腎皮質抽出物における血管内皮増殖因子と黄体形成ホルモンとの線形関係の実証

要約

ここで提示するプロトコルは、皮質腎臓抽出物調製および全タンパク質正常化を利用して、哺乳動物腎臓における血管内皮成長因子と黄体形成ホルモンとの相関関係を実証するためのプロトコルである。

要約

血管内皮増殖因子(VEGF)は、腎臓の血管新生および血管透過性を制御するのに役立つ。糖尿病性腎症などの腎疾患は、腎臓におけるVEGF調節不全と関連している。腎臓の生理学的条件下でVEGFを支配する因子はよく理解されていません。前血管新生ホルモンである黄体形成ホルモン(LH)は、生殖器官の生理学的VEGF発現を調節するのに役立ちます。LH受容体が腎臓に見つかっていることを考えると、私たちは、ジーチック研究所で、LHも腎臓のVEGF発現を調節するのに役立つと仮定しています。証拠を提供するために、我々はLHレベルが哺乳動物腎臓のVEGFレベルを予測できることを示すことを目的とした。腎臓を含むほとんどのVEGF関連の調査は、モデルとして低次哺乳動物(すなわち、げっ歯類とウサギ)を使用しています。この研究を人体に翻訳するために、高次哺乳動物(ウシとブタモデル)におけるVEGFとLHの関係を調べることにした。このプロトコルは、腎皮質からの総タンパク質リサートを使用します。この方法の成功の鍵は、死後すぐに食肉処理場の動物からの腎臓の調達だけでなく、総タンパク質による検体レベル(腎臓抽出物中)の正常化が含まれます。この研究は、ウシとブタの両方の腎臓におけるLHとVEGFの間の有意な線形関係を示すに成功した。結果は2つの異なる種で再現可能である。この研究は、牛や豚からの腎臓抽出物の使用が、特にVEGFと他のアナライトとの相関関係を調べるために、腎生理学の研究のための優れた、経済的、豊富な資源であることを支持する証拠を提供する。

概要

血管内皮増殖因子A(VEGF-A)は、腎臓および他の器官^1、2における血管新生および血管透過性を調節するのに役立つ(以下、VEGF−AはVEGFと呼ばれる)。腎臓のVEGFレベルは、厳格な恒静制御下にある。腎VEGFレベルが上昇または抑制されると、腎臓が機能不全を起こす可能性があります。例えば、出生後3週間以内に、VEGFに対するポドサイト特異的ヘテロ接合性を有するマウスは、子宮内皮症および無血球体(すなわち、ヒト子癇前症に見られる腎病変)を発症し、そして最終段階の腎不全は生後3ヶ月までにこれらのヘテロジゴスで起こる。ポドサイト特異的ホモ接合性ノックアウトは、生後1日以内に水腫および腎不全で死亡する^3,4.

一方、腎VEGFの過剰発現は、タンパク尿および糸球体肥大^3、4を引き起こす。例えば、VEGFを過剰発現するトランスジェニックウサギは、腎症の初期段階で糸球体濾過率の増加を伴う進行性タンパク尿を示し、続いて後の段階³で糸球体濾過率の低下を示す。糖尿病成人における末期腎疾患の主な原因である糖尿病性腎症は、VEGF調節不全^2、5に強く関連している。病理学的条件下でVEGF発現を誘導する際の低酸素症の役割に多大な注意が払われている⁵.しかしながら、生理学的条件下でVEGFを支配する因子(腎臓および他の器官の両方)は、よく理解されていない^2、6。生理学的および病理学的VEGF調節に関与するこれらの因子(酸素を除く)を同定することは重要な取り組みである。

前血管新生ホルモンである黄体形成ホルモン(LH)は、卵巣および精巣^7、8などの生殖器官における生理学的VEGF発現を調節するのに役立つ。以前の研究は、LHはまた、目^6、9、10などの非生殖器官のVEGFを調節するのに役立つという証拠を提供しています。LH受容体は、腎臓^11、12の髄質および皮質に見られる。なお、腎尿細管上皮細胞は、LH受容体と同様に、VEGF^{11、12、13、14}を発現する。これら2つの観察を一緒に取り、我々はLHが腎臓^13、14のVEGF発現を調節するのにも役立つと仮定した。このLH/VEGF関係の証拠を提供するために、提示されたプロトコルは、LHレベルが腎臓のVEGFレベルを予測できることを示すことを目的としています。腎臓に関する多くの以前のVEGF関連の調査は、低次哺乳動物モデル(すなわち、げっ歯類およびウサギ⁾²を使用している。この研究を人体に翻訳するために、この研究は、高次哺乳動物(ここでは、ウシとブタモデル)におけるVEGFとLHの関係を調べる。この目的を遂行するために、ウシおよびブタ腎臓の皮質領域から総タンパク質リサートを調製した。

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プロトコル

この研究には生きた動物や実験動物は使われなかった。

1. 組織の取り扱い

1. アバトワールからの殺処分直後にウシとブタの全腎臓を調達する。実験室への氷の上の輸送。
2. 実験室に到着すると、50 mLの氷冷リン酸緩衝生理食塩酸(PBS)で腎臓をすすすします。血液を完全に除去するには、この手順 2x を繰り返します。
3. さらに抽出するまで、腎臓を氷の上に置く(または冷蔵する)。

2. 腎臓の解剖

1. 無菌のはさみ、鉗子、ナイフ、ペトリ皿を使用して腎臓を解剖し、必要な組織部分を切除します。
2. 腎解剖の前にRIPAリシスバッファーを準備します。5 mM NaCl、0.5 M EDTA、1 M トリス(pH = 8.0)、NP-40(ID + GEPAL CA-630)、10%デオキシコール酸ナトリウム、および10%SDSを二重蒸留水に溶解し、十分に混合します。使用しないときはRIPAリシス緩衝液を冷蔵する。
3. 腎臓をゆっくりと半分に切り(矢状面)、腎臓の中央の皮質領域(湿った重量で80〜100mgの重量)から組織(50-70 mm²⁾を切った。
4. 組織ブロックをナイフで細かく刻み、均質化プロセスを支援します。
5. 組織をミンチした後、1mLの氷冷1x RIPAリシス抽出バッファーを用いてマイクロフュージチューブに移す。さらに抽出するまでチューブを氷の中に置きます。

3. 組織均質化

1. マイクロフュージチューブに、組織上清の収集のための特定のサンプルの詳細をラベル付けします。
2. 滅菌プローブでハンドヘルドホモジナイザーを使用し、組織の塊が見えなくなるまで、寒い条件(アイスバケツ上のサンプル)で1〜2分間組織を均質化します。
3. 冷蔵遠心分離機中の遠心分離のために組織抽出物を直ちに被験者し、4°Cで5分間9,600 x gである。
4. 遠心分離機からチューブを取り出し、アイスバケツの上に置きます。
5. 新しいラベル付きマイクロフュージチューブに上清を収集し、氷の上に保存します。ペレットを捨てます。
6. LHおよびVEGF-A酵素結合免疫吸着アッセイ(ELISA)および総タンパク質分析のための上清の別々のアリコートをそれぞれ調製し、凍結融解サイクルを回避します。

4. 牛と豚 LH ELISA アッセイ

1. 市販の黄体形成ホルモン(LH)ELISAキットに含まれるすべてのELISAアッセイ成分を2~8°Cで保管してください(材料表を参照)。これには、抗体、HRP-コンジュゲート、アッセイプレート(96ウェル)、キャリブレータ、洗浄緩衝液(20x濃縮物)、基板A、基板B、および停止溶液が含まれる。製造元の指示に従ってすべての試薬を準備します。
2. アッセイを開始する前に、すべての試薬とアッセイプレートを室温(RT)に持ち込みます。アッセイ、シール、未使用の井戸の使用に必要な数の井戸を使用し、使用するまで4°Cに保ちます。
3. 洗浄バッファー(20x濃縮物の15 mL)を二重蒸留水で300mLに希釈する
4. 解決策なしで空白の井戸を設定します。
5. 各ウェルに50μLの標準またはサンプルを加え(n =2)、さらに50μLのホースラディッシュペルオキシダーゼ(hrp)コンジュゲートを各ウェルに加えます。直ちに各ウェルにさらに50μLの抗体溶液を加えます。プレートを密封し、よく混ぜ、37°Cで1時間インキュベートします。
6. 1x洗浄バッファー(200°L/ウェル)で井戸を洗浄し、4xを繰り返します。
7. 基板Aの50μLと基板Bの50°Lをそれぞれウェルに加え、側面のプレートを軽くタップしてよく混ぜます。プレートを密封し、暗闇の中で37°Cで15分間インキュベートします。
8. 各ウェルに50μLのストップ溶液を加え、プレートを軽くタップし、450nm波長に設定された分光光度計を使用してプレートを読み取ります。
9. ウシとブタのLHレベルを総タンパク質に正規化します(セクション6を参照)。

5. 牛と豚 VEGF-A ELISA アッセイ

1. 市販の血管内皮成長因子-A ELISAキットに含まれるすべてのELISAアッセイ成分を2〜8°Cで保管してください(材料表を参照)。これには、抗体、HRP-コンジュゲート、アッセイプレート(96ウェル)、キャリブレータ、洗浄緩衝液(20x濃縮物)、基板A、基板B、および停止溶液が含まれる。製造元の指示に従ってすべての試薬を準備します。
2. アッセイを開始する前に、すべての試薬とアッセイプレートをRTに持ち込み、アッセイに必要な数の井戸を使用し、シールし、使用するまで未使用のウェルを4°Cに保ちます。
3. 洗浄バッファー(20x濃縮物の15 mL)を二重蒸留水で300mLに希釈する
4. 各ウェルに標準またはサンプルの100 μLを追加します(n = 2)。プレートを密封し、よく混ぜ、37°Cで2時間インキュベートします。
5. 各ウェルの液体を取り出し、検出試薬Aの100°Lを各ウェルに加え、プレートを密封し、37°Cで1時間インキュベートします。
6. 1x洗浄バッファー(400°L/ウェル)で井戸を洗浄し、4xを繰り返します。
7. 検出試薬Bを100μLずつよく加え、側面のプレートを軽くタップしてよく混ぜます。プレートを密封し、37°Cで1時間プレートをインキュベートします。
8. 1x洗浄バッファー(400°L/ウェル)で井戸を洗浄し、4xを繰り返します。
9. 90μLの基板溶液を各ウェルに加え、プレートを軽くタップし、37°Cで1時間インキュベートします。
10. 各ウェルに50μLのストップ溶液を加え、プレートを軽くタップし、450nm波長に設定された分光光度計を使用してプレートを読み取ります。
11. ウシとブタVEGF-Aレベルを総タンパク質に正規化する(セクション6)。

6. 総タンパク質推定

1. メーカーの推奨事項に従って、市販のキット(材料表を参照)を使用して、標準ウシ血清アルブミン(BSA)アッセイによるウシおよびブタ腎臓抽出物の総タンパク質を推定します。

7. 統計分析

1. 各検検の平均、中央値、標準偏差を計算します。
2. コルモゴロフ・スミルノフ検定を利用した通常のサンプル分布の発散をテストし、使用時にパラメトリックと.ノンパラメトリック統計検定。データが正規分布している場合は、パラメトリック検定を使用して統計的検定を実行します。
3. 適切な状況 (正規データ分布など) では、回帰モデルを使用して LH と VEGF-A の間の線形関係を調べます。

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結果

動物の種類および性別によるLHおよびVEGFの平均および中央値レベルを表1に示す。コルモゴロフ・スミルノフ法線検定によるデータの正規性を検証した後、線形回帰モデルを利用してLHとVEGFの関係を調べた。LHは、牛と豚の腎臓の両方でVEGFの強力かつ有意な予測変数であることが判明しました(ウシ腎臓モデル:n =7、R2 =0.86、p = 0.002;豚腎臓モデル:n = 7;

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ディスカッション

動物の死の直後にアバトワールから腎臓を調達することは、この方法論の成功の鍵です。これは、人間の死体の代わりに牛や豚からの臓器を利用する主な利点です。通常、死亡時からヒトの死体器官が調達されるまで、少なくとも12〜24時間の遅延がある。身体器官の化学組成は2時間後の死後^15、16内で有意に変化するので、ヒト死体腎におけるVEGF?...

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資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Bovine LH ELISA Kit	MyBiosource, San Diego, CA.	MBS700951
Bovine VEGF-A ELISA Kit	MyBiosource, San Diego, CA.	MBS2887434
Micro BCA Protein Assay Kit	ThermoFisher Scientific Inc, Columbus, OH.	23235
Porcine LH ELISA Kit	MyBiosource, San Diego, CA.	MBS009739
Porcine VEGF-A ELISA	Ray Biotech, Norcross, GA.	ELP-VEGFA-1
RIPA Lysis and Extraction Buffer	ThermoFisher Scientific Inc, Columbus, OH.	89901