Démonstration d'une relation linéaire entre le facteur de croissance endothéliale vasculaire et l'hormone lutéinisante dans les extraits de cortex rénal

Résumé

Présenté ici est un protocole pour l'utilisation d'une préparation corticale d'extrait de rein et de normalisation totale de protéine pour démontrer la corrélation entre le facteur de croissance endothéliale vasculaire et l'hormone lutéinisante dans le rein de mammifères.

Résumé

Le facteur de croissance endothéliale vasculaire (VEGF) aide à commander l'angiogenèse et la perméabilité vasculaire dans le rein. Les désordres rénaux, tels que la néphropathie diabétique, sont associés à la dysrégulation de VEGF dans le rein. Les facteurs qui régissent VEGF dans des conditions physiologiques dans le rein ne sont pas bien compris. L'hormone lutéinisante (LH), une hormone pro-angiogénique, aide à réguler l'expression physiologique de VEGF dans les organes reproducteurs. Étant donné que les récepteurs LH se trouvent dans le rein, nous, à l'Institut de recherche Zietchick, présumé ici que LH contribue également à réguler l'expression VEGF dans le rein ainsi. Pour fournir des preuves, nous avons cherché à montrer que les niveaux de LH sont en mesure de prédire les niveaux de VEGF dans le rein des mammifères. La plupart des enquêtes liées au VEGF impliquant le rein ont utilisé des mammifères de moindre ordre comme modèles (c.-à-d. rongeurs et lapins). Pour traduire ce travail au corps humain, il a été décidé d'examiner la relation entre veGF et LH chez les mammifères de plus haut niveau (c'est-à-dire les modèles bovins et porcins). Ce protocole utilise le lysate protéique total du cortex rénal. Les clés du succès de cette méthode comprennent l'approvisionnement en reins d'animaux d'abattoir immédiatement après la mort ainsi que la normalisation des niveaux d'analytes (dans l'extrait de rein) par protéine totale. Cette étude démontre avec succès une relation linéaire significative entre LH et VEGF dans les reins bovins et porcins. Les résultats sont reproductibles chez deux espèces différentes. L'étude fournit des preuves à l'appui que l'utilisation d'extraits de rein de vaches et de porcs sont une ressource excellente, économique et abondante pour l'étude de la physiologie rénale, en particulier pour examiner la corrélation entre veGF et d'autres analytes.

Introduction

Le facteur de croissance endothéliale vasculaire A (VEGF-A), aide à réguler l'angiogenèse et la perméabilité vasculaire dans le rein et d'autres organes^1,2 (ci-après, VEGF-A sera appelé VEGF). Les niveaux de VEGF dans le rein sont sous contrôle homéostatique serré. Lorsque les niveaux rénaux de VEGF sont élevés ou déprimés, le rein peut dysfonctionnement. Par exemple, dans les 3 semaines suivant la naissance, les souris avec l'hétérozygosity podocyte-spécifique pour VEGF développent l'endotheliosis et le glomeruli sans sang (c.-à-d., lésions rénales vues dans la preeclampsia humaine), et l'échec rénal de phase finale se produit dans ces heterozygotes par 3 mois d'âge. Les ko homozygotiques spécifiques aux podocytes meurent d'hydrops et d'insuffisance rénale dans un délai de 1 jour après la naissance^3,4.

D'autre part, la surexpression de VEGF rénal provoque la protéinurie et l'hypertrophie glomerulaire^3,4. Par exemple, les lapins transgéniques qui surexpriment veGF présentent des proteinuria progressives avec des taux de filtration glomerulaires accrus aux premiers stades de la néphropathie, suivis d'une diminution des taux de filtration glomerulaire s'est accentué aux stades plus avancés³. La néphropathie diabétique, une cause majeure de la maladie rénale de phase finale dans les adultes diabétiques, est fortement associée à la dysregulation de VEGF^2,5. Une grande attention a été accordée au rôle de l'hypoxie dans l'induire l'expression de VEGF dans des conditions pathologiques^5. Cependant, les facteurs régissant le VEGF dans des conditions physiologiques (tant dans le rein que dans d'autres organes) ne sont pas bien compris^2,6. L'identification de ces facteurs (à l'exception de l'oxygène) qui sont impliqués dans la régulation physiologique et pathologique du VEGF est une entreprise importante.

L'hormone lutéinisante (LH), une hormone pro-angiogénique, aide à réguler l'expression physiologique de VEGF dans les organes reproducteurs tels que l'ovaire et le testicule^7,8. Des études antérieures ont fourni des preuves que LH aide également à réguler VEGF dans les organes non reproductifs, tels que les yeux^6,9,10. Les récepteurs de LH se trouvent dans la médulle et le cortex du rein^11,12. A noter, les cellules épithéliales tubulaires rénales, ainsi que le récepteur LH, expriment VEGF^11,12,13,14. Prenant ces deux observations ensemble, nous avons supposé que LH aide également à réguler l'expression VEGF dans le rein^13,14. Pour fournir l'évidence de cette relation de LH/VEGF, le protocole présenté vise à montrer que les niveaux de LH sont capables de prévoir des niveaux de VEGF dans le rein. De nombreuses enquêtes antérieures sur le VEGF concernant le rein ont utilisé des modèles de mammifères d'ordre inférieur (c.-à-d. rongeurs et lapins)². Pour traduire ce travail sur le corps humain, l'étude examine la relation entre le VEGF et le LH chez les mammifères de plus haut niveau (ici, les modèles bovins et porcins). Pour atteindre cet objectif, le lysate protéique total a été préparé à partir de la région du cortex des reins bovins et porcins.

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Protocole

Aucun animal vivant ou expérimental n'a été utilisé pour cette étude.

1. Manipulation des tissus

1. Procurez-vous des reins entiers bovins et porcins immédiatement après l'abattage d'un abattoir. Transport sur glace jusqu'au laboratoire.
2. À l'arrivée au laboratoire, rincer les reins avec 50 ml de phosphate glacé tamponné saline (PBS). Répétez cette étape 2x pour enlever complètement le sang.
3. Conserver les reins sur la glace (ou réfrigéré) jusqu'à l'extraction ultérieure.

2. Dissection des reins

1. Utilisez des ciseaux stériles, des forceps, un couteau et des plats Petri pour disséquer les reins et exciser la portion tissulaire requise.
2. Préparer le tampon de lyse RIPA avant la dissection rénale. Dissoudre 5 mM NaCl, 0,5 M EDTA, 1 M Tris (pH 8,0), NP-40 (ID - GEPAL CA-630), 10% de désoxycholate de sodium, et 10% DeDS dans de l'eau double distillée, puis bien mélanger. Réfrigérer le tampon de lyse RIPA lorsqu'il n'est pas utilisé.
3. Couper doucement le rein en deux (plan sagittal) et couper un morceau de tissu (50-70 mm²) de la région du cortex au centre du rein (pesant 80-100 mg par poids humide).
4. Émincer le bloc de tissu en petits morceaux avec un couteau pour aider le processus d'homogénéisation.
5. Après avoir mis élagué les tissus, les transférer dans un tube de microfuge avec 1 ml de tampon d'extraction de lyse RIPA glacé. Placer les tubes dans la glace jusqu'à l'extraction ultérieure.

3. Homogénéisation des tissus

1. Étiqueter les tubes de microfuge avec des détails d'échantillon spécifiques pour la collecte des supernatants tissulaires.
2. À l'aide d'un homogénéisateur portatif à l'aide d'une sonde stérile, puis homogénéiser les tissus pendant 1-2 min dans des conditions froides (échantillons sur le seau à glace) jusqu'à ce qu'aucun morceau de tissu ne soit visible.
3. Soumettre les extraits de tissu immédiatement pour la centrifugation dans la centrifugeuse réfrigérée à 9 600 x g pendant 5 min à 4 oC.
4. Retirer les tubes de la centrifugeuse et les placer sur le seau à glace.
5. Recueillir le supernatant dans un nouveau tube de microfuge étiqueté et stocker sur la glace. Jeter la boulette.
6. Préparer des aliquots distincts des supernatants pour les essais immunosorbent liés à l'hilité Etide (ELISA) et l'analyse totale des protéines , respectivement, afin d'éviter les cycles de gel et de dégel.

4. Bovine et Porcine LH ELISA Esay

1. Conservez tous les composants d'analyse ELISA inclus dans le kit ELISA (LH) de l'hormone lutéinisante disponible dans le commerce (voir Tableau des matériaux)à 2-8 oC. Cela comprend l'anticorps, HRP-conjugué, plaque d'assay (96 bien), calibrateurs, tampon de lavage (20x concentré), substrat A, substrat B, et solution d'arrêt. Préparer tous les réactifs comme recommandé par les instructions du fabricant.
2. Avant de commencer l'assidu, apportez tous les réactifs et la plaque d'astodonte à la température ambiante (RT). Utilisez le nombre requis de puits pour l'assouglement, le joint et gardez les puits inutilisés à 4 oC jusqu'à l'utilisation.
3. Diluer le tampon de lavage (15 ml de concentré de 20x) à 300 ml avec de l'eau à double distillation
4. Configurez les puits vierges sans aucune solution.
5. Ajoutez 50 ll de norme ou d'échantillon à chaque puits (n '2), puis ajoutez 50 l de peroxidase de raifort (hrp)-conjugué à chaque puits. Ajoutez immédiatement 50 l de solution d'anticorps à chaque puits. Sceller l'assiette, bien mélanger et incuber pendant 1 h à 37 oC.
6. Laver les puits à l'œil de 1x tampon de lavage (200 l/puits) et répéter 4x.
7. Ajouter 50 l de substrat A et 50 l de substrat B à chaque puits, et bien mélanger en tapant doucement sur la plaque sur le côté. Sceller l'assiette et incuber pendant 15 min à 37 oC dans l'obscurité pendant 15 min.
8. Ajoutez 50 ll de solution d'arrêt à chaque puits, appuyez doucement sur la plaque et lisez la plaque à l'aide du spectrophotomètre réglé sur une longueur d'onde de 450 nm.
9. Normaliser les niveaux de LH bovine et porcine en protéines totales (voir la section 6).

5. Bovine et Porcine VEGF-A ELISA Esay

1. Conservez tous les composants d'analyse ELISA inclus dans les kits ELISA (facteur de croissance endothéliale vasculaire disponible dans le commerce) (voir Tableau des matériaux)à 2-8 oC. Cela comprend l'anticorps, HRP-conjugué, plaque d'assay (96 bien), calibrateurs, tampon de lavage (20x concentré), substrat A, substrat B, et solution d'arrêt. Préparer tous les réactifs comme recommandé par les instructions du fabricant.
2. Avant de commencer l'assidu, apportez tous les réactifs et la plaque d'astodonte à RT. Utilisez le nombre requis de puits pour l'assouglement, le joint, et gardez les puits inutilisés à 4 oC jusqu'à l'utilisation.
3. Diluer le tampon de lavage (15 ml de concentré de 20x) à 300 ml avec de l'eau à double distillation
4. Ajouter 100 l'échantillon ou l'échantillon à chaque puits (n '2). Sceller l'assiette, bien mélanger et incuber pendant 2 h à 37 oC.
5. Retirer le liquide dans chaque puits et ajouter 100 l de réagent de détection A à chaque puits, sceller la plaque, et couver pendant 1 h à 37 oC.
6. Laver les puits à l'œil de tampon de lavage 1x (400 l/puits) et répéter 4x.
7. Ajouter 100 l de réagent de détection B à chaque puits et bien mélanger en tapant doucement sur la plaque sur le côté. Sceller la plaque et la couver pendant 1 h à 37 oC.
8. Laver les puits à l'œil de tampon de lavage 1x (400 l/puits) et répéter 4x.
9. Ajouter 90 l de solution de substrat à chaque puits, tapoter doucement la plaque, et couver pendant 1 h à 37 oC.
10. Ajoutez 50 ll de solution d'arrêt à chaque puits, appuyez doucement sur la plaque et lisez la plaque à l'aide du spectrophotomètre réglé sur une longueur d'onde de 450 nm.
11. Normaliser les concentrations de VEGF-A bovines et porcines en protéines totales (section 6).

6. Estimation totale des protéines

1. Estimer la protéine totale des extraits de rein bovin et porcin par test standard d'albumine de sérum bovin (BSA) à l'aide d'un kit commercial (voir tableau des matériaux) selon les recommandations du fabricant.

7. Analyse statistique

1. Calculez l'écart moyen, médian et standard de chaque analyte.
2. Testez la divergence de la distribution de l'échantillon par rapport à l'utilisation normale du test Kolmogorov-Smirnov pour décider, sur utilisation, entre paramétrique et. tests statistiques non paramétriques. Si les données sont normalement distribuées, effectuez des tests statistiques par des tests paramétriques.
3. Dans des circonstances appropriées (comme la distribution normale des données), utilisez des modèles de régression pour examiner la relation linéaire entre LH et VEGF-A.

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Résultats

Les niveaux moyen et médians de LH et de VEGF par type d'animal et par sexe sont indiqués dans le tableau 1. Après vérification de la normalité des données par Kolmogorov-Smirnov Test de la normalité, des modèles de régression linéaire ont été utilisés pour examiner la relation entre LH et VEGF. LH s'est avéré être un prédicteur fort et significatif de VEGF dans les reins bovins et porcins (modèle bovin de rein : n ' 7, R² - 0,86, p - 0,002 ; ...

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Discussion

L'aveux des reins de l'abattoir immédiatement après la mort animale est la clé du succès de cette méthodologie. C'est le principal avantage d'utiliser des organes de vaches et de porcs au lieu de cadavres humains. Il y a habituellement au moins un retard de 12-24 h à partir du moment de la mort jusqu'à ce que les organes humains de cadavre soient achetés. Puisque la composition chimique des organes corporels change de manière significative dans 2 h post-mortem^15,

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matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Bovine LH ELISA Kit	MyBiosource, San Diego, CA.	MBS700951
Bovine VEGF-A ELISA Kit	MyBiosource, San Diego, CA.	MBS2887434
Micro BCA Protein Assay Kit	ThermoFisher Scientific Inc, Columbus, OH.	23235
Porcine LH ELISA Kit	MyBiosource, San Diego, CA.	MBS009739
Porcine VEGF-A ELISA	Ray Biotech, Norcross, GA.	ELP-VEGFA-1
RIPA Lysis and Extraction Buffer	ThermoFisher Scientific Inc, Columbus, OH.	89901