تحضير العينات البيولوجية للانتواع في درجة حرارة التبريد باستخدام التحليل الطيفي عالي الدقة لامتصاص الأشعة السينية

Summary

يقدم هذا البروتوكول إجراء مفصلا لإعداد عينات التبريد البيولوجية لتجارب التحليل الطيفي لامتصاص الأشعة السينية القائمة على السنكروترون. نحن نصف جميع الخطوات المطلوبة لتحسين إعداد العينات والحفظ بالتبريد مع أمثلة على البروتوكول مع خلايا السرطان والعوالق النباتية. توفر هذه الطريقة معيارا عالميا لإعداد العينات بالتبريد.

Abstract

إن دراسة العناصر ذات التحليل الطيفي لامتصاص الأشعة السينية (XAS) ذات أهمية خاصة عند دراسة دور المعادن في النظم البيولوجية. يعد تحضير العينات إجراء رئيسيا وغالبا ما يكون معقدا ، خاصة بالنسبة للعينات البيولوجية. وعلى الرغم من أن تقنيات انتواع الأشعة السينية تستخدم على نطاق واسع، لم يتم بعد نشر أي بروتوكول مفصل لمستخدمي هذه التقنية. علاوة على ذلك ، فإن تعديل الحالة الكيميائية أمر مثير للقلق ، ويوصى بالتقنيات القائمة على التبريد لتحليل العينات البيولوجية في حالتها المائية شبه الأصلية لتوفير أقصى قدر من الحفاظ على السلامة الكيميائية للخلايا أو الأنسجة. هنا ، نقترح بروتوكول إعداد خلوي يعتمد على العينات المحفوظة بالتبريد. ويتضح ذلك في التألق عالي الدقة للطاقة الذي تم الكشف عنه دراسة طيفية لامتصاص الأشعة السينية للسيلينيوم في الخلايا السرطانية ودراسة للحديد في العوالق النباتية. يمكن استخدام هذا البروتوكول مع عينات بيولوجية أخرى وتقنيات الأشعة السينية الأخرى التي يمكن أن تتضرر من التشعيع.

Introduction

تتطلب دراسة التحولات الحيوية الخلوية للعناصر الأساسية أو السامة تقنيات انتواع ذات حساسية عالية ويجب أن تقلل إلى أدنى حد من خطوات إعداد العينات التي غالبا ما تكون عرضة لتعديل الأنواع الكيميائية.

من المعروف أن العناصر الفسيولوجية مثل السيلينيوم والحديد يصعب تحديدها بشكل خاص بسبب كيمياءها المعقدة ، والثبات المختلفة لأنواع السيلينيوم أو الحديد ، وتركيزها المنخفض في نطاق جزء في المليون (مغ / كغ) أو حتى دون جزء في المليون. وبالتالي ، فإن دراسة انتواع هذه العناصر بواسطة XAS يمكن أن تكون صعبة للغاية. السنكروترون XAS وخاصة التألق عالي الدقة للطاقة المكتشف XAS (HERFD-XAS) ، والذي يسمح بنسبة إشارة إلى خلفية منخفضة للغاية¹ ، متوفرة في مصادر السنكروترون لتحديد العناصر المخففة للغاية في المصفوفات البيولوجية المعقدة ^2,3. يمكن إجراء قياسات التألق XAS التقليدية باستخدام كاشف الحالة الصلبة المحلولة للطاقة (SSD) مع عرض نطاق ترددي للطاقة ~ 150-250 eV ، على خط شعاع CRG-FAME في المرفق الأوروبي لإشعاع السنكروترون (ESRF)⁴ ، في حين تحتاج قياسات HERFD-XAS إلى مطياف محلل البلورات (CAS) ، مع عرض نطاق ترددي للطاقة ~ 1-3 eV ، على خط شعاع CRG-FAME-UHD في ESRF² . يتم تمييز الفوتونات الفلورية فيما يتعلق بطاقتها مع العمليات الإلكترونية أو البصرية على التوالي.

يعد تحضير العينة بالتبريد ضروريا للحفاظ على الهياكل والحفاظ على السلامة الكيميائية التركيبية ، مما يسمح بالتحليل بالقرب من الحالة البيولوجية الأصلية⁵. وعلاوة على ذلك، فإن التحليلات التي تجرى في درجات حرارة مبردة تصل إلى 10 كلفن باستخدام التبريد المبرد بالهيليوم السائل (LN₂)، تسمح للضرر الإشعاعي بالتباطؤ وتحافظ على الانتواع الأولي ل XAS. على الرغم من أن بعض المراجعات حول تقنيات XAS المطبقة على العينات البيولوجية تفيد بضرورة إعداد وتحليل العينات في الظروف المبردة (على سبيل المثال ، Sarret et ^al.6 و Porcaro et ^al.7) ، إلا أن أيا منها لا يصف بوضوح البروتوكول التفصيلي ذي الصلة. في هذا المنشور ، يتم وصف طريقة للتحضير المبرد للخلايا السرطانية والكائنات الحية الدقيقة للعوالق لانتواع HERFD-XAS ل Se⁸ و Fe⁹ في درجة حرارة مبردة.

تتطلب الممارسة الجيدة لإعداد العينات والبيئة أثناء قياسات التحليل الطيفي XAS الحديثة 1) إعدادا ؛ 2) إجراء تحليل يحد من آثار الضرر الإشعاعي قدر الإمكان ؛ و 3) عينة (أو مرجع مركب نموذجي) متجانسة قدر الإمكان فيما يتعلق بحجم شعاع فوتونات الأشعة السينية. يؤخذ العنصر الأول في الاعتبار عن طريق إجراء عملية الاستحواذ عند درجة حرارة منخفضة ، باستخدام كريوستات الهيليوم السائل. يتم التعامل مع البند الثاني من خلال تنفيذ كل عملية اقتناء على مساحة جديدة من العينة عن طريق تحريكها فيما يتعلق بالشعاع. وأخيرا، وبالنظر إلى الشرط الثالث، فإن العينات (الكريات) والمراجع (المساحيق) مشروطة في كريات سائبة مضغوطة من أجل الحد من المساميات وعدم التجانس قدر الإمكان، وتجنب الخشونة فيما يتعلق بحجم الحزمة على سطح العينة الذي تم فحصه بالأشعة السينية. نوضح كيف يتعامل البروتوكول مع كل هذه النقاط.

استخدمنا خط خلايا البروستاتا البشرية PC-3 (إمكانات نقيلي عالية) وخط خلية المبيض OVCAR-3 (الذي يمثل ما يصل إلى 70٪ من جميع حالات سرطان المبيض) للتحقيق في الخصائص المضادة للتكاثر تجاه الخلايا السرطانية لجسيمات السيلينيوم النانوية (Se-NPs) ، و Phaeodactylum tricornutum diatom كنوع نموذجي للتحقيق في عزل الحديد في العوالق النباتية.

Protocol

1. إعداد الكريات البشرية PC-3 و OVCAR-3 الخلايا السرطانية لانتواع السيلينيوم

ملاحظة: البروتوكول التالي مقتبس من Weekley et ^al.10. يجب تنفيذ جميع الخطوات تحت غطاء استزراع الخلايا بموجب شروط وقيود السلامة الأحيائية من المستوى 2 ، باستخدام تقنيات التعقيم.

1. عد الخلايا باستخدام غرفة عد الخلايا Malassez. زرع 150,000-200,000 خلية لكل قارورة لخط خلية PC-3 و 300,000 خلية لخط خلية OVCAR-3.
2. خلايا البذور في قوارير T-75 (ثلاث قوارير لكل حالة من أجل الحصول على ثلاثة أضعاف) في وسائط زراعة الخلايا الكافية (الجدول 1) تحت غطاء التدفق الصفحي.
3. اترك مزارع الخلايا تنمو في حاضنة عند 37 درجة مئوية وجو رطب مع 5٪ CO₂ حتى تصل إلى 80٪ من الالتقاء. عادة ، تتضاعف خطوط خلايا سرطان البروستاتا PC-3 بعد 24 ساعة بينما تستغرق خطوط خلايا سرطان المبيض OVCAR-3 72 ساعة. يجب ترك القوارير في الحاضنة.
4. وفي الوقت نفسه ، قم بتخفيف Se-NPs المستخدمة في العلاج إلى تركيز نهائي يتوافق مع IC20 (التركيز المثبط لتحقيق موت الخلايا بنسبة 20٪) الذي تم تحديده مسبقا بواسطة MTT (3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide) لتقييم السمية الخلوية. هذه التركيزات خاصة بكل نوع من أنواع Se-NPs ولكنها خاصة أيضا بخط الخلية المدروس.
   1. ضع محلول مخزون الجسيمات النانوية (2 ملغم / مل من ألبومين مصل البقر [BSA] أو Se-NPs المغلف بالشيتوزان) في حمام مائي بالموجات فوق الصوتية لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة (RT).
   2. قم بتخفيف محلول Se-NPs عن طريق التخفيفات التسلسلية في وسط زراعة الخلايا الكامل للوصول إلى تركيزات العمل. بين كل تخفيف ، دوامة لمدة 1 دقيقة.
5. إعداد السيلينيوم السيطرة الإيجابية مع ملح السيلينيوم المخفف للعلاج.
   1. تحضير محلول سيلينيت الصوديوم المائي (1 ملغ / مل) في أنبوب البولي بروبيلين 15 مل. مزيج 1 ملغ من مسحوق سيلينيت الصوديوم مع 1 مل من الماء فائق النقاء.
   2. دوامة حل الأسهم لمدة 1 دقيقة.
   3. قم بتخفيف محلول مخزون سيلينيت الصوديوم عن طريق التخفيفات التسلسلية في وسط زراعة الخلايا الكامل للوصول إلى تركيزات العمل.
      ملاحظة: لا تنس أن تماصة عدة مرات قبل كل تخفيف من أجل تجانس المحلول.
6. تعريض الخلايا السرطانية لعلاجات السيلينيوم.
   ملاحظة: يجب تكرار هذا الجزء من البروتوكول لكل جسيم نانوي (NP) تم اختباره. هنا ، تعد NPs من نوعين ، BSA و Se-NPs المطلية بالشيتوسان ، بالإضافة إلى عناصر التحكم. محلول سيلينيت الصوديوم هو التحكم الإيجابي ولا يوجد علاج هو التحكم السلبي.
   1. افتح قوارير T-75 الثلاثة التي تحتوي على الخلايا الموجودة في غطاء التدفق الرقائقي.
   2. قم بإزالة الوسط واغسل الخلايا بلطف 2x مع 5 مل من محلول ملحي دافئ (37 درجة مئوية) من الفوسفات المخزن مؤقتا (PBS).
   3. بلطف ، على الجانب السفلي من القارورة وليس مباشرة على طبقة الخلية ، أضف 15 مل من العلاج في كل قارورة باستخدام ماصة أوتوماتيكية مجهزة بماصات بلاستيكية معقمة سعة 25 مل. ضع الأغطية على القوارير. لا تغلق الأغطية بإحكام.
      ملاحظة: كما هو موضح في الخطوتين 1.3 و1.4، يجب إعادة تعليق حلول المعالجة مسبقا لتكون متجانسة.
   4. اترك القوارير الثلاث أفقيا في حاضنة عند 37 درجة مئوية وجو رطب بنسبة 5٪ CO₂ لمدة 24 ساعة.
7. تحضير كريات الخلية
   1. اغسل الخلايا بلطف 2x مع 5 مل من PBS الدافئة (37 درجة مئوية) مباشرة في قوارير T75.
   2. أضف 6 مل من وسط زراعة الخلايا الدافئ (37 درجة مئوية) على طبقة الخلية في قارورة T-75 باستخدام صبي ماصة مجهز بماصات بلاستيكية معقمة سعة 10 مل.
   3. جمع الخلايا عن طريق كشط لطيف باستخدام مكشطة الخلايا. استخدم مكشطة خلية واحدة لكل قارورة.
   4. باستخدام صبي ماصة وماصة 10 مل ، قم بشفط السائل وطرد الخلية / الوسط مرة أخرى على سطح القارورة من أجل جمع جميع الخلايا. كرر هذه الخطوة عدة مرات لفصل الخلايا وتفردها. اجمع الوسط الذي يحتوي على الخلايا في أنبوب بولي بروبيلين سعة 15 مل.
   5. تدور لأسفل في 250 × غرام لمدة 5 دقائق في RT. شفط السوبرناتانت.
   6. شطف الخلايا عن طريق تعليقها في 5 مل من PBS.
   7. تدور لأسفل في 250 × غرام لمدة 5 دقائق في RT. شفط supernatant وكرر الخطوات 1.6.5 و 1.6.6 2x للتخلص من جميع الآثار المتبقية من العلاج.
   8. أعد تعليق الخلايا في 1 مل من PBS وانقلها إلى أنبوب بولي بروبيلين سعة 1.5 مل. أخيرا ، قم بتدويرها لأسفل عند 250 × g لمدة 5 دقائق في RT. يمثل الشكل 1 حبيبات الخلية التي تم الحصول عليها بعد الطرد المركزي والتخلص من supernatant.
   9. قم بإزالة جميع أجهزة PBS الفائقة بلطف باستخدام ماصة سعة 200 ميكرولتر.
      ملاحظة: احرص على عدم لمس وتلف حبيبات الخلايا. من الناحية المثالية ، يجب أن يكون ارتفاع الكريات 2-3 مم أو سمكها ، وقطرها 3-6 مم. بالنسبة لخط خلايا PC-3 ، يلزم وجود 9 × 10 6-10 × 10⁶ خلايا للفحص. بالنسبة لخط خلية OVCAR-3 ، هناك حاجة إلى 8 × 10 6-9 × 10⁶ خلايا (الشكل 1). من المحتمل أن تفقد بعض الخلايا أثناء خطوات الشطف العازلة اللاحقة. كلما ارتفع رقم الخلية ، كلما كان الكريات أفضل.
8. التجميد المفاجئ للكريات الخلوية
   1. اغمس الجزء السفلي من أنبوب 1.5 مل الذي يحتوي على الكريات في النيتروجين السائل (LN₂) إلى مستوى بيليه الخلية.
   2. في صندوق قفازات تم تطهيره بالكامل بجو خامل مثل غاز النيتروجين ، اجمع حبيبات الخلية عن طريق النقر بلطف على أنبوب 1.5 مل على السطح المستوي لكتلة نحاسية مبردة ب LN 2 (الشكل 2). ثم يتم جمع الكريات دون فقدان الخلايا.
      ملاحظة: استخدم معدات الحماية من التبريد، ومعطف المختبر، والأحذية المغلقة، والقفازات المبردة، ودرع الوجه أو نظارات السلامة للتعامل مع LN₂ .
   3. إذا لزم الأمر ، يمكن استخدام إبرة مبردة LN₂ للمساعدة في إخراج الكرية.
      ملاحظة: يمكن أن تتفتت حبيبات الخلايا المجمدة الناتجة. يجب تنفيذ هذه الخطوات في غضون بضع دقائق والاعتماد على براعة الباحث وسرعته.
   4. يجب أن تتناسب أبعاد الكريات المجمدة مع حامل عينة cryostat. باستخدام المعدات الموصوفة ، إذا كان ارتفاع بيليه الخلية أكبر من 2 مم وأصغر قليلا من ثقب حامل العينة المستخدم في XAS ، فيمكن استخدام العينة مباشرة. إذا لم يكن الأمر كذلك ، أو إذا كان هناك حاجة إلى سطح مستو للتحليل ، فيجب إعداد حبيبة أسطوانية سائبة ، مع الحفاظ على الكريات في حالتها المجمدة. إذا كانت حبيبات الخلية مجزأة ، فيمكن استخدام الخطوات التالية بشكل مثالي في صندوق قفازات يتم تطهيره بالكامل بجو خامل.
9. تحضير الكريات الأسطوانية المجمدة السائبة
   1. اغمر جميع أجزاء المكبس الهيدروليكي اليدوي الذي سيكون على اتصال بالعينة في LN₂ (الشكل 3A ؛ قوالب الكريات التي يبلغ قطرها 3 أو 5 مم ، والعفن ، وسحب المكبس / الأسلاك).
   2. انقل شظايا الكريات المجمدة بسرعة إلى القالب المحمل بقوالب الكريات المناسبة (الشكل 3B).
   3. بيليتيز سريع مع الصحافة الهيدروليكية. يكفي استخدام 1.5 طن لحبيبة قطرها 5 مم أو 0.5 طن لبيليه قطره 3 مم (الشكل 3C).
      ملاحظة: بعد كل إعداد بيليه مع الصحافة الهيدروليكية ، يجب إذابة جميع المواد وتجفيفها بشكل صحيح باستخدام غاز النيتروجين لتجنب أي مشاكل مع الصقيع والرطوبة المتبقية.
   4. جمع الكريات السائبة من الخلايا المجمدة بسرعة ووضعها في أنبوب تبريد مناسب للتخزين.
   5. قم بتخزينه مرة أخرى في خزان LN₂ للتخزين على المدى الطويل.
   6. نقل وتركيب الكريات المبردة للتحليل. يتم نقل الكريات المخزنة في أنبوب تبريد LN 2 المبرد إلى حامل عينة cryostat مبرد مسبقا 77K في السائل N₂ (الشكل 4 ، كما هو مستخدم في خط شعاع CRG-FAME-UHD). يجب تنفيذ هذه الخطوة في أسرع وقت ممكن ولكن يمكن أن تستغرق بضع دقائق. ثم انقل حامل العينة إلى cryostat وحافظ عليه عند 10 كلفن أثناء تحليل XAS بأكمله.
      ملاحظة: الخطوتان 1.9.3 و 1.9.6 صعبتان لأنه يجب القيام بهما بسرعة لتجنب أي تكوين للصقيع من شأنه أن يمنع المكبس والقالب. البديل هو تنفيذ هذه الخطوات تحت خيمة بلاستيكية مطهرة بالكامل بغاز النيتروجين. تسمح الكتلة النحاسية LN_2-cool بإبقاء الكريات مجمدة.

2. تحضير خلايا العوالق لانتواع الحديد

ملاحظة: تم تحضير مياه البحر الاصطناعية المستخدمة في هذا البروتوكول عن طريق إضافة أملاح البحر المائية فائقة النقاء ، وحمض البروبانسلفونيك المورفولينو ، ونترات الأمونيوم ، ونترات الصوديوم ، وخماسي هيدرات ميتاسيليكات الصوديوم ، وفوسفات الصوديوم أحادي القاعدة ، ومخزون الفيتامينات ، ومخزون المعادن النزرة ، ومخزون المضادات الحيوية ، ومخزن HEPES العازل عند درجة الحموضة = 7.9. يشار إلى تركيزات كل مكون في جدول المواد. ويمكن الاطلاع على تفاصيل عن الثقافة في سوتاك وآخرين(¹¹).

1. الطرد المركزي لمزرعة الدياتوم P. tricornutum في أنبوب بولي بروبيلين سعة 50 مل عند 1100 × جم لمدة 6 دقائق ونقل الكريات إلى قارورة ذات وسط طازج.
2. دع الثقافة تنمو في مياه البحر الاصطناعية في غرفة نمو لمدة 24 ساعة.
3. الطرد المركزي لثقافة العوالق لمدة 6 دقائق عند 1100 × غرام ونقل الكريات إلى وسط طازج يحتوي على فيترات Fe (1 ميكرومتر في الثقافة النهائية). حضانة لمدة 72 ساعة.
4. تحضير خلايا العوالق
   1. الطرد المركزي للخلايا لمدة 3 دقائق في 1100 × غرام وشطف مع المتوسطة دون الحديد.
   2. انقل الكريات إلى أنبوب بولي بروبيلين سعة 1.5 مل ، واغسلها بالماء فائق النقاء ، وجهاز طرد مركزي 2x لمدة 3 دقائق عند 1100 × جم. إزالة supernatant.
   3. اغمس الجزء السفلي من أنبوب البولي بروبيلين سعة 1.5 مل الذي يحتوي على الكريات في LN₂ كما هو موضح في الخطوة 1.8.
   4. انقل الخلايا المجمدة في لحام LN₂ المجمد واضغط بسرعة باستخدام مكبس حبيبات XRF (الشكل 3 والشكل 7) كما هو موضح في الخطوة 1.9.
   5. قم بإزالة الكريات وتخزينها في خزان LN₂ للتخزين على المدى الطويل.
   6. اتبع الخطوة 1.9.6 (انظر الشكل 4 للنقل إلى حامل عينة cryostat).

3. إعداد وقياس المركب المرجعي

ملاحظة: يجب إعداد المركبات المرجعية (الصلبة أو السائلة) الممثلة للأنواع والمتوقع العثور عليها في النظام البيولوجي وتحليلها بواسطة XAS لمقارنتها بالعينات البيولوجية التجريبية. يمكن العثور على الأطياف المرجعية أيضا في قواعد البيانات¹²،^13،14 ويمكن استخدامها شريطة أن تكون ظروف القياس (مثل الدقة الطيفية) مماثلة للعينات التجريبية.

1. بالنسبة للمراجع في المحلول المائي ، قم بوزن المركبات الأولية في شكل مسحوق أو سائل تحت حالة لاهوائية أو جو خامل. قم بإعداد مراجع حساسة للأكسدة والاختزال في جو خامل (أي في صندوق قفازات لاهوائية أو في خط Schlenk ، انظر الشكل 5 والشكل 6) لتجنب أي تفاعل مختزل للأكسدة وللحفاظ على السلامة الكيميائية للمركب ، والتي يمكن أن تكون شديدة التفاعل وغير مستقرة في الهواء المحيط). هنا ، تم إعداد جميع مراجع السيلينيوم باستخدام خط Schlenk والمياه فائقة النقاء المنزوعة من الغاز (الشكل 6). تم تحضير السائل Fe^III-malate والفيريتين في الهواء المحيط.
2. اخلطه مع محلول مناسب من أجل الوصول إلى تركيز نهائي بنسبة 1٪ من الوزن للعنصر المدروس (أي السيلينيوم أو الحديد) للجمع في وضع التألق.
   ملاحظة: المياه فائقة النقاء هي الحل الأكثر استخداما لإعداد مراجع XAS. يلزم إضافة الجلسرين (15٪ -20٪) للسوائل التي يتم قياسها باستخدام تألق XAS القياسي لمنع القطع الأثرية الناشئة عن حيود الأشعة السينية بواسطة بلورات الجليد والحفاظ على جودة إشارة XAS التي تم جمعها باستخدام كاشف الحالة الصلبة. ومع ذلك ، بالنسبة ل HERFD-XAS ، فإن الجلسرين ليس إلزاميا. باستخدام مطياف محلل البلورات بدلا من كاشف الحالة الصلبة ، يتم اختيار الطاقة بدقة عالية للغاية ولا يؤثر الحيود الناجم عن بلورات الجليد على جمع البيانات للعنصر¹ المدروس.
3. احتفظ بالمحلول المحضر وخزنه في بالون Schlenk مغلق (الشكل 5) أو في أنبوب بولي بروبيلين سعة 1.5 مل حتى يتم قياسه في نفس ظروف العينات.
4. بالنسبة للمراجع الصلبة ، قم بوزن السيلينيوم أو مساحيق مركبات نموذج الحديد في الهواء المحيط أو في صندوق قفازات إذا كانت الأنواع حساسة للأكسدة والاختزال. هنا ، تم تحضير مراجع Fe^II الصلبة (Fe II-acetate و vivianite) في صندوق قفازات N₂ غازي بينما تم تحضير Fe^III (Fe(OH)₃ و Fe^{III-phosphate}) في الهواء المحيط.
5. وزن مسحوق نيتريد البورون عالي النقاء وخلطه مع مساحيق مركبات النموذج من أجل الوصول إلى تركيز نهائي 1٪ بالوزن للعنصر المدروس (الشكل 7A).
6. طحن إلى مسحوق ناعم باستخدام هاون لمدة 15 دقيقة على الأقل.
7. ضع خليط المسحوق في اللحام لإعداد الكريات باستخدام المكبس الهيدروليكي (الشكل 7B ، على غرار الشكل 3A لحبيبات العينة).
8. أغلق اللحام بالمكبس (الشكل 7C ، على غرار الشكل 3B لحبيبات العينة).
9. اضغط للحصول على الكريات السائبة (الشكل 7D ، على غرار الشكل 3C لبيليه العينة).
10. قم بتخزين الكريات السائبة المحضرة في صندوق القفازات حتى يتم تحليلها في نفس ظروف العينات.
    ملاحظة: تلتصق الكريات السائبة أحيانا بالمكابس ، اعتمادا على توافق المسحوق ، على سبيل المثال. قد يكون من الصعب إزالته بهدوء دون كسره. في هذه الحالة ، يجب استخدام الإجراء التالي باستخدام أقراص البوليميد (على سبيل المثال ، Kapton).
11. ضع قطرة من الإيثانول على كل جانب من المكابس التي ستكون على اتصال بالمسحوق (الشكل 8A).
12. قم بإعداد قرصين بوليميد بقطر أصغر قليلا من المكابس. يجب أن يكون سمك البوليميد 10-25 ميكرومتر (سيكون من الصعب التعامل مع أرق ، وسوف يمتص أكثر سمكا الكثير من فوتونات الأشعة السينية أثناء التحليل).
13. ضع الأقراص على المكابس. سوف يلتصقون بالعمل الشعري (الشكل 8B).
14. قم بتركيب اللحام باستخدام المكبس ، وأضف المسحوق ، وضعه في المكبس الثاني (الشكل 8C).
15. اضغط (انظر الخطوة 3.11) وقم بإزالة الكريات السائبة المضغوطة من المكابس.
    ملاحظة: يمكن تركيب المراجع الصلبة على حامل العينة الخاص ب cryostat مثل العينات (انظر الخطوة 1.8.6). يمكن تركيب المراجع السائلة على حامل العينة الخاص ب cryostat. انظر الشكل 9A للحصول على حامل عينة CRG-FAME cryostat. يمكن تطبيق نفس الإجراء باستخدام حامل عينة CRG-FAME-UHD ، كما هو موضح في الشكل 4D ، باستخدام الإجراء التالي.
16. تركيب مرجع سائل على حامل عينة cryostat.
    1. اضبط شريط البوليميد (على سبيل المثال، كابتون) (بسمك 25 ميكرومتر) من أجل إغلاق جانب واحد من الثقب على حامل العينة في RT (الشكل 9B).
    2. باستخدام حقنة ، املأ التجويف ببطء بالمحلول حتى يصل إلى الأعلى. تجنب الفقاعات. يجب ملء الخزان (الشكل 9C ، اليسار).
    3. ختم الجانب الآخر من التجويف مع الشريط (الشكل 9C ، يمين).
    4. اغمس حامل العينة المختوم في LN₂ (الشكل 9D ، T_{0-T 3}).
    5. التفاعل الحراري يحفز LN₂ الفقاعات. انتظر حتى تتوقف الفقاعات ، مما يشير إلى نهاية التفاعل (الشكل 9D ، T_{3-T 5}).
    6. انقل حامل العينة عند 77 كلفن إلى كريوستات خط الشعاع قبل البدء في جمع البيانات (الشكل 9D ، T₆) أو تخزينها في LN₂ Dewar.
       ملاحظة: ينتشر المحلول المجمد بشكل جيد في التجويف ويشكل بيليه موحد ومتجانس (الشكل 9D ، T₇).

4. HERFD-XAS: إجراء القياس

1. قم بتحسين جميع البلورات من CAS في ظروف Bragg فيما يتعلق بطاقة خط التألق ذات الاهتمام. يمكن القيام بهذا الإجراء باستخدام مركب مرجعي مركز.
2. معايرة طاقة الحزمة أحادية اللون الحادثة باستخدام مرجع يعرف عنه موضع الطاقة لحافة الامتصاص (عادة ما يكون رقاقة معدنية نقية). يمكن وضع هذا المرجع في خطوة ثانية بعد العينة ، في وضع الإرسال المزدوج ، من أجل التمكن من التحقق من المعايرة لكل أطياف تم الحصول عليها ومحاذاتها في النهاية بعد المعالجة.
3. ضع العينة في كريوستات الهيليوم السائل للعينات البيولوجية باتباع الإجراء المناسب الموضح في الخطوة 1.9.6.
4. أغلق الخزانة التجريبية باتباع قواعد السلامة السنكروترونية.
5. قم بإجراء اكتساب XAS على نطاق طاقة يغطي حافة الامتصاص المحددة.
6. بعد كل اكتساب طيفي، حرك العينة ضعف حجم الحزمة على الأقل في اتجاه الحركة قبل البدء في اكتساب جديد.
   ملاحظة: في هذه الحالة، تم إجراء القياسات باستخدام بلورات Ge(440) لتحديد خط Fe K a 1 واستخدام بلورات Ge(844) لتحديد خط Se K_a1. كان حجم الشعاع على العينة 200 × 100 ميكرومتر مربع (H × V كامل العرض نصف الحد الأقصى). كانت حركة العينة بين كل عملية اقتناء 500 ميكرومتر في كلا الاتجاهين ، من أجل التحقيق في التجانس الهيكلي وتحليل منطقة جديدة خالية من الأضرار الإشعاعية المحتملة السابقة في كل مرة. تتم مقارنة الأطياف الفردية ودمجها إذا كانت قابلة للتركيب داخل الضوضاء. يتم إيقاف القياس لعينة معينة عندما تكون جودة الطيف المدمج صحيحة. ثم يمكن إجراء تحليل البيانات باستخدام أي برنامج مخصص لتحليل XAS ، خاصة تلك التي تسمح بمزيج خطي مناسب من الأطياف العادية ، على سبيل المثال Athena و Artemis (مجموعة Demeter من البرامج) ¹⁵ أو SixPack¹⁶ أو Viper¹⁷. تقع التفسيرات الكاملة والمفصلة لتحليل XAS خارج نطاق هذا البروتوكول ويمكن العثور عليها في الأوراق الأخيرة^18,19 ، بعضها مخصص بشكل أكثر تحديدا للعينات البيولوجية²⁰. تم بالفعل جمع أطياف السيلينيوم XANES المرجعية في قاعدة بيانات أطياف SSHADE²¹.

النتائج

كانت الأهداف الرئيسية لهذه المستحضرات هي التحقيق في التفاعل بين جسيمات السيلينيوم النانوية (Se-NPs) والخلايا السرطانية ، وربط الحديد وعزله في العوالق النباتية.

أطياف HERFD-XANES من السيلينيوم في الحالة الأولية (BSA Se-NPs) وفي الخلايا المحتضنة في وسط غذائي (BSA Se-NPs بعد حضانة 24 ساعة) موضحة...

Discussion

تم استخدام هذا البروتوكول لدراسة الشكل الكيميائي للسيلينيوم والحديد في العينات البيولوجية عن طريق التحليل الطيفي لامتصاص الأشعة السينية. وهو يركز على إعداد وتخزين العينات البيولوجية والمركبات المرجعية بالتبريد ، وكذلك على قياسات HERFD-XAS.

إعداد التبريد وتخزينه
ي...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Ammonium nitrate	Sigma-Aldrich	A3795	NH4NO3, 2.66 mg/L of milliQ water
Anaerobic chamber	Coy Laboratory, USA		equipped with Anaerobic Monitor (CAM-12)
Antibiotic stock	Sigma-Aldrich	A0166 for ampicillin, S9137 for streptomycin sulfate	1 mL/L of milliQ water (ampicillin sodium and streptomycin sulfate, 100 mg/mL)
Boron nitride powder	Sigma-Aldrich	255475
Cell counting chamber			Neubauer or Malassez
Cell scraper
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (DPBS)	GIBCO	14190-094	Without Calcium, Magnesium, Phenol Red
Eppendorf tubes			0.5 mL and 1.5 mL
Falcon tubes			15 mL and 50 mL
Ferric citrate Fe/citrate = 1/20	Sigma-Aldrich	F3388	aqueous solution of FeCl3 50 mM and Na-citrate 1M pH 6.5
Fetal Bovine Serum	GIBCO	A31604-02	Performance Plus, certified One Shot format, US origin
Flasks	Sigma-Aldrich	Z707503	TPP 150 cm2 area
Growth chamber	Sanyo	Sanyo MLR-352	at 20 °C and under a 12:12 light (3,000 lux) dark regime
HEPES buffer	Sigma-Aldrich	H4034	1 g/L of milliQ water HEPES
High grade serous, OVCAR-3	ATCC, Rockville, MD	HTB-161	Storage temperature: liquid nitrogen vapor temperature
Incubator			Incubator at 37°C, humidified atmosphere with 5% CO2
Insulin solution from bovine pancreas	Sigma-Aldrich	I0516	10 mg/mL insulin in 25mM HEPES, pH 8.2, BioReagent, sterile-filtered, suitable for cell culture
Manual hydraulic press	Specac, USA
Marine diatom Phaeodactylum tricornutum	Roscoff culture collection	RCC69	http://roscoff-culture-collection.org/rcc-strain-details/69
Morpholinepropanesulfonic acid	Sigma-Aldrich	M3183	MOPS, 250 mg/L of milliQ water (pH 7.3)
Optical microscope
PC-3	ECCAC, Salisbury, UK	90112714	Storage temperature: liquid nitrogen vapor temperature
Penicillin-Streptomycin	Sigma-Aldrich	P4333	Solution stabilized, with 10,000 units penicillin and 10 mg streptomycin/mL, sterile-filtered, BioReagent, suitable for cell culture
Pipette-boy			25mL-, 10mL-, and 5mL sterile plastic-pipettes
Plankton culture products, Mf medium: Sea salts	Sigma-Aldrich	S9883	40g/L of milliQ water. Composition: Cl- 19.29 g, Na+ 10.78 g, SO42- 2.66 g, Mg2+ 1.32 g, K+ 420 mg, Ca2+ 400 mg, CO32- /HCO3- 200 mg, Sr2+ 8.8 mg, BO2- 5.6 mg, Br- 56 mg, I- 0.24 mg, Li+ 0.3 mg, F- 1 mg
Plastic tweezers	Oxford Instrument	AGT 5230
RPMI MEDIUM 1640 (ATCC Modification)	GIBCO	A10491-01	Solution with 4.5 g/L D-glucose, 1.5 g/L Sodium Bicarbonate, 110 mg/L (1 mM) Sodium Pyruvate, 2.388 g/L (10 mM) HEPES buffer and 300 mg/L L-glutamine for research use
Selenium nanoparticles (Se-NPs), BSA coated, 2 mg/mL	NANOCS Company, USA	Se50-BS-1	BSA stabilized Se-NPs solution. Average size about 30 nm. Stored at 4°C in the dark, protected from the light.
Selenium nanoparticles (Se-NPs), Chitosan coated, 2 mg/mL	NANOCS Company, USA	11. Se50-CS-1	Chitosan stabilized Se-NPs solution. Average size about 30 nm. Stored at 4°C in the dark, protected from the light.
Sodium metasilicate pentahydrate	Sigma-Aldrich	71746	Na2SiO3.5H2O, 22.8 mg/L of milliQ water
Sodium nitrate	Sigma-Aldrich	S5022	NaNO3, 75 mg/L of milliQ water
Sodium phosphate monobasic	Sigma-Aldrich	S5011	NaH2PO4, 15 mg/L of milliQ water
T-75 flasks
Tissue culture hood
Trace metal stock	Sigma-Aldrich	M5005, Z1001, M1651, C2911, 450243, 451193, 229857	1 mL/L of milliQ water (MnCl2.4H2O 200 mg/L, ZnSO4.7H2O 40 mg/L, Na2MoO4.2H2O 20mg/L, CoCl2.6H2O 14 mg/L, Na3VO4.nH2O 10 mg/L, NiCl2 10 mg/L, H2SeO3 10 mg/L)
Trypan Blue Solution (0.4%)	GIBCO	15250061
Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red	GIBCO	25300-054
Vitamin stock	Sigma-Aldrich	T1270 for thiamine, B4639 for biotin, V6629 for B12	1 mL/L of milliQ water (thiamine HCl 20 mg/L, biotin 1 mg/L, B12 1 mg/L)
Water bath 37°C