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Neste Artigo

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  • Protocolo
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  • Divulgações
  • Agradecimentos
  • Materiais
  • Referências
  • Reimpressões e Permissões

Resumo

Este protocolo apresenta um procedimento detalhado para preparar criosamples biológicas para experimentos de espectroscopia de absorção de raios-X baseados em síncrotrons. Descrevemos todas as etapas necessárias para otimizar a preparação da amostra e a criopreservação com exemplos do protocolo com células cancerígenas e fitoplâncton. Este método fornece um padrão universal de preparação crio-de-amostra.

Resumo

O estudo de elementos com espectroscopia de absorção de raios-X (XAS) é de particular interesse ao estudar o papel dos metais em sistemas biológicos. A preparação da amostra é um procedimento fundamental e muitas vezes complexo, particularmente para amostras biológicas. Embora as técnicas de especiação de raios-X sejam amplamente utilizadas, nenhum protocolo detalhado ainda foi divulgado para os usuários da técnica. Além disso, a modificação do estado químico é preocupante, e técnicas baseadas em crio-claro são recomendadas para analisar as amostras biológicas em seu estado hidratado quase nativo para fornecer a máxima preservação da integridade química das células ou tecidos. Aqui, propomos um protocolo de preparação celular baseado em amostras crio-preservadas. É demonstrado em uma fluorescência detectada por fluorescência de alta resolução de raios-X estudo de espectroscopia de selênio em células cancerosas e um estudo de ferro em fitoplâncton. Este protocolo pode ser usado com outras amostras biológicas e outras técnicas de raio-X que podem ser danificadas por irradiação.

Introdução

O estudo das biotransformações celulares de elementos essenciais ou tóxicos requer técnicas de especiação com alta sensibilidade e deve minimizar as etapas de preparação da amostra que muitas vezes são propensas à modificação de espécies químicas.

Elementos fisiológicos como selênio e ferro são conhecidos por serem particularmente difíceis de especiar devido à sua química complexa, várias stabilidades das espécies de selênio ou ferro, e sua baixa concentração na faixa ppm (mg/kg) ou mesmo sub-ppm. Assim, o estudo da especiação desses elementos pelo XAS pode ser extremamente desafiador. O Síncrotron XAS e especialmente a fluorescência de alt

Protocolo

1. Preparação das pelotas humanas de células cancerígenas PC-3 e OVCAR-3 para especiação de selênio

NOTA: O seguinte protocolo é adaptado de Weekley et al.10. Todas as etapas devem ser realizadas sob uma capa de cultura celular sob condições e restrições de nível 2 de biossegurança, utilizando técnicas assépticas.

  1. Conte as células usando uma câmara de contagem de células Malassez. Semente 150.000-200.000 células por frasco para a linha celular PC-3 e 300.000 células para a linha celular OVCAR-3.
  2. Células de sementes em frascos T-75 (três frascos por condição para ter triplicados) na mídia de cultur

Resultados

Os principais objetivos dessas preparações foram investigar a interação entre nanopartículas de selênio (Se-NPs) e células cancerosas, e ligação de ferro e sequestro no fitoplâncton.

Os espectros HERFD-XANES do selênio no estado inicial (BSA Se-NPs) e em células incubadas em meio nutritivo (BSA Se-NPs após a incubação de 24 h) são mostrados na Figura 10. Os resultados mostraram que o selênio nos Se-NPs iniciais estava presente tanto como formas se...

Discussão

Este protocolo foi utilizado para estudar a forma química de selênio e ferro em amostras biológicas por espectroscopia de absorção de raios-X. Concentra-se na crio-preparação e armazenamento de amostras biológicas e compostos de referência, bem como nas medições HERFD-XAS.

Crio-preparação e armazenamento
A crio-preparação das pelotas de amostra biológica a granel permite a preservação da integridade química das espécies presentes nas amostras. Isso é cr...

Divulgações

Os autores não têm conflitos de interesse.

Agradecimentos

Somos gratos pelas contribuições financeiras para o desenvolvimento da linha de travesso pelo CEMHTI (Orleans, França, ANR-13-BS08-0012-01) e Labex OSUG@2020 (Grenoble, França, ANR-10-LABX-0056). O projeto FAME-UHD é apoiado financeiramente pelo "grande emprunt" francês EquipEx (EcoX, ANR-10-EQPX-27-01), pelo consórcio CEA-CNRS CRG e pelo instituto INSU CNRS. Agradecemos todas as contribuições durante os experimentos, especialmente todas as pessoas que trabalham no BM30B e BM16. Os autores reconhecem o Centro Europeu de Radiação Síncrotron para o fornecimento de tempo de radiação síncrotron. Também reconhecemos o projeto PHYTOMET ANR para apoio financeiro (ANR-16-CE01

Materiais

NameCompanyCatalog NumberComments
Ammonium nitrateSigma-AldrichA3795NH4NO3, 2.66 mg/L of milliQ water
Anaerobic chamberCoy Laboratory, USAequipped with Anaerobic Monitor (CAM-12)
Antibiotic stockSigma-AldrichA0166 for ampicillin, S9137 for streptomycin sulfate1 mL/L of milliQ water (ampicillin sodium and streptomycin sulfate, 100 mg/mL)
Boron nitride powderSigma-Aldrich255475
Cell counting chamberNeubauer or Malassez
Cell scraper
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (DPBS)GIBCO14190-094Without Calcium, Magnesium, Phenol Red
Eppendorf tubes0.5 mL and 1.5 mL
Falcon tubes15 mL and 50 mL
Ferric citrate Fe/citrate = 1/20Sigma-AldrichF3388aqueous solution of FeCl3 50 mM and Na-citrate 1M pH 6.5
Fetal Bovine SerumGIBCOA31604-02Performance Plus, certified One Shot format, US origin
FlasksSigma-AldrichZ707503TPP 150 cm2 area
Growth chamberSanyoSanyo MLR-352at 20 °C and under a 12:12 light (3,000 lux) dark regime
HEPES bufferSigma-AldrichH40341 g/L of milliQ water HEPES
High grade serous, OVCAR-3ATCC, Rockville, MDHTB-161Storage temperature: liquid nitrogen vapor temperature
IncubatorIncubator at 37°C, humidified atmosphere with 5% CO2
Insulin solution from bovine pancreasSigma-AldrichI051610 mg/mL insulin in 25mM HEPES, pH 8.2, BioReagent, sterile-filtered, suitable for cell culture
Manual hydraulic pressSpecac, USA
Marine diatom Phaeodactylum tricornutumRoscoff culture collectionRCC69http://roscoff-culture-collection.org/rcc-strain-details/69
Morpholinepropanesulfonic acidSigma-AldrichM3183MOPS, 250 mg/L of milliQ water (pH 7.3)
Optical microscope
PC-3ECCAC, Salisbury, UK90112714Storage temperature: liquid nitrogen vapor temperature
Penicillin-StreptomycinSigma-AldrichP4333Solution stabilized, with 10,000 units penicillin and 10 mg streptomycin/mL, sterile-filtered, BioReagent, suitable for cell culture
Pipette-boy25mL-, 10mL-, and 5mL sterile plastic-pipettes
Plankton culture products, Mf medium: Sea saltsSigma-AldrichS988340g/L of milliQ water. Composition: Cl- 19.29 g, Na+ 10.78 g, SO42- 2.66 g, Mg2+ 1.32 g, K+ 420 mg, Ca2+ 400 mg, CO32- /HCO3- 200 mg, Sr2+ 8.8 mg, BO2- 5.6 mg, Br- 56 mg, I- 0.24 mg, Li+ 0.3 mg, F- 1 mg
Plastic tweezersOxford InstrumentAGT 5230
RPMI MEDIUM 1640 (ATCC Modification)GIBCOA10491-01Solution with 4.5 g/L D-glucose, 1.5 g/L Sodium Bicarbonate, 110 mg/L (1 mM) Sodium Pyruvate, 2.388 g/L (10 mM) HEPES buffer and 300 mg/L L-glutamine for research use
Selenium nanoparticles (Se-NPs), BSA coated, 2 mg/mLNANOCS Company, USASe50-BS-1BSA stabilized Se-NPs solution. Average size about 30 nm. Stored at 4°C in the dark, protected from the light.
Selenium nanoparticles (Se-NPs), Chitosan coated, 2 mg/mLNANOCS Company, USA11. Se50-CS-1Chitosan stabilized Se-NPs solution. Average size about 30 nm. Stored at 4°C in the dark, protected from the light.
Sodium metasilicate pentahydrateSigma-Aldrich71746Na2SiO3.5H2O, 22.8 mg/L of milliQ water
Sodium nitrateSigma-AldrichS5022NaNO3, 75 mg/L of milliQ water
Sodium phosphate monobasicSigma-AldrichS5011NaH2PO4, 15 mg/L of milliQ water
T-75 flasks
Tissue culture hood
Trace metal stockSigma-AldrichM5005, Z1001, M1651, C2911, 450243, 451193, 2298571 mL/L of milliQ water (MnCl2.4H2O 200 mg/L, ZnSO4.7H2O 40 mg/L, Na2MoO4.2H2O 20mg/L, CoCl2.6H2O 14 mg/L, Na3VO4.nH2O 10 mg/L, NiCl2 10 mg/L, H2SeO3 10 mg/L)
Trypan Blue Solution (0.4%)GIBCO15250061
Trypsin-EDTA (0.05%), phenol redGIBCO25300-054
Vitamin stockSigma-AldrichT1270 for thiamine, B4639 for biotin, V6629 for B121 mL/L of milliQ water (thiamine HCl 20 mg/L, biotin 1 mg/L, B12 1 mg/L)
Water bath 37°C

Referências

Reimpressões e Permissões

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