
  • Giriş
  • Protokol
  • Sonuçlar
  • Tartışmalar
  • Açıklamalar
  • Teşekkürler
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

Burada sunulan bir kortikal böbrek ekstresi hazırlık ve toplam protein normalizasyonu vasküler endotelyal büyüme faktörü ve memeli böbrek luteinizing hormon arasındaki korelasyon göstermek için kullanmak için bir protokoldür.

Özet

Vasküler endotelyal büyüme faktörü (VEGF) böbrekte anjiyogenez ve vasküler geçirgenliği kontrol etmeye yardımcı olur. Diyabetik nefropati gibi böbrek hastalıkları böbrekte VEGF disregülasyonu ile ilişkilidir. Böbrekte fizyolojik koşullarda VEGF'yi yöneten faktörler iyi anlaşılamamıştır. Luteinizan hormon (LH), bir pro-anjiyojenik hormon, üreme organlarında fizyolojik VEGF ekspresyonunu düzenlemeye yardımcı olur. LH reseptörlerinin böbrekte bulunduğu göz önüne alındığında, biz, Zietchick Araştırma Enstitüsü'nde, lh de böbrek VEGF ifade düzenleyen yardımcı olur burada hipotez. Kanıt sağlamak için, LH düzeylerinin memeli böbreğindeki VEGF düzeylerini tahmin edebildiğini göstermeyi amaçladık. Böbrek içeren çoğu VEGF ile ilgili araştırmalar model olarak alt düzey memeliler (yani, kemirgenler ve tavşan) kullandık. Bu çalışmayı insan vücuduna çevirmek için, vegf ve LH arasındaki ilişkiyi daha yüksek derecede memelilerde (yani büyükbaş ve domuz modelleri) incelemeye karar verildi. Bu protokol böbrek korteksinden gelen toplam protein lizatını kullanır. Bu yöntemin başarısının anahtarları, ölümden hemen sonra mezbaha hayvanlarından böbrek temini ve analit düzeylerinin (böbrek ekstresinde) toplam proteinle normalleştirilmesidir. Bu çalışma, hem büyükbaş hem de domuz böbreklerinde LH ve VEGF arasında anlamlı bir doğrusal ilişki olduğunu başarıyla göstermektedir. Sonuçlar iki farklı türde tekrarlanabilir. Çalışma, ve domuzböbrek özleri kullanımı nın böbrek fizyolojisi çalışmaları için mükemmel, ekonomik ve bol bir kaynak olduğuna dair destekleyici kanıtlar sunmaktadır, özellikle VEGF ve diğer analitler arasındaki korelasyonun incelenmesi için.

Giriş

Vasküler endotelyal büyüme faktörü A (VEGF-A), böbrek ve diğer organlarda anjiyogenez ve vasküler geçirgenliğin düzenlenmesine yardımcı olur1,2 (bundan sonra, VEGF-A VEGF olarak anılacaktır). Böbrekteki VEGF düzeyleri sıkı homeostatik kontrol altındadır. Böbrek VEGF düzeyleri yükseldiğinde veya depresif olduğunda böbrek arızalanabilir. Örneğin, doğumdan sonraki 3 hafta içinde VEGF için podosite özgü heterozigozluk olan farelerde endotelve kansız glomerül (yani insan preeklampsinde görülen böbrek lezyonları) gelişir ve bu heterozigotlarda 3 aylıkken son dönem böbrek yetmezliği görülür. Podosite özgü homozigot nakavtlar doğumdan sonraki 1 gün içinde hidrops ve böbrek yetmezliğinden ölür3,4.

Öte yandan renal VEGF'nin aşırı ekspresyonu proteinüri ve glomerüler hipertrofiye neden olur3,4. Örneğin, VEGF'yi aşırı eksprese eden transgenik tavşanlar nefropatinin erken evrelerinde artmış glomerüler filtrasyon oranları ile progresif proteinüri sergilerler, bunu daha sonrakievrelerdeazalmış glomerüler filtrasyon oranları 3 . Diyabetik erişkinlerde son dönem böbrek hastalığının önemli bir nedeni olan diyabetik nefropati, VEGF disregülasyonu ile güçlü bir şekilde ilişkilidir2,5. Patolojik koşullar altında VEGF ekspresyonunun indüklemesinde hipoksinin rolüne büyük önem verilmiştir5. Ancak, fizyolojik koşullar altında VEGF yöneten faktörler (böbrek ve diğer organlarda hem de) iyi anlaşılmış değildir2,6. Fizyolojik ve patolojik VEGF regülasyonunda rol oynayan bu faktörlerin (oksijen hariç) belirlenmesi önemli bir girişimdir.

Luteinizan hormon (LH), bir pro-anjiyojenik hormon, yumurtalık vetestis7 gibi üreme organlarında fizyolojik VEGF ekspresyonu düzenleyen yardımcı olur 7,8. Önceki çalışmalar da LH olmayan üreme organları, gözler6,9,10 gibi VEGF düzenleyen yardımcı olduğunu kanıtsağlamıştır. LH reseptörleri medulla ve böbrek korteksinde bulunur11,12. Not, böbrek tübüler epitel hücreleri, yanı sıra LH reseptörü, ekspres VEGF11,12,13,14. Birlikte bu iki gözlem alarak, biz LH da böbrek13,14VEGF ekspresyonunun düzenlenmesine yardımcı olduğunu varsaölçekli . Bu LH/VEGF ilişkisine dair kanıt sağlamak için sunulan protokol, LH düzeylerinin böbrekteki VEGF düzeylerini tahmin edebildiğini göstermeyi amaçlamaktadır. Böbrek içeren birçok önceki VEGF ile ilgili araştırmalar düşük sıramemeli modelleri (yani, kemirgenler ve tavşan)2kullandık. Bu çalışmayı insan vücuduna çevirmek için, çalışma vegf ve LH arasındaki ilişkiyi üst düzey memelilerde (burada, büyükbaş ve domuz modelleri) inceler. Bu amaca ulaşmak için büyükbaş ve domuz böbreklerinin korteks bölgesinden total protein lizatı hazırlanmıştır.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protokol

Bu çalışmada canlı veya deneysel hayvan kullanılmadı.

1. Doku Kullanımı

  1. Bir mezbahadan kesildikten hemen sonra büyükbaş ve domuz eti bütün böbrekleri temin edin. Buzla laboratuvara ışınla.
  2. Laboratuvara vardıktan sonra, 50 mL buz gibi fosfat tamponlu salin (PBS) ile böbrekleri durular. Kanı tamamen çıkarmak için bu adımı 2x tekrarlayın.
  3. Daha fazla ekstraksiyon kadar buz (veya buzdolabında) böbrekler tutun.

2. Böbreklerin Diseksiyonu

  1. Böbrekleri incelemek ve gerekli doku kısmını çıkarmak için steril makas, çalgılar, bıçak ve Petri kapları kullanın.
  2. Böbrek diseksiyonu öncesinde RIPA lysis tampon hazırlayın. 5 mM NaCl, 0,5 M EDTA, 1 M Tris (pH = 8,0), NP-40 (ID + GEPAL CA-630), %10 sodyum deoksiolat ve %10 SDS'yi çift distile suda çözündürün, sonra iyice karıştırın. RIPA lysis tamponu kullanılmadığında soğutun.
  3. Yavaşça ikiye böbreği kesti (sagittal düzlem) ve doku bir parça kesti (50-70 mm2) böbrek merkezinde korteks bölgesinden (ıslak ağırlık tarafından 80-100 mg ağırlığında).
  4. Homojenizasyon sürecine yardımcı olmak için doku bloğunu bıçakla küçük parçalara ayırın.
  5. Dokuları kıyma sonra, buz gibi 1x RIPA lysis ekstraksiyon tampon 1 mL ile bir mikrofuge tüp içine aktarın. Daha fazla çıkarma kadar buz tüpleri yerleştirin.

3. Doku Homojenizasyonu

  1. Mikrofuge tüplerini doku süpernatant koleksiyonu için özel numune ayrıntılarıyla etiketlayın.
  2. Steril bir prob ile bir el homogenizer kullanarak, daha sonra dokuların hiçbir parçaları görünür kadar soğuk koşullarda (buz kovası örnekleri) 1-2 dakika için dokuları homojenize.
  3. 4 °C'de 5 dk için 9.600 x g'de soğutulmuş santrifüjde santrifüj için doku ekstrelerini hemen takın.
  4. Tüpleri santrifüjden çıkarın ve buz kovasının üzerine yerleştirin.
  5. Yeni etiketli mikrofuge tüp içine supernatant toplamak ve buz üzerinde saklayın. Peleti atın.
  6. Donma-çözülme döngülerini önlemek için lh ve VEGF-A enzime bağlı immünosorbent tahlilleri (ELISA) ve total protein analizi için ayrı ekspertasyonlar hazırlayın.

4. Büyükbaş ve Domuz Eti LH ELISA Teşrisi

  1. Ticari olarak kullanılabilen luteinizing hormon (LH) ELISA kitinde yer alan tüm ELISA tsay bileşenlerini2-8 °C'de saklayın. Bu antikor içerir, HRP-konjuge, asay plaka (96 iyi), kalibratörler, yıkama tampon (20x konsantre), substrat A, substrat B, ve stop çözeltisi. Üreticinin talimatları tarafından önerilen tüm reaktifleri hazırlayın.
  2. Tgörünüşe başlamadan önce, tüm reaktifleri ve istinat plakasını oda sıcaklığına (RT) getirin. Tayä±rım için gerekli kuyu sayısını kullanımını sÃ1/4reyle sÃ1/4reve kullanılamayan kuyular kullanılanakadar 4 °C' de tutun.
  3. Yıkama tamponu (15 mL 20x konsantre) ile 300 mL çift distile su ile seyreltin
  4. Boş kuyuları herhangi bir çözüm olmadan ayarlayın.
  5. Her kuyuya 50 μL standart veya örnek ekleyin (n = 2), sonra her kuyuya 50 μL horseradish peroksidaz (hrp)-konjuge ekleyin. Hemen her kuyuya 50 μL daha antikor çözeltisi ekleyin. Plakayı kapatın, iyice karıştırın ve 37 °C'de 1 saat kuluçkaya yatırın.
  6. Kuyuları 1x yıkama tamponu (200 μL/iyi) ile yıkayın ve 4x tekrarlayın.
  7. Her kuyuya 50 μL a ve 50 μL substrat B ekleyin ve yan taraftaki plakaya hafifçe dokunarak iyice karıştırın. Plakayı kapatın ve 37 °C'de 15 dakika boyunca 15 dakika boyunca inkübasyonu kapatın.
  8. Her kuyuya 50 μL stop çözeltisi ekleyin, plakaya hafifçe dokunun ve 450 nm dalga boyuna ayarlanan spektrofotometreyi kullanarak plakayı okuyun.
  9. Büyükbaş ve domuz LH düzeylerini total proteine normalleştirin (bkz. bölüm 6).

5. Büyükbaş ve Domuz VEGF-A ELISA Teşrisi

  1. Ticari olarak mevcut Vasküler Endotel Büyüme Faktörü-A ELISA kitlerinde yer alan tüm ELISA titreşme bileşenlerini (Bkz. Malzeme Tablosu)2-8 °C'de saklayın. Bu antikor içerir, HRP-konjuge, asay plaka (96 iyi), kalibratörler, yıkama tampon (20x konsantre), substrat A, substrat B, ve stop çözeltisi. Üreticinin talimatları tarafından önerilen tüm reaktifleri hazırlayın.
  2. Tayına başlamadan önce, tüm reaktifleri ve istinat plakasını RT'ye getirin.
  3. Yıkama tamponu (15 mL 20x konsantre) ile 300 mL çift distile su ile seyreltin
  4. Her kuyuya standart veya numunenin 100 μL'sini ekleyin (n = 2). Plakayı kapatın, iyice karıştırın ve 37 °C'de 2 saat kuluçkaya yatırın.
  5. Her kuyudaki sıvıyı çıkarın ve her kuyuya 100 μL algılama reaktifi A ekleyin, plakayı kapatın ve 37 °C'de 1 saat kuluçkaya yatırın.
  6. Kuyuları 1x yıkama tamponu (400 μL/iyi) ile yıkayın ve 4x tekrarlayın.
  7. Her kuyuya 100 μL algılama reaktifi B ekleyin ve yan taraftaki plakaya hafifçe dokunarak iyice karıştırın. Plakayı kapatın ve 37 °C'de 1 saat kuluçkaya yatırın.
  8. Kuyuları 1x yıkama tamponu (400 μL/iyi) ile yıkayın ve 4x tekrarlayın.
  9. Her kuyuya 90 μL substrat çözeltisi ekleyin, tabağa hafifçe dokunun ve 37 °C'de 1 saat kuluçkaya yatırın.
  10. Her kuyuya 50 μL stop çözeltisi ekleyin, plakaya hafifçe dokunun ve 450 nm dalga boyuna ayarlanan spektrofotometreyi kullanarak plakayı okuyun.
  11. Büyükbaş ve domuz eti VEGF-A düzeylerini total proteine normalleştirin (bölüm 6).

6. Toplam Protein Tahmini

  1. Üreticinin tavsiyelerine göre, ticari bir kit (Bkz. Malzeme Tablosu)kullanılarak standart sığır serum albumini (BSA) tahdisi ile büyükbaş ve domuz böbreğinin toplam proteinini tahmin edin.

7. İstatistiksel Analiz

  1. Her bir analitin ortalamasını, ortancasını ve standart sapmasını hesaplayın.
  2. Parametrik vs. parametrik olmayan istatistiksel testler. Veriler normal olarak dağıtılırsa, parametrik testler yoluyla istatistiksel testler gerçekleştirin.
  3. Uygun koşullar altında (normal veri dağıtımı gibi), LH ve VEGF-A arasındaki doğrusal ilişkiyi incelemek için regresyon modellerini kullanır.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Sonuçlar

LH ve VEGF'nin hayvan türüne ve cinsiyete göre ortalama ve ortanca düzeyleri Tablo 1'degösterilmiştir. Kolmogorov-Smirnov Normallik Testi ile verilerin normalliği doğrulandıktan sonra LH ve VEGF arasındaki ilişkiyi incelemek için doğrusal regresyon modelleri kullanılmıştır. LH hem büyükbaş hem de domuz böbreklerinde VEGF'nin güçlü ve önemli bir belirleyicisi olarak bulunmuştur (büyükbaş böbrek modeli: n = 7, R2 = 0.86, p = 0.002; d...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Tartışmalar

Hayvan ölümünden hemen sonra mezbahadan böbrek temini bu metodolojide başarının anahtarıdır. Bu insan kadavralar yerine ve domuz organları kullanarak ana avantajıdır. Genellikle insan kadavra organları temin kadar ölüm saatinden en az 12-24 saat gecikme vardır. Vücut organlarının kimyasal bileşimi önemli ölçüde 2 saat post-mortem içinde değişir çünkü15,16, Insan kadavra böbreklerde VEGF-çalışmalar gerçek yaşam koşulları yans?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Açıklamalar

Zietchick Araştırma Enstitüsü (ZRI) özel bir (kar amacı gütmeyen) araştırma enstitüsü ve Dr Tammy Movsas (kurucusu ve ZRI direktörü) bekleyen bir patent başvuruları ve oküler hastalıkların tedavisinde gonadotropin antagonistleri kullanımı için doğrulanmış patent vardır ve diyabet. Dr. A. Muthusamy'nin ZRI'de çalışan (biyokimyacı) olması dışında rapor etmesi gereken başka bir mali ihtilaf ı yoktur. A. Arivalagan (ZRI yaz stajyeri, Michigan Üniversitesi'nde lisans öğrencisi) rapor etmek için başka mali çatışmalar vardır.

Teşekkürler

Yazarlar sığır ve domuz böbrekleri sağlamak için Scholl Mezbaha (Blissfield, MI) teşekkür ederiz. Bu çalışma için hibe fonu kullanılmadı.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
Bovine LH ELISA KitMyBiosource, San Diego, CA.MBS700951
Bovine VEGF-A ELISA KitMyBiosource, San Diego, CA.MBS2887434
Micro BCA Protein Assay KitThermoFisher Scientific Inc, Columbus, OH.23235
Porcine LH ELISA KitMyBiosource, San Diego, CA.MBS009739
Porcine VEGF-A ELISARay Biotech, Norcross, GA.ELP-VEGFA-1
RIPA Lysis and Extraction BufferThermoFisher Scientific Inc, Columbus, OH.89901

Referanslar

  1. Advani, A., et al. Role of VEGF in maintaining renal structure and function under normotensive and hypertensive conditions. Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 104 (36), 14448-14453 (2007).
  2. Majumder, S., Advani, A. VEGF and the diabetic kidney: More than too much of a good thing. Journal of Diabetes and its Complications. 31 (1), 273-279 (2017).
  3. Liu, E., et al. Increased expression of vascular endothelial growth factor in kidney leads to progressive impairment of glomerular functions. Journal of the American Society of Nephrology. 18 (7), 2094-2104 (2007).
  4. Eremina, V., et al. Glomerular-specific alterations of VEGF-A expression lead to distinct congenital and acquired renal diseases. Journal of Clinical Investigation. 111 (5), 707-716 (2003).
  5. Ferrara, N. Vascular endothelial growth factor: basic science and clinical progress. Endocrine Reviews. 25 (4), 581-611 (2004).
  6. Movsas, T. Z., Sigler, R., Muthusamy, A. Vitreous Levels of Luteinizing Hormone and VEGF are Strongly Correlated in Healthy Mammalian Eyes. Current Eye Research. 43 (8), 1041-1044 (2018).
  7. Babitha, V., et al. Luteinizing hormone, insulin like growth factor-1, and epidermal growth factor stimulate vascular endothelial growth factor production in cultured bubaline granulosa cells. General and Comparative Endocrinology. 198, 1-12 (2014).
  8. Trau, H. A., Davis, J. S., Duffy, D. M. Angiogenesis in the Primate Ovulatory Follicle Is Stimulated by Luteinizing Hormone via Prostaglandin E2. Biology of Reproduction. 92 (1), 15(2015).
  9. Movsas, T. Z., et al. Confirmation of Luteinizing Hormone (LH) in Living Human Vitreous and the Effect of LH Receptor Reduction on Murine Electroretinogram. Neuroscience. 385, 1-10 (2018).
  10. Movsas, T. Z., Sigler, R., Muthusamy, A. Elimination of Signaling by the Luteinizing Hormone Receptor Reduces Ocular VEGF and Retinal Vascularization during Mouse Eye Development. Current Eye Research. 43 (10), 1286-1289 (2018).
  11. Hipkin, R. W., Sanchez-Yague, J., Ascoli, M. Identification and characterization of a luteinizing hormone/chorionic gonadotropin (LH/CG) receptor precursor in a human kidney cell line stably transfected with the rat luteal LH/CG receptor complementary DNA. Molecular Endocrinology. 6 (12), 2210-2218 (1992).
  12. Lei, Z. M., et al. Targeted disruption of luteinizing hormone/human chorionic gonadotropin receptor gene. Molecular Endocrinology. 15 (1), 184-200 (2001).
  13. Schrijvers, B. F., Flyvbjerg, A., De Vriese, A. S. The role of vascular endothelial growth factor (VEGF) in renal pathophysiology. Kidney International. 65 (6), 2003-2017 (2004).
  14. Apaja, P. M., Aatsinki, J. T., Rajaniemim, H. J., Petaja-Repo, U. E. Expression of the mature luteinizing hormone receptor in rodent urogenital and adrenal tissues is developmentally regulated at a posttranslational level. Endocrinology. 146 (8), 3224-3232 (2005).
  15. Ondruschka, B., et al. Post-mortem in situ stability of serum markers of cerebral damage and acute phase response. International Journal of Legal Medicine. 133 (3), 871-881 (2019).
  16. Swain, R., et al. Estimation of post-mortem interval: A comparison between cerebrospinal fluid and vitreous humour chemistry. Journal of Forensic and Legal Medicine. 36, 144-148 (2015).
  17. Thompson, C. S., Traynor, I. M., Fodey, T. L., Faulkner, D. V., Crooks, S. R. H. Screening method for the detection of residues of amphenicol antibiotics in bovine, ovine and porcine kidney by optical biosensor. Talanta. 172, 120-125 (2017).
  18. Konstantinou, G. N. Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA). Methods in Molecular Biology. 1592, 79-94 (2017).
  19. Levesque, B. M., et al. Low urine vascular endothelial growth factor levels are associated with mechanical ventilation, bronchopulmonary dysplasia and retinopathy of prematurity. Neonatology. 104 (1), 56-64 (2013).
  20. Leviton, A., et al. Antecedents and early correlates of high and low concentrations of angiogenic proteins in extremely preterm newborns. Clinica Chimica Acta. 471, 1-5 (2017).
  21. Simo-Servat, O., Hernandez, C., Simo, R. Usefulness of the vitreous fluid analysis in the translational research of diabetic retinopathy. Mediators of Inflammation. , 872978(2012).
  22. Sharma, R. K., Rowe-Rendleman, C. L. Validation of molecular and genomic biomarkers of retinal drug efficacy: use of ocular fluid sampling to evaluate VEGF. Neurochemical Research. 36 (4), 655-667 (2011).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

Daha Fazla Makale Keşfet

BiyolojiSay 155VEGFvask ler endotelyal b y me fakt rluteinizing hormonanjiyogenezdiyabetik nefropatis r b bre i

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Bize Ulaşın

KÜTÜPHANEYE TAVSİYE ET

JoVE HABER BÜLTENLERİ

Araştırma

Eğitim

Yazarlar

Kütüphaneciler

JoVE Hakkında

Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır