הפגנת קשר ליניארי בין גורם גידול של כלי דם אנדותל והורמון מחלגיזציה בתמציות קליפת הכליה

Summary

מוצג כאן הוא פרוטוקול לניצול הכנה לתמצית כליה קליפת הכליה ונורמליזציה חלבון מוחלט כדי להדגים את הקורלציה בין גורם הצמיחה של כלי הדם והורמון החלמיזציה בכליות היונקים.

Abstract

גורם הגדילה של כלי הדם (מסייע) לשלוט באנגיוגנזה ובחדירות כלי הדם בכליה. הפרעות כליות, כגון כלייתית סוכרתית, משויכות לדיסתקנה של הכליות. הגורמים השולטים ב-, בתנאים הפיזיולוגיים בכליות, אינם מובנים היטב. הורמון מחלפף (LH), הורמון פרו-אנגיוגנטי, מסייע לווסת את הביטוי הפיזיולוגי באברי הרבייה. בהינתן כי קולטני LH נמצאים בכליה, אנחנו, במכון מחקר זיגצ'יק, שיערו כאן כי LH גם מסייע לווסת את הביטוי בכליה כמו גם. כדי לספק ראיות, כיוונו להראות כי רמות LH מסוגלים לנבא רמות של היונקים בכליה. רוב החקירות הקשורות לנושא הכרוך בכליות השתמשו ביונקים בעלי סדר נמוך יותר כמודלים (כלומר, מכרסמים וארנבים). כדי לתרגם את העבודה הזאת לגוף האנושי, הוחלט לבחון את הקשר בין המערכת הבין הגדולה לבין ה-LH לבין יונקים בעלי סדר גבוה יותר (קרי, מודלים של שור ופורצין). פרוטוקול זה משתמש בחלבון מוחלט. מקליפת הכליה המפתחות להצלחת שיטה זו כוללים רכש של כליות מחיות מטבחיים מיד לאחר המוות, כמו גם נורמליזציה של רמות אנליטה (בתמצית הכליה) על ידי חלבון מוחלט. מחקר זה ממחיש בהצלחה קשר ליניארי משמעותי בין LH ו-ובהן כליות השור ו חזירי. התוצאות מתוכונות. בשני זנים שונים המחקר מספק הוכחות תומכות כי השימוש בתמציות כליות מפרות וחזירים הם משאב מעולה, חסכוני, ושופע לחקר הפיזיולוגיה של הכליות, במיוחד עבור בחינת הקורלציה בין מנתחי ה-, והאנליטים אחרים.

Introduction

גורם הצמיחה של כלי הדם a ("וכדומה"), מסייע לווסת אנגיוגנזה וחדירות כלי הדם בכליות ובאיברים אחרים^1,2 (להלן, המכונה "הנקרא" מכונה "כולי"). רמות הטיפול בכליה הן תחת שליטה הומאטית. כאשר רמות הכליות מוגברות או מדוכאים, הכליה עלולה להיות תקלה. לדוגמה, בתוך 3 שבועות לאחר הלידה, עכברים עם הטרוזיזטיות מיוחדות לפיתוח של ה-"ולפתח" אנדוקיזיס וכלי-דם (כלומר, נגעים כליות הנתפסים באקלמפסיה האנושית), וכישלון כליות בשלב הסופי מתרחש בהטרוזיטים אלה בגיל 3 חודשים. Podocyte הומוזיטים מסוימים מתים מפני הידרופס ואי ספיקת כליות בתוך יום אחד של לידה^3,4.

מצד שני, ביטוי יתר של כליות הכליות גורם פרוטאינוריה ו-היפרפרפיה של הכליה^3,4. לדוגמה, ארנבים טרנסגניים המבטאים את התצוגה המתקדמת של התערוכה מתקדמת באמצעות שיעורי סינון מוגברים בשלבים המוקדמים של נפרופתיה, ואחריו שיעורי סינון מופחת בשלבים מאוחרים יותר³. סוכרת כליירופאתי, הגורם העיקרי של מחלת הכליה בשלב הסופי אצל מבוגרים סוכרתית, הוא מקושר באופן משמעותי עם התקנה ברמה^2,5. הרבה תשומת לב שולמו לתפקיד של היפוקסיה בגרימת ביטוי ה-, בתנאים פתולוגיים⁵. עם זאת, הגורמים השולטים במצב הפיזיולוגי (הן בכליה והן באיברים אחרים) אינם מובנים היטב^2,6. זיהוי גורמים אלה (למעט חמצן) המעורבים ברגולציה הפיזיולוגית והפתולוגית היא משימה חשובה.

הורמון מחלפף (LH), הורמון פרו-אנגיוגנטי, מסייע לווסת את הביטוי הפיזיולוגי באברי הרבייה כגון השחלה והטנות^7,8. מחקרים קודמים סיפקו ראיות כי LH גם עוזר לווסת את הגוף באיברים שאינם רבייה, כגון העיניים^6,9,10. קולטנים LH מצויים לשד הקליפה של הכליה^11,12. של הערה, כליה תאים אפיתל הכרישים, כמו גם את הקולטן LH, אקספרס וואפ^11,12,13,14. לוקחים את שני התצפיות האלה יחד, אנו שיערו כי LH גם עוזר לווסת את הביטוי והוא בכליה^13,14. כדי לספק ראיות של הקשר LH/מערכת זו, הפרוטוקול המוצג שואפת להראות כי רמות LH מסוגלים לנבא רמות של הכליה. מספר רב של חקירות קודמות הקשורות בכליות השתמשו במודלים היונקים הנמוכים ביותר (כלומר, מכרסמים וארנבים)². כדי לתרגם את העבודה הזאת לגוף האנושי, המחקר בוחן את היחסים בין ומעלה LH ביותר יונקים בסדר גבוה (כאן, שור מודלים חזירי). כדי לבצע מטרה זו, חלבון מוחלט ליפוסט היה מוכן באזור קליפת המוח של שור וכליות חזירי.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

במחקר זה לא נעשה שימוש בחיות או ניסויים.

1. טיפול ברקמה

1. להשיג כליות של שור ופורצין את כל הכליות מיד לאחר שטבח מתוך מטבחיים. . הובלה על קרח למעבדה
2. עם הגעתם למעבדה, לשטוף כליות עם 50 מ ל של מלוחים קר הקרח-פוספט מואגור (PBS). חזור על שלב זה 2x כדי להסיר דם לחלוטין.
3. לשמור על הכליות על קרח (או בקירור) עד חילוץ נוסף.

2. חיתוך הכליות

1. השתמשו במספריים סטריליים, מלקחיים, סכין ומנות פטרי כדי לנתח את הכליות ולבלו את החלק הנדרש ברקמה.
2. הכן מאגר לפירוק של ריפה לפני ניתוח בכליות. התמוססות 5 מ"מ, 0.5 M EDTA, 1 טריס M (pH = 8.0), NP-40 (מזהה + GEPAL CA-630), 10% נתרן deoxycholate, ו 10% SDS במים כפולים מזוקקים, ואז לערבב ביסודיות. להכניס למקרר את מאגר הליזה של ריפה כאשר לא בשימוש.
3. בעדינות לחתוך את הכליה לחצי (משונן מישור) וחותכים פיסת רקמה (50-70 מ"מ²) מאזור הקליפה במרכז הכליה (שקילה 80-100 mg על ידי משקל רטוב).
4. מטפחת את בלוק הרקמה לחתיכות קטנות בסכין כדי לסייע לתהליך המגון.
5. לאחר להפוך את הרקמות, להעביר אותם צינור microfuge עם 1 מ ל של מאגר החילוץ הקרח קר 1x ריפה. הניחו את הצינורות בקרח עד לחילוץ נוסף.

3. רקמת הומוגון

1. סמן את הצינורות הmicrofuge עם פרטים ספציפיים לדוגמה עבור אוסף הרקמה הסופרנטית.
2. שימוש במכשיר כף יד עם בדיקה סטרילית, ולאחר מכן המגון את הרקמות עבור 1-2 דקות בתנאים קרים (דגימות על דלי קרח) עד שאין גושים של רקמות גלויים.
3. נושא הרקמה תמציות מיד עבור צנטריפוגה ב צנטריפוגה בקירור ב 9,600 x g עבור 5 דקות ב 4 ° c.
4. להסיר את הצינורות מהצנטריפוגה ולמקם אותם על דלי קרח.
5. לאסוף את supernatant לתוך microfuge צינור חדש בתווית ולאחסן על הקרח. . להשליך את הגלולה
6. הכינו מחזורי הפרדה נפרדים של סופרנטנים עבור LH ו-ובדיקות מקושרות-אנזים הקשורות לאנזימים (אליסה) וניתוח חלבון מוחלט, בהתאמה, כדי למנוע הקפאת ההפשרה.

4. שור ו Porcine LH השיטת אליסה

1. אחסן את כל רכיבי שיטת ה-אליסה כלולים במערכת הורמון החלבית הזמינה מסחרית (LH) (ראה טבלת חומרים) ב-2-8 ° c. זה כולל את הנוגדן, HRP-המשלים, שיטת הפעולה (96 היטב), ככייל, מאגר לשטוף (20x להתרכז), מצע A, מצע B, ולעצור פתרון. הכן את כל הריאגנטים כפי שמומלץ על ידי הוראות היצרן.
2. לפני תחילת השיטת, הביאו את כל הריאגנטים ואת הצלחת לטמפרטורת החדר (RT). השתמש במספר הדרוש של בארות לצורך השימוש באותו מספר, חותם ושמור על הבארות שאינן בשימוש ב-4 ° צ' עד לשימוש.
3. דלל את מאגר הכביסה (15 מ ל של 20x להתרכז) עד 300 mL עם מים כפולים מזוקקים
4. הגדר את הבארות הריקות ללא כל פתרון.
5. הוסף 50 μL של תקן או מדגם לכל טוב (n = 2), ולאחר מכן להוסיף עוד 50 μL של חזרת peroxidase (hrp)-המשלים לכל טוב. מיד להוסיף עוד 50 μL של פתרון נוגדן לכל טוב. לאטום את הצלחת, לערבב היטב, ו הדגירה 1 h ב 37 ° c.
6. לשטוף את הבארות עם מאגר לשטוף 1 x (200 μL/טוב) ולחזור 4x.
7. הוסף 50 μL של מצע A ו-50 μL של מצע B לכל באר, ומערבבים היטב על ידי הקשה על הצלחת בצד בעדינות. אטום את הצלחת ואת הדגירה של 15 דקות ב 37 ° c בחושך במשך 15 דקות.
8. הוסף 50 μL של פתרון להפסיק כל טוב, להקיש בעדינות על הצלחת, ולקרוא את הצלחת באמצעות הספקטרוסקופיה להגדיר 450 אורך גל ננומטר.
9. לנרמל את השור ו חזירי רמות לחלבון מוחלט (ראה סעיף 6).

5. שור ופורצין-שיטת אליסה

1. אחסן את כל רכיבי הזמינות של אליסה הכלולים במקדם הגדילה המסחרי והזמין של כלי הדם (ראה לוח חומרים) ב-2-8 ° c. זה כולל את הנוגדן, HRP-המשלים, שיטת הפעולה (96 היטב), ככייל, מאגר לשטוף (20x להתרכז), מצע A, מצע B, ולעצור פתרון. הכן את כל הריאגנטים כפי שמומלץ על ידי הוראות היצרן.
2. לפני שמתחילים את האפשרות, להביא את כל הריאגנטים ואת הצלחת לשאת את לוחית. השתמש במספר הדרוש של בארות לצורך הצורך, לחתום ולשמור על הבארות שאינן בשימוש ב-4 ° צ' עד לשימוש.
3. דלל את מאגר הכביסה (15 מ ל של 20x להתרכז) עד 300 mL עם מים כפולים מזוקקים
4. הוסף 100 μL של התקן או מדגם לכל טוב (n = 2). לאטום את הצלחת, לערבב היטב, ו דגירה עבור 2 h ב 37 ° c.
5. להסיר את הנוזל בכל באר ולהוסיף 100 μL של זיהוי מגיב A לכל טוב, לאטום את הצלחת, ו הדגירה עבור 1 h ב 37 ° c.
6. לשטוף את הבארות עם מאגר לשטוף 1 x (400 μL/טוב) ולחזור 4x.
7. הוסף 100 μL של זיהוי מגיב B לכל טוב ומערבבים היטב על ידי הקשה על הצלחת בצד בעדינות. אטום את הצלחת והטה את הצלחת 1 h ב 37 ° c.
8. לשטוף את הבארות עם מאגר לשטוף 1 x (400 μL/טוב) ולחזור 4x.
9. הוסף 90 μL של פתרון המצע לכל טוב, הקש בעדינות על הצלחת, ו-דגירה עבור 1 h ב 37 ° c.
10. הוסף 50 μL של פתרון להפסיק כל טוב, להקיש בעדינות על הצלחת, ולקרוא את הצלחת באמצעות הספקטרוסקופיה להגדיר 450 אורך גל ננומטר.
11. לנרמל את השור ואת מפלס הפרוטאין-A רמות לחלבון מוחלט (סעיף 6).

6. שערוך חלבון סה

1. הערכת חלבון מוחלט של השור ואת תמציות כליות חזירי על ידי תקן באמצעות סרום שור סטנדרטי (bsa) באמצעות ערכה מסחרית (ראה טבלת חומרים) על פי המלצות היצרן.

7. אנליזה סטטיסטית

1. לחשב את הממוצע, חציון, ואת סטיית התקן של כל האנליטה.
2. בדוק את הסטייה של התפלגות המדגם מהרגיל ניצול קולמוגורוב-סמירנוף מבחן להחליט, על פי השימוש, בין פרמטרית לעומת. בדיקות סטטיסטיות לא פרמטרית. אם הנתונים מופצים בדרך כלל, לאחר מכן לבצע בדיקה סטטיסטית באמצעות בדיקות פרמטרית.
3. בנסיבות מתאימות (כגון התפלגות נתונים נורמלית), לנצל מודלים רגרסיה כדי לבחון את הקשר הליניארי בין LH ו-והוא.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

תוצאות

רמות ממוצע וחציון של LH ו-ומסוג בעלי חיים מופיעים על ידי סקס מוצגים בטבלה 1. לאחר אימות נורמליות של נתונים על ידי Kolmogorov-סמירנוף בדיקות של נורמליות, מודלים רגרסיה לינארית היו מנוצלים כדי לבחון את הקשר בין LH ו-מודל. LH נמצאה להיות מנבא חזק ומשמעותי של ובהן הכליות שור ו ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

לרכישת כליות מהמטבחיים מיד לאחר מוות בעלי חיים הוא המפתח להצלחה במתודולוגיה זו. זהו היתרון העיקרי של ניצול איברים מפרות וחזירים במקום גופות אדם. בדרך כלל יש לפחות עיכוב של 12-24 h מזמן המוות עד שאיברי הגוף האנושיים מושגו. בגלל ההרכב הכימי של איברי הגוף משתנה באופן משמעותי בתוך 2 h לאחר המוות

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Bovine LH ELISA Kit	MyBiosource, San Diego, CA.	MBS700951
Bovine VEGF-A ELISA Kit	MyBiosource, San Diego, CA.	MBS2887434
Micro BCA Protein Assay Kit	ThermoFisher Scientific Inc, Columbus, OH.	23235
Porcine LH ELISA Kit	MyBiosource, San Diego, CA.	MBS009739
Porcine VEGF-A ELISA	Ray Biotech, Norcross, GA.	ELP-VEGFA-1
RIPA Lysis and Extraction Buffer	ThermoFisher Scientific Inc, Columbus, OH.	89901