使用高分辨率X射线吸收光谱在低温下制备生物样品以进行形态分析

摘要

该协议提出了为基于同步加速器的X射线吸收光谱实验制备生物冷冻样品的详细程序。我们通过癌症和浮游植物细胞方案的示例描述了优化样品制备和冷冻保存所需的所有步骤。该方法提供了样品冷冻制备的通用标准。

摘要

在研究金属在生物系统中的作用时，用X射线吸收光谱（XAS）研究元素特别有趣。样品制备是一个关键且通常复杂的过程，特别是对于生物样品。虽然X射线形态形成技术被广泛使用，但尚未为该技术的用户传播详细的协议。此外，化学状态修饰是值得关注的，并且建议使用基于冷冻的技术来分析生物样品在其接近天然的水合状态下，以提供细胞或组织化学完整性的最大保存。在这里，我们提出了一种基于冷冻保存样品的细胞制备方案。它在高能分辨率荧光检测的X射线吸收光谱研究中证明了硒在癌细胞中的研究和浮游植物中铁的研究。该协议可与其他生物样品和其他可能被辐照破坏的X射线技术一起使用。

引言

对必需或有毒元素的细胞生物转化的研究需要具有高灵敏度的物种形成技术，并应最大限度地减少通常容易改变化学物质的样品制备步骤。

已知硒和铁等生理元素特别难以形成，因为它们具有复杂的化学性质，硒或铁物种的各种稳定性，以及它们在ppm（mg / kg）甚至亚ppm范围内的低浓度。因此，研究XAS对这些元素的形态可能极具挑战性。同步加速器XAS和特别高能分辨率荧光检测的XAS（HERFD-XAS），允许非常低的信背景比¹，可在同步加速器源上形成复杂生物基质中高度稀释的元素^2，3。传统的荧光XAS测量可以使用能量带宽约为150-250 eV的能量分辨固态探测器（SSD）在欧洲同步辐射设施（ESRF）⁴的CRG-FAME光束线上进行，而HERFD-XAS测量则需要在ESRF²的CRG-FAME-UHD光束线上使用能量带宽约为1-3 eV的晶体分析仪光谱仪（CAS）.荧光光子分别通过电子或光学过程来区分其能量。

样品冷冻制备对于保存结构和维持成分化学完整性至关重要，因此允许分析接近生物天然状态⁵。此外，使用液氦低温冷却（LN₂）在低至10 K的低温下进行的分析允许辐射损伤减缓并保持XAS的元素形态。虽然一些关于应用于生物样品的XAS技术的综述报告了在低温条件下制备和分析样品的必要性（例如Sarret等人⁶，Porcaro等人⁷），但没有一篇明确描述相关的详细方案。在本出版物中，描述了一种用于癌细胞和浮游生物微生物的冷冻制备方法，用于在低温下实现Se⁸ 和Fe⁹ 的HERFD-XAS形态。

在最先进的XAS光谱测量期间，样品制备和环境的良好实践需要1）设置;2）尽可能限制辐射损害影响的分析程序;3）样品（或模型化合物参考）相对于X射线光子光束尺寸尽可能均匀。通过使用液氦低温恒温器在低温下进行采集来考虑第一项。第二项是通过在样品的新区域上执行每次采集来处理的，方法是将其相对于光束移动。最后，考虑到第三个条件，样品（颗粒）和参比物（粉末）在压制的块状颗粒中进行调节，以尽可能限制孔隙率和不均匀性，并避免相对于X射线探测样品表面上的光束尺寸的粗糙度。我们解释了该协议如何处理所有这些要点。

我们利用人前列腺细胞系PC-3（高转移电位）和卵巢细胞系OVCAR-3（占所有卵巢癌病例的70%）来研究硒纳米颗粒（Se-NPs）和 Phaeodactylum tricornutum 硅藻对癌细胞的抗增殖特性，作为研究浮游植物铁螯合的模型物种。

研究方案

1.制备用于硒形态的人类PC-3和OVCAR-3癌细胞颗粒

注:以下协议改编自Weekley等人¹⁰。所有步骤都必须在生物安全2级条件和限制下的细胞培养罩下使用无菌技术进行。

1. 使用马拉塞兹细胞计数室对细胞进行计数。PC-3细胞系的每个烧瓶接种150，000-200，000个细胞，OVCAR-3细胞系接种300，000个细胞。
2. T-75烧瓶中的种子细胞（每种条件下三个烧瓶，以便一式三份）在层流罩下的足够细胞培养基（表1）中。
3. 将细胞培养物留在37°C的培养箱和具有5%CO₂ 的加湿气氛中生长，直到它们达到80%汇合。通常，PC-3前列腺癌细胞系在24小时后翻倍，而OVCAR-3卵巢癌细胞系需要72小时。烧瓶必须留在培养箱中。
4. 同时，将用于治疗的Se-NPs稀释至与MTT（3-（4，5-二甲基噻唑-2-基）-2，5-二苯基溴化四唑）测定预先确定的IC20（抑制浓度达到20%细胞死亡）相对应的最终浓度，以进行细胞毒性评估。这些浓度对每种Se-NPs类型具有特异性，但也对所研究的细胞系具有特异性。
   1. 将纳米颗粒储备溶液（2mg / mL牛血清白蛋白[BSA]或壳聚糖包被的Se-NPs）在室温（RT）下超声水浴中30分钟。
   2. 通过在完整的细胞培养基中连续稀释来稀释Se-NPs溶液以达到工作浓度。每次稀释之间，涡旋1分钟。
5. 用稀释的硒盐准备硒阳性对照进行治疗。
   1. 在15 mL聚丙烯管中制备亚硒酸钠水溶液（1mg / mL）。将1毫克亚硒酸钠粉末与1毫升超纯水混合。
   2. 涡旋储备溶液1分钟。
   3. 通过在完整的细胞培养基中连续稀释亚硒酸钠储备溶液以达到工作浓度来稀释亚硒酸钠储备溶液。
      注意:不要忘记在每次稀释前移液几次，以使溶液均质化。
6. 使癌细胞暴露于硒治疗。
   注意:对于测试的每个纳米颗粒（NP），必须重复协议的这一部分。在这里，NPs有两种类型，BSA和壳聚糖涂层的Se-NPs，以及对照。亚硒酸钠溶液是阳性对照，不治疗是阴性对照。
   1. 打开三个T-75烧瓶，其中包含层流罩中的细胞。
   2. 除去培养基，用5mL加热（37°C）磷酸盐缓冲盐水（PBS）轻轻洗涤细胞2倍。
   3. 轻轻地，在烧瓶的底部而不是直接在细胞层上，使用配备25 mL无菌塑料移液器的自动移液器在每个烧瓶中加入15 mL处理液。将盖子放在烧瓶上。不要紧紧盖住盖子。
      注意:如步骤1.3和1.4所述，处理溶液必须事先重悬才能均质化。
   4. 将三个烧瓶水平放在37°C的培养箱中，并用5%CO₂ 加湿气氛24小时。
7. 细胞沉淀的制备
   1. 直接在T75烧瓶中用5mL加热的PBS（37°C）轻轻洗涤细胞2倍。
   2. 使用装有10 mL无菌塑料移液器的移液器在T-75烧瓶中的细胞层上加入6mL加热的细胞培养基（37°C）。
   3. 使用细胞刮刀轻轻刮取来收集细胞。每个烧瓶使用一个细胞刮刀。
   4. 使用移液器和10 mL移液器，吸出液体并将细胞/培养基冲洗回烧瓶表面，以收集所有细胞。重复此步骤几次以解离和个化细胞。将含有细胞的培养基收集在15mL聚丙烯管中。
   5. 在室温下以250× g 旋转5分钟，吸出上清液。
   6. 通过将细胞重悬于5 mL PBS中来冲洗细胞。
   7. 在室温下以250× g 旋转5分钟，吸出上清液并重复步骤1.6.5和1.6.6 2x以除去所有剩余的治疗痕迹。
   8. 将细胞重悬于1 mL PBS中，并将其转移到1.5 mL聚丙烯管中。最后，在室温下以250× g 旋转5分钟， 图1 表示离心并丢弃上清液后获得的细胞沉淀。
   9. 使用200μL移液管轻轻除去所有PBS上清液。
      注意:注意不要触摸和损坏细胞沉淀。理想情况下，颗粒应为2-3毫米高或厚，直径为3-6毫米。对于PC-3细胞系，测定需要9 x 10⁶–10 x^{10 6} 个细胞。对于OVCAR-3细胞系，需要8 x 10⁶–9 x 10⁶ 个细胞（图1）。在随后的缓冲液冲洗步骤中，一些细胞可能会丢失。细胞数越高，颗粒越好。
8. 细胞沉淀的速冻
   1. 将含有液氮（LN₂）沉淀的1.5mL管的底部跳入到细胞沉淀的水平。
   2. 在用惰性气氛（如氮气）完全吹扫的手套箱中，通过在LN₂冷却铜块的平坦表面上轻轻敲击1.5 mL管来收集细胞沉淀（图2）。然后收集沉淀而不会丢失细胞。
      注意:使用冷冻保护设备、实验室外套、封闭式鞋子、冷冻手套和面罩或安全护目镜进行LN₂ 处理。
   3. 如果需要，可以使用LN₂ 冷却针来帮助取出颗粒。
      注意:所得的冷冻细胞沉淀可以破碎。这些步骤必须在几分钟内完成，并依靠研究人员的灵巧性和速度。
   4. 冷冻的沉淀尺寸必须适合低温恒温器样品架。使用所述设备，如果细胞沉淀高度大于2 mm，并且略小于用于XAS的样品架的孔，则可以直接使用样品。如果没有，或者如果需要用于分析的平坦表面，则必须制备散装圆柱形颗粒，同时仍保持颗粒处于冷冻状态。如果细胞沉淀是碎片的，则以下步骤可以理想地在用惰性气氛完全清除的手套箱中使用。
9. 散装冷冻圆柱形颗粒的制备
   1. 将手动液压机中将与样品接触的所有部件浸入LN₂ 中（图3A;直径3或5 mm的颗粒模具，模具，活塞/拉丝）。
   2. 将快速冷冻的颗粒碎片转移到装有适当颗粒模具的模具中（图3B）。
   3. 使用液压机快速造粒。对于直径为5毫米的颗粒使用1.5吨，对于直径为3毫米的颗粒使用0.5吨就足够了（图3C）。
      注意:在用液压机制备每个颗粒后，所有材料都需要使用氮气解冻并适当干燥，以避免剩余霜冻和湿度的任何问题。
   4. 快速收集冷冻细胞的散装沉淀，并将其置于足够的冷冻管中进行储存。
   5. 将其储存回LN₂ 罐中以长期储存。
   6. 转移并安装冷冻沉淀进行分析。储存在LN₂ 冷却冷冻管中的沉淀被转移到液体N₂ 中的77 K预冷低温恒温器样品架中（图4，用于CRG-FAME-UHD束线）。此步骤应尽快执行，但可能需要几分钟时间。然后将样品架转移到低温恒温器中，并在整个XAS分析期间将其保持在10 K。
      注意:步骤1.9.3和1.9.6很困难，因为它们需要快速完成，以避免形成任何会阻塞活塞和模具的霜冻。另一种方法是在完全用氮气吹扫的塑料帐篷下执行这些步骤。LN₂冷铜质量允许颗粒保持冷冻。

2. 用于铁形态的浮游生物细胞的制备

注:通过添加超纯水海盐，吗啉醇丙烷磺酸，硝酸铵，硝酸钠，偏硅酸钠五水合物，磷酸钠一元，维生素储备，微量金属储备，抗生素储备和HEPES缓冲液，制备用于该方案的合成海水，pH = 7.9。每种组分的浓度在 材料表中标明。有关文化的详细信息可以在Sutak等人^中找到。

1. 将 三角 藻硅藻培养物在50mL聚丙烯管中以1，100× g 离心6分钟，并将沉淀转移到具有新鲜培养基的烧瓶中。
2. 让培养物在生长室中的合成海水中生长24小时。
3. 以1，100× g 离心浮游生物培养物6分钟，并将沉淀转移到含有柠檬酸Fe的新鲜培养基中（最终培养物中为1μM）。孵育72小时。
4. 准备浮游生物细胞
   1. 将细胞以1，100× g 离心3分钟，并用不含铁的培养基冲洗。
   2. 将沉淀转移到1.5mL聚丙烯管中，用超纯水洗涤，并以1，100× g离心2次3分钟。取出上清液。
   3. 如步骤1.8所述，将含有LN₂ 中的沉淀的1.5 mL聚丙烯管的底部浸入。
   4. 将冷冻细胞转移到LN₂ 冷冻模塑机中，并使用XRF沉淀压机（图3 和 图7）快速按压，如步骤1.9中所述。
   5. 取出沉淀并将其储存在LN₂ 罐中以长期储存。
   6. 按照步骤1.9.6（参见 图4 转移到低温恒温器样品架中）。

3. 参比化合物的制备和测定

注:必须通过XAS制备和分析代表物种并预期在生物系统中发现的参考化合物（固体或液体），以便与实验生物样品进行比较。参考光谱也可以在数据库^12、13、14 中找到，并且只要测量条件（例如，光谱分辨率）与实验样品相似，就可以使用。

1. 对于水溶液中的参比物，在厌氧条件或惰性气氛下称量粉末或液体形式的初始化合物。在惰性气氛中（即在厌氧手套箱或舒伦克管路中，参见 图5 和 图6）制备氧化还原敏感的参比物，以避免任何氧化还原反应并保持化合物的化学完整性，该化合物在环境空气中可能具有高反应性和不稳定性。在这里，所有硒参比物都是使用舒伦克线和脱气超纯水制备的（图6）。在环境空气中制备液态^{Fe III-}苹果酸盐和铁蛋白。
2. 与适当的溶液混合，以达到1%重量的最终浓度的研究元素（即硒或铁）以在荧光模式下收集。
   注意:超纯水是制备 XAS 参比物最常用的溶液。使用标准XAS荧光测量的液体需要添加甘油（15%-20%），以防止冰晶X射线衍射产生的伪影，并保持固态检测器收集的XAS信号的质量。然而，对于HERFD-XAS，甘油不是强制性的。使用晶体分析仪光谱仪而不是固态探测器，以极高的分辨率选择能量，并且冰晶引起的衍射不会影响所研究的元素¹的数据收集。
3. 将制备好的溶液保存并储存在密封的舒伦克球囊（图5）或1.5 mL聚丙烯管中，直到在与样品相同的条件下进行测量。
4. 对于固体参考，在环境空气中或手套箱中称量硒或铁模型化合物粉末（如果物质对氧化还原敏感）。在气态N₂手套箱中制备固体Fe^II参比物（Fe^II-醋酸Fe和vivianite），而Fe^III（Fe（OH）₃和Fe^III-磷酸盐）在环境空气中制备。
5. 称取高纯度氮化硼粉末并与模型化合物粉末混合，以达到所研究元素的1%重量终浓度（图7A）。
6. 使用研钵研磨成细粉至少15分钟。
7. 将粉末混合物置于模塑机中以用液压机制备颗粒（图7B，类似于样品颗粒的 图3A ）。
8. 用活塞关闭模塑机（图7C，类似于样品沉淀 图3B ）。
9. 按压获得本体沉淀（图7D，类似于样品沉淀的 图3C ）。
10. 将准备好的散装颗粒储存在手套箱中，直到在与样品相同的条件下对其进行分析。
    注意:例如，散装颗粒有时会粘附在活塞上，具体取决于粉末的兼容性。在不破坏它的情况下轻轻地移除它可能很困难。在这种情况下，必须使用以下使用聚酰亚胺（例如，Kapton）磁盘的过程。
11. 在将与粉末接触的活塞的每一侧滴一滴乙醇（图8A）。
12. 准备两个直径略小于活塞的聚酰亚胺圆盘。聚酰亚胺厚度需要为10-25μm（较薄将难以操纵，较厚将在分析过程中吸收过多的X射线光子）。
13. 将圆盘放在活塞上。它们将通过毛细管作用粘附（图8B）。
14. 用活塞安装模塑机，加入粉末，然后放入第二个活塞（图8C）。
15. 按下（参见步骤3.11）并从活塞中取出压缩的散装颗粒。
    注意:固体参比物可以像样品一样安装在低温恒温器专用样品架上（参见步骤1.8.6）。液体参比物可以安装在低温恒温器专用的样品架上。参见 图9A ，了解CRG-FAME低温恒温器样品架。使用CGR-FAME-UHD样品架（ 如图4D所示）可以使用以下过程应用相同的过程。
16. 将液体参比物安装在低温恒温器样品架上。
    1. 设置聚酰亚胺（例如，Kapton）胶带（25μm厚），以便在RT处密封样品架上孔的一侧（图9B）。
    2. 使用注射器，用溶液缓慢填充腔体，直到它到达顶部。避免气泡。必须填充储液槽（图9C，左）。
    3. 用胶带密封腔体的另一侧（图9C，右）。
    4. 将密封的样品架浸入LN₂ 中（图9D，T₀–T₃）。
    5. 热反应诱导LN₂ 冒泡。等到冒泡停止，发出反应结束的信号（图9D，T_{3-T 5}）。
    6. 在开始数据收集（图9D，T₆）或储存在LN₂ 杜瓦瓶中之前，将77 K的样品架转移到光束线的低温恒温器中。
       注意:冷冻溶液在腔中很好地铺展并形成均匀均匀的颗粒（图9D，T₇）。

4. HERFD-XAS:测量程序

1. 在布拉格条件下，根据感兴趣的荧光线能量优化CAS中的所有晶体。该过程可以用浓缩的参比化合物完成。
2. 使用已知吸收边缘能量位置的参考（通常是纯金属箔）校准入射单色光束能量。该参考可以定位在样品之后的第二步中，以双透射模式，以便能够检查每个获得的光谱的校准并最终在处理后对齐它们。
3. 按照步骤1.9.6中描述的适当步骤将样品置于用于生物样品的液氦低温恒温器中。
4. 按照同步加速器安全规则关闭实验小屋。
5. 在覆盖所选吸收边缘的能量范围内执行 XAS 采集。
6. 每次光谱采集后，在开始新的采集之前，在运动方向上移动至少两倍的光束尺寸。
   注意:在本例中，使用Ge（440）晶体选择Fe K_a1 线并使用Ge（844）晶体选择Se K_a1 线进行测量。样品上的光束尺寸为200 x 100 μm²（H x V全宽半最大值）。每次采集之间的样品运动在两个方向上为500μm，以便探测结构均匀性并分析每次都没有以前可能的辐射损伤的新区域。如果单个光谱在噪声中可叠加，则对其进行比较和合并。当合并光谱的质量正确时，给定样品的测量将停止。然后，可以使用任何专用于XAS分析的软件进行数据分析，特别是那些允许归一化光谱的线性组合拟合的软件，例如雅典娜和Artemis（Demeter软件组）¹⁵，SixPack¹⁶或Viper¹⁷。XAS分析的完整和详细的解释不属于本方案的范围，可以在最近的论文^18，19中找到，其中一些更具体地致力于生物样品²⁰。硒XANES参考光谱已经收集在SSHADE光谱数据库²¹中。

结果

这些制剂的主要目的是研究硒纳米颗粒（Se-NPs）与癌细胞之间的相互作用，以及浮游植物中的铁结合和封存。

在初始状态（BSA Se-NPs）和在营养培养基中孵育的细胞（BSA Se-NPs）中孵育的硒的HERFD-XANES光谱如图 10所示。结果表明， 初始Se-NPs中的硒同时以Se^（0） 和亚硒酸盐样形式存在， 而与PC-3细胞相互作用后， 细胞中的硒主要以Se^{（0）的形式<...}

讨论

该方案用于通过X射线吸收光谱研究生物样品中硒和铁的化学形式。它侧重于生物样品和参比化合物的冷冻制备和储存，以及HERFD-XAS的测量。

冷冻制备和储存
散装生物样品颗粒的冷冻制备可以保留样品中存在的物质的化学完整性。这是至关重要的，因为在使用冷冻干燥或空气干燥制备⁶时已经观察到形态变化。一旦选择用于测量的光束线配备了...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Ammonium nitrate	Sigma-Aldrich	A3795	NH4NO3, 2.66 mg/L of milliQ water
Anaerobic chamber	Coy Laboratory, USA		equipped with Anaerobic Monitor (CAM-12)
Antibiotic stock	Sigma-Aldrich	A0166 for ampicillin, S9137 for streptomycin sulfate	1 mL/L of milliQ water (ampicillin sodium and streptomycin sulfate, 100 mg/mL)
Boron nitride powder	Sigma-Aldrich	255475
Cell counting chamber			Neubauer or Malassez
Cell scraper
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (DPBS)	GIBCO	14190-094	Without Calcium, Magnesium, Phenol Red
Eppendorf tubes			0.5 mL and 1.5 mL
Falcon tubes			15 mL and 50 mL
Ferric citrate Fe/citrate = 1/20	Sigma-Aldrich	F3388	aqueous solution of FeCl3 50 mM and Na-citrate 1M pH 6.5
Fetal Bovine Serum	GIBCO	A31604-02	Performance Plus, certified One Shot format, US origin
Flasks	Sigma-Aldrich	Z707503	TPP 150 cm2 area
Growth chamber	Sanyo	Sanyo MLR-352	at 20 °C and under a 12:12 light (3,000 lux) dark regime
HEPES buffer	Sigma-Aldrich	H4034	1 g/L of milliQ water HEPES
High grade serous, OVCAR-3	ATCC, Rockville, MD	HTB-161	Storage temperature: liquid nitrogen vapor temperature
Incubator			Incubator at 37°C, humidified atmosphere with 5% CO2
Insulin solution from bovine pancreas	Sigma-Aldrich	I0516	10 mg/mL insulin in 25mM HEPES, pH 8.2, BioReagent, sterile-filtered, suitable for cell culture
Manual hydraulic press	Specac, USA
Marine diatom Phaeodactylum tricornutum	Roscoff culture collection	RCC69	http://roscoff-culture-collection.org/rcc-strain-details/69
Morpholinepropanesulfonic acid	Sigma-Aldrich	M3183	MOPS, 250 mg/L of milliQ water (pH 7.3)
Optical microscope
PC-3	ECCAC, Salisbury, UK	90112714	Storage temperature: liquid nitrogen vapor temperature
Penicillin-Streptomycin	Sigma-Aldrich	P4333	Solution stabilized, with 10,000 units penicillin and 10 mg streptomycin/mL, sterile-filtered, BioReagent, suitable for cell culture
Pipette-boy			25mL-, 10mL-, and 5mL sterile plastic-pipettes
Plankton culture products, Mf medium: Sea salts	Sigma-Aldrich	S9883	40g/L of milliQ water. Composition: Cl- 19.29 g, Na+ 10.78 g, SO42- 2.66 g, Mg2+ 1.32 g, K+ 420 mg, Ca2+ 400 mg, CO32- /HCO3- 200 mg, Sr2+ 8.8 mg, BO2- 5.6 mg, Br- 56 mg, I- 0.24 mg, Li+ 0.3 mg, F- 1 mg
Plastic tweezers	Oxford Instrument	AGT 5230
RPMI MEDIUM 1640 (ATCC Modification)	GIBCO	A10491-01	Solution with 4.5 g/L D-glucose, 1.5 g/L Sodium Bicarbonate, 110 mg/L (1 mM) Sodium Pyruvate, 2.388 g/L (10 mM) HEPES buffer and 300 mg/L L-glutamine for research use
Selenium nanoparticles (Se-NPs), BSA coated, 2 mg/mL	NANOCS Company, USA	Se50-BS-1	BSA stabilized Se-NPs solution. Average size about 30 nm. Stored at 4°C in the dark, protected from the light.
Selenium nanoparticles (Se-NPs), Chitosan coated, 2 mg/mL	NANOCS Company, USA	11. Se50-CS-1	Chitosan stabilized Se-NPs solution. Average size about 30 nm. Stored at 4°C in the dark, protected from the light.
Sodium metasilicate pentahydrate	Sigma-Aldrich	71746	Na2SiO3.5H2O, 22.8 mg/L of milliQ water
Sodium nitrate	Sigma-Aldrich	S5022	NaNO3, 75 mg/L of milliQ water
Sodium phosphate monobasic	Sigma-Aldrich	S5011	NaH2PO4, 15 mg/L of milliQ water
T-75 flasks
Tissue culture hood
Trace metal stock	Sigma-Aldrich	M5005, Z1001, M1651, C2911, 450243, 451193, 229857	1 mL/L of milliQ water (MnCl2.4H2O 200 mg/L, ZnSO4.7H2O 40 mg/L, Na2MoO4.2H2O 20mg/L, CoCl2.6H2O 14 mg/L, Na3VO4.nH2O 10 mg/L, NiCl2 10 mg/L, H2SeO3 10 mg/L)
Trypan Blue Solution (0.4%)	GIBCO	15250061
Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red	GIBCO	25300-054
Vitamin stock	Sigma-Aldrich	T1270 for thiamine, B4639 for biotin, V6629 for B12	1 mL/L of milliQ water (thiamine HCl 20 mg/L, biotin 1 mg/L, B12 1 mg/L)
Water bath 37°C