Preparazione di campioni biologici per la speciazione a temperatura criogenica mediante spettroscopia di assorbimento a raggi X ad alta risoluzione

Riepilogo

Questo protocollo presenta una procedura dettagliata per preparare criocampioni biologici per esperimenti di spettroscopia di assorbimento dei raggi X basati su sincrotrone. Descriviamo tutti i passaggi necessari per ottimizzare la preparazione del campione e la crioconservazione con esempi del protocollo con cellule tumorali e fitoplancton. Questo metodo fornisce uno standard universale di crio-preparazione del campione.

Abstract

Lo studio degli elementi con spettroscopia di assorbimento dei raggi X (XAS) è di particolare interesse quando si studia il ruolo dei metalli nei sistemi biologici. La preparazione dei campioni è una procedura chiave e spesso complessa, in particolare per i campioni biologici. Sebbene le tecniche di speciazione a raggi X siano ampiamente utilizzate, nessun protocollo dettagliato è stato ancora diffuso per gli utenti della tecnica. Inoltre, la modifica dello stato chimico è preoccupante e si raccomandano tecniche basate sulla criografia per analizzare i campioni biologici nel loro stato idrato quasi nativo per fornire la massima conservazione dell'integrità chimica delle cellule o dei tessuti. Qui, proponiamo un protocollo di preparazione cellulare basato su campioni crioconservati. È dimostrato in uno studio di spettroscopia di assorbimento a raggi X rilevato ad alta risoluzione energetica con fluorescenza del selenio nelle cellule tumorali e in uno studio sul ferro nel fitoplancton. Questo protocollo può essere utilizzato con altri campioni biologici e altre tecniche a raggi X che possono essere danneggiate dall'irradiazione.

Introduzione

Lo studio delle biotrasformazioni cellulari di elementi essenziali o tossici richiede tecniche di speciazione ad alta sensibilità e dovrebbe ridurre al minimo le fasi di preparazione del campione che sono spesso inclini alla modifica di specie chimiche.

Elementi fisiologici come il selenio e il ferro sono noti per essere particolarmente difficili da speciare a causa della loro chimica complessa, delle varie stabilità delle specie di selenio o ferro e della loro bassa concentrazione nell'intervallo ppm (mg / kg) o anche sub-ppm. Pertanto, lo studio della speciazione di questi elementi da parte di XAS può essere estremamente impegnativo. Il sincrotrone XAS e in particolare l'XAS di fluorescenza ad alta risoluzione energetica (HERFD-XAS), che consente un rapporto segnale-sfondo^{molto basso 1}, sono disponibili presso sorgenti di sincrotrone per speciare elementi altamente diluiti in matrici biologiche complesse ^2,3. Le misurazioni convenzionali di fluorescenza-XAS possono essere eseguite utilizzando un rivelatore a stato solido (SSD) a risoluzione di energia con una larghezza di banda di energia ~ 150-250 eV, sulla beamline CRG-FAME presso l'European Synchrotron Radiation Facility (ESRF)⁴, mentre le misurazioni HERFD-XAS richiedono uno spettrometro analizzatore di cristalli (CAS), con una larghezza di banda di energia ~ 1-3 eV, sulla beamline CRG-FAME-UHD presso l'ESRF² . I fotoni a fluorescenza sono discriminati rispetto alla loro energia rispettivamente con processi elettronici o ottici.

La crio-preparazione del campione è essenziale per preservare le strutture e mantenere l'integrità chimica compositiva, consentendo così un'analisi vicina allo stato biologico nativo⁵. Inoltre, le analisi eseguite a temperature criogeniche fino a 10 K utilizzando il raffreddamento criogenico ad elio liquido (LN₂), consentono ai danni da radiazioni di rallentare e preservare la speciazione elementare per XAS. Sebbene alcune revisioni sulle tecniche XAS applicate ai campioni biologici riportino la necessità di preparare e analizzare campioni in condizioni criogeniche (ad esempio, Sarret et ^al.6, Porcaro et ^al.7), nessuna di esse descrive chiaramente il relativo protocollo dettagliato. In questa pubblicazione, viene descritto un metodo per la crio-preparazione delle cellule tumorali e dei microrganismi plancton per la speciazione HERFD-XAS di Se⁸ e Fe⁹ a temperatura criogenica.

Le buone pratiche per la preparazione dei campioni e l'ambiente durante le misurazioni della spettroscopia XAS all'avanguardia richiedono 1) una configurazione; 2) una procedura di analisi che limiti il più possibile gli effetti dei danni da radiazioni; e 3) un campione (o modello di riferimento composto) il più omogeneo possibile rispetto alla dimensione del fascio di fotoni a raggi X. Il primo elemento viene preso in considerazione eseguendo l'acquisizione a bassa temperatura, utilizzando un criostato di elio liquido. Il secondo punto viene affrontato eseguendo ogni acquisizione su una nuova area del campione spostandolo rispetto alla trave. Infine, considerando la terza condizione, i campioni (pellet) e i riferimenti (polveri) sono condizionati in pellet sfusi pressati al fine di limitare il più possibile porosità e disomogeneità ed evitare rugosità rispetto alla dimensione del fascio sulla superficie del campione sondato a raggi X. Spieghiamo come il protocollo affronta tutti questi punti.

Abbiamo utilizzato la linea cellulare della prostata umana PC-3 (alto potenziale metastatico) e la linea cellulare ovarica OVCAR-3 (che rappresenta fino al 70% di tutti i casi di cancro ovarico) per studiare le proprietà antiproliferative verso le cellule tumorali delle nanoparticelle di selenio (Se-NP) e la diatomea Phaeodactylum tricornutum come specie modello per studiare il sequestro del ferro nel fitoplancton.

Protocollo

1. Preparazione dei pellet di cellule tumorali umane PC-3 e OVCAR-3 per la speciazione del selenio

NOTA: Il seguente protocollo è adattato da Weekley et ^al.10. Tutte le fasi devono essere eseguite sotto una cappa di coltura cellulare in condizioni e restrizioni di livello di biosicurezza 2, utilizzando tecniche asettiche.

1. Contare le cellule usando una camera di conteggio delle cellule Malassez. Seminare 150.000-200.000 cellule per pallone per la linea cellulare PC-3 e 300.000 cellule per la linea cellulare OVCAR-3.
2. Cellule di semi in palloni T-75 (tre palloni per condizione per avere triplicati) nel terreno di coltura cellulare adeguato (tabella 1) sotto la cappa a flusso laminare.
3. Lasciare crescere le colture cellulari in un incubatore a 37 °C e in un'atmosfera umidificata con il 5% di CO₂ fino a raggiungere l'80% di confluenza. Di solito, le linee cellulari di cancro alla prostata PC-3 raddoppiano dopo 24 ore mentre le linee cellulari di cancro ovarico OVCAR-3 impiegano 72 ore. I palloni devono essere lasciati nell'incubatrice.
4. Nel frattempo, diluire i Se-NP utilizzati per il trattamento a una concentrazione finale che corrisponde all'IC20 (concentrazione inibitoria per raggiungere il 20% di morte cellulare) che è stata predeterminata dal test MTT (3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolio bromuro) per la valutazione della citotossicità. Queste concentrazioni sono specifiche per ogni tipo di Se-NP, ma anche specifiche per la linea cellulare studiata.
   1. Posizionare la soluzione madre di nanoparticelle (2 mg/mL di albumina sierica bovina [BSA] o Se-NP rivestita di chitosano) in un bagno d'acqua ad ultrasuoni per 30 minuti a temperatura ambiente (RT).
   2. Diluire la soluzione Se-NP mediante diluizioni seriali in terreno di coltura cellulare completo per raggiungere le concentrazioni di lavoro. Tra ogni diluizione, vortice per 1 min.
5. Preparare un controllo positivo al selenio con sale di selenio diluito per il trattamento.
   1. Preparare una soluzione madre acquosa di selenito di sodio (1 mg/mL) in un tubo di polipropilene da 15 mL. Mescolare 1 mg di polvere di selenito di sodio con 1 mL di acqua ultrapura.
   2. Vortice la soluzione madre per 1 min.
   3. Diluire la soluzione madre di selenito di sodio mediante diluizioni seriali in terreno di coltura cellulare completo per raggiungere le concentrazioni di lavoro.
      NOTA: Non dimenticare di pipettare più volte prima di ogni diluizione per omogeneizzare la soluzione.
6. Esporre le cellule tumorali ai trattamenti con selenio.
   NOTA: Questa parte del protocollo deve essere ripetuta per ogni nanoparticella (NP) testata. Qui, le NP sono di due tipi, BSA e Se-NP rivestite di chitosano, oltre ai controlli. La soluzione di selenito di sodio è il controllo positivo e nessun trattamento è il controllo negativo.
   1. Aprire i tre palloni T-75 contenenti le celle nella cappa a flusso laminare.
   2. Rimuovere il mezzo e lavare delicatamente le cellule 2 volte con 5 mL di soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) riscaldata (37 °C).
   3. Delicatamente, sul lato inferiore del pallone e non direttamente sullo strato cellulare, aggiungere 15 mL di trattamento in ciascun matraccio utilizzando una pipetta automatica dotata di pipette di plastica sterili da 25 mL. Posizionare i coperchi sui palloni. Non chiudere bene i coperchi.
      NOTA: Come descritto nei passaggi 1.3 e 1.4, le soluzioni di trattamento devono essere state precedentemente risospese per essere omogeneizzate.
   4. Lasciare i tre palloni orizzontalmente in un incubatore a 37 °C e un'atmosfera umidificata con il 5% di CO₂ per 24 ore.
7. Preparazione dei pellet di cella
   1. Lavare delicatamente le celle 2x con 5 mL di PBS riscaldato (37 °C) direttamente nei palloni T75.
   2. Aggiungere 6 mL di terreno di coltura cellulare riscaldato (37 °C) sullo strato cellulare nel matraccio T-75 utilizzando un pipetta boy dotato di pipette di plastica sterili da 10 mL.
   3. Raccogliere le cellule raschiando delicatamente usando un raschietto cellulare. Utilizzare un raschietto cellulare per pallone.
   4. Utilizzando un pipetta boy e una pipetta da 10 ml, aspirare il liquido e riportare la cella/mezzo sulla superficie del pallone per raccogliere tutte le cellule. Ripetere questo passaggio più volte per dissociare e individualizzare le cellule. Raccogliere il mezzo contenente le cellule in un tubo di polipropilene da 15 ml.
   5. Spin down a 250 x g per 5 minuti a RT. Aspirare il surnatante.
   6. Risciacquare le cellule rieseguendole in 5 ml di PBS.
   7. Girare verso il basso a 250 x g per 5 minuti a RT. Aspirare il surnatante e ripetere i passaggi 1.6.5 e 1.6.6 2x per eliminare tutte le tracce rimanenti del trattamento.
   8. Risospesciare le celle in 1 mL di PBS e trasferirle in un tubo di polipropilene da 1,5 mL. Infine, spinli verso il basso a 250 x g per 5 minuti a RT. La Figura 1 rappresenta il pellet cellulare ottenuto dopo la centrifugazione e lo scarto del surnatante.
   9. Rimuovere delicatamente tutto il surnatante PBS utilizzando una pipetta da 200 μL.
      NOTA: Fare attenzione a non toccare e danneggiare il pellet cellulare. Idealmente, il pellet dovrebbe essere alto o spesso 2-3 mm, con un diametro di 3-6 mm. Per la linea cellulare PC-3, per il test sono necessarie 9 x 10^6-10 x 10⁶ cellule. Per la linea cellulare OVCAR-3 sono necessarie 8 x 10⁶–9 x 10⁶ celle (Figura 1). Alcune cellule andranno probabilmente perse durante le successive fasi di risciacquo del tampone. Più alto è il numero di celle, migliore sarà il pellet.
8. Flash-congelamento dei pellet cellulari
   1. Immergere la parte inferiore del tubo da 1,5 mL contenente il pellet in azoto liquido (LN₂) al livello del pellet della cella.
   2. In un vano portaoggetti completamente spurgato con un'atmosfera inerte come il gas di azoto, raccogliere il pellet della cella picchiettando delicatamente il tubo da 1,5 ml sulla superficie piana di un blocco di rame raffreddato a_{LN 2} (Figura 2). Il pellet viene quindi raccolto senza perdita di cellule.
      NOTA: utilizzare attrezzature per la crioprotezione, camice da laboratorio, scarpe chiuse, guanti crio-gloves e una visiera o occhiali di sicurezza per la manipolazione LN₂ .
   3. Se necessario, un ago raffreddato LN₂ può essere utilizzato per aiutare a estrarre il pellet.
      NOTA: il pellet cellulare congelato risultante può frammentarsi. Questi passaggi devono essere eseguiti nello spazio di pochi minuti e si basano sulla destrezza e la velocità del ricercatore.
   4. Le dimensioni del pellet congelato devono adattarsi al portacampioni criostato. Utilizzando l'apparecchiatura descritta, se il pellet di cella è più grande di 2 mm di altezza e leggermente più piccolo del foro del portacampioni utilizzato per XAS, il campione può essere utilizzato direttamente. In caso contrario, o se si desidera una superficie piana per l'analisi, è necessario preparare un pellet cilindrico sfuso, mantenendo comunque il pellet allo stato congelato. Se il pellet cellulare è frammentato, i seguenti passaggi possono essere utilizzati idealmente in un vano portaoggetti completamente spurgato con un'atmosfera inerte.
9. Preparazione dei pellet cilindrici congelati alla rinfusa
   1. Immergere tutte le parti di una pressa idraulica manuale che saranno a contatto con il campione in LN₂ (Figura 3A; stampi per pellet da 3 o 5 mm di diametro, stampo, trazione pistone/filo).
   2. Trasferire i frammenti di pellet rapidamente congelati nello stampo caricato con gli stampi per pellet appropriati (Figura 3B).
   3. Pellettizzazione rapida con la pressa idraulica. L'uso di 1,5 tonnellate per un pellet di 5 mm di diametro o 0,5 tonnellate per un pellet di 3 mm di diametro è sufficiente (Figura 3C).
      NOTA: Dopo ogni preparazione del pellet con la pressa idraulica, tutti i materiali devono essere scongelati ed asciugati correttamente utilizzando gas azoto per evitare problemi con il gelo e l'umidità rimanenti.
   4. Raccogliere rapidamente il pellet sfuso di cellule congelate e posizionarlo in un criotubo adeguato per la conservazione.
   5. Conservalo di nuovo nel serbatoio LN₂ per lo stoccaggio a lungo termine.
   6. Trasferire e montare i crio-pellet per l'analisi. Il pellet immagazzinato in un criotubo raffreddato LN₂ viene trasferito a un portacampioni criostato preraffreddato da 77 K nel liquido N₂ (Figura 4, come utilizzato per una beamline CRG-FAME-UHD). Questo passaggio deve essere eseguito il più rapidamente possibile, ma può richiedere alcuni minuti. Quindi trasferire il portacampioni al criostato e mantenerlo a 10 K durante l'intera analisi XAS.
      NOTA: I passaggi 1.9.3 e 1.9.6 sono difficili perché devono essere eseguiti rapidamente per evitare qualsiasi formazione di brina che bloccherà il pistone e lo stampo. Un'alternativa è eseguire questi passaggi sotto una tenda di plastica completamente spurgata con azoto gassoso. La massa di rame LN_2-cool consente di mantenere il pellet congelato.

2. Preparazione delle celle di plancton per la speciazione del ferro

NOTA: L'acqua di mare sintetica utilizzata per questo protocollo è stata preparata aggiungendo sali marini di acqua ultrapura, acido morfolino propanosolfonico, nitrato di ammonio, nitrato di sodio, metasilicato di sodio pentaidrato, fosfato di sodio monobasico, stock di vitamine, stock di metalli in traccia, stock di antibiotici e tampone HEPES a pH = 7,9. Le concentrazioni di ciascun componente sono indicate nella Tabella dei Materiali. Dettagli sulla cultura possono essere trovati in Sutak et ^al.11

1. Centrifugare una coltura di diatomee di P. tricornutum in un tubo di polipropilene da 50 ml a 1.100 x g per 6 minuti e trasferire il pellet in un matraccio con mezzo fresco.
2. Lascia che la coltura cresca in acqua di mare sintetica in una camera di crescita per 24 ore.
3. Centrifugare la coltura di plancton per 6 min a 1.100 x g e trasferire il pellet in mezzo fresco contenente Fe-citrato (1 μM nella coltura finale). Incubare per 72 h.
4. Preparare le cellule di plancton
   1. Centrifugare le celle per 3 min a 1.100 x g e risciacquare con mezzo senza ferro.
   2. Trasferire il pellet in un tubo di polipropilene da 1,5 mL, lavare con acqua ultrapura e centrifugare 2 volte per 3 minuti a 1.100 x g. Rimuovere il surnatante.
   3. Immergere la parte inferiore del tubo di polipropilene da 1,5 mL contenente il pellet in LN₂ come descritto al punto 1.8.
   4. Trasferire le celle congelate in uno stampatore congelato LN₂ e premere rapidamente utilizzando una pressa per pellet XRF (Figura 3 e Figura 7) come descritto nel passaggio 1.9.
   5. Rimuovere il pellet e conservarlo in un serbatoio LN₂ per la conservazione a lungo termine.
   6. Seguire il passaggio 1.9.6 (vedere la Figura 4 per il trasferimento nel portacampioni criostatico).

3. Preparazione e misurazione dei composti di riferimento

NOTA: I composti di riferimento (solidi o liquidi) rappresentativi della specie e che si prevede si trovino nel sistema biologico devono essere preparati e analizzati da XAS per il confronto con campioni biologici sperimentali. Gli spettri di riferimento possono essere trovati anche nei database 12,13,14 e possono essere utilizzati a condizione che le condizioni di misurazione (ad esempio, la risoluzione spettrale) fossero simili ai campioni sperimentali.

1. Per i riferimenti in soluzione acquosa, pesare i composti iniziali in polvere o in forma liquida in condizioni anaerobiche o in atmosfera inerte. Preparare riferimenti sensibili al redox in un'atmosfera inerte (cioè in un vano portaoggetti anaerobico o in una linea di Schlenk, vedere Figura 5 e Figura 6) per evitare qualsiasi reazione ossidativa e per preservare l'integrità chimica del composto, che può essere altamente reattivo e instabile nell'aria ambiente). Qui, tutti i riferimenti al selenio sono stati preparati utilizzando una linea Schlenk e acqua ultrapura degassata (Figura 6). Il Fe^III-malato liquido e la ferritina sono stati preparati all'aria ambiente.
2. Miscelare con la soluzione appropriata per raggiungere una concentrazione finale dell'1% in peso dell'elemento studiato (cioè selenio o ferro) per la raccolta in modalità di fluorescenza.
   NOTA: l'acqua ultrapura è la soluzione più utilizzata per preparare i riferimenti XAS. L'aggiunta di glicerolo (15%-20%) è necessaria per i liquidi misurati utilizzando la fluorescenza XAS standard per prevenire artefatti derivanti dalla diffrazione a raggi X da parte dei cristalli di ghiaccio e preservare la qualità del segnale XAS raccolto con il rivelatore a stato solido. Tuttavia, per HERFD-XAS, il glicerolo non è obbligatorio. Utilizzando uno spettrometro analizzatore di cristalli al posto di un rivelatore a stato solido, l'energia viene selezionata con una risoluzione estremamente elevata e la diffrazione indotta dai cristalli di ghiaccio non influisce sulla raccolta dei dati dell'elemento¹ studiato.
3. Conservare e conservare la soluzione preparata in un palloncino Schlenk sigillato (Figura 5) o in un tubo di polipropilene da 1,5 ml fino alla misurazione nelle stesse condizioni dei campioni.
4. Per i riferimenti solidi, pesare le polveri composte modello di selenio o ferro all'aria ambiente o in un vano portaoggetti se le specie sono sensibili al redox. Qui, i riferimenti solidi di Fe^II (Fe^II-acetato e vivianite) sono stati preparati in un vano portaoggetti N₂ gassoso mentre Fe^III (Fe (OH) ₃ e Fe^III-fosfato) sono stati preparati all'aria ambiente.
5. Pesare polvere di nitruro di boro ad alta purezza e mescolare con le polveri dei composti modello per raggiungere una concentrazione finale dell'1% wt dell'elemento studiato (Figura 7A).
6. Macinare in polvere fine usando una malta per almeno 15 minuti.
7. Posizionare la miscela di polvere nello stampo per preparare i pellet con la pressa idraulica (Figura 7B, simile alla Figura 3A per il pellet campione).
8. Chiudere lo stampo con il pistone (Figura 7C, simile alla Figura 3B per il pellet campione).
9. Premere per ottenere il pellet sfuso (Figura 7D, simile alla Figura 3C per il pellet campione).
10. Conservare i pellet sfusi preparati nel vano portaoggetti fino a quando non vengono analizzati nelle stesse condizioni dei campioni.
    NOTA: il pellet sfuso a volte si attacca ai pistoni, ad esempio a seconda della compatibilità della polvere. Rimuoverlo delicatamente senza romperlo quindi può essere difficile. In tal caso, è necessario utilizzare la seguente procedura utilizzando dischi di poliimmide (ad esempio, Kapton).
11. Mettere una goccia di etanolo su ciascun lato dei pistoni che saranno a contatto con la polvere (Figura 8A).
12. Preparare due dischi di poliimmide con un diametro leggermente inferiore ai pistoni. Lo spessore della poliimmide deve essere di 10-25 μm (più sottile sarà difficile da manipolare, più spesso assorbirà troppo dei fotoni a raggi X durante l'analisi).
13. Metti i dischi sui pistoni. Si attaccheranno per azione capillare (Figura 8B).
14. Montare lo stampo con il pistone, aggiungere la polvere e inserire il secondo pistone (Figura 8C).
15. Premere (vedere punto 3.11) e rimuovere il pellet sfuso compresso dai pistoni.
    NOTA: i riferimenti solidi possono essere montati sul portacampioni specifico del criostato come i campioni (vedere il punto 1.8.6). I riferimenti liquidi possono essere montati sul portacampioni specifico per criostato. Vedere la Figura 9A per un portacampioni criostatico CRG-FAME. La stessa procedura può essere applicata utilizzando un portacampioni CRG-FAME-UHD, mostrato in Figura 4D, utilizzando la seguente procedura.
16. Montaggio del riferimento liquido sul portacampioni criostato.
    1. Impostare il nastro in poliimmide (ad esempio, Kapton) (spessore 25 μm) per sigillare un lato del foro sul portacampioni a RT (Figura 9B).
    2. Usando una siringa, riempire lentamente la cavità con la soluzione fino a raggiungere la parte superiore. Evita le bolle. Il serbatoio deve essere riempito (Figura 9C, a sinistra).
    3. Sigillare l'altro lato della cavità con il nastro (Figura 9C, a destra).
    4. Immergere il portacampioni sigillato in LN₂ (Figura 9D, T₀–T₃).
    5. Una reazione termica induce LN₂ gorgogliante. Attendere che il gorgogliamento si fermi, segnalando la fine della reazione (Figura 9D, T_{3-T 5}).
    6. Trasferire il portacampioni a 77 K nel criostato della beamline prima di iniziare la raccolta dei dati (Figura 9D, T₆) o la memorizzazione nel Dewar LN₂ .
       NOTA: La soluzione congelata è ben distribuita nella cavità e forma un pellet uniforme e omogeneo (Figura 9D, T₇).

4. HERFD-XAS: procedura di misurazione

1. Ottimizzare tutti i cristalli del CAS in condizioni di Bragg rispetto all'energia della linea di fluorescenza di interesse. Questa procedura può essere eseguita con un composto di riferimento concentrato.
2. Calibrare l'energia del fascio monocromatico incidente utilizzando un riferimento per il quale è nota la posizione energetica del bordo di assorbimento (tipicamente una lamina metallica pura). Questo riferimento può essere posizionato in una seconda fase dopo il campione, in modalità a doppia trasmissione, in modo da poter verificare la calibrazione per ogni spettro ottenuto ed eventualmente allinearli post-trattamento.
3. Posizionare il campione in un criostato ad elio liquido per campioni biologici seguendo la procedura appropriata descritta al punto 1.9.6.
4. Chiudere la gabbia sperimentale seguendo le regole di sicurezza del sincrotrone.
5. Eseguire l'acquisizione XAS su un intervallo di energia che copre il bordo di assorbimento selezionato.
6. Dopo ogni acquisizione spettrale, spostare il campione di almeno il doppio della dimensione del fascio nella direzione del movimento prima di iniziare una nuova acquisizione.
   NOTA: In questo caso, le misurazioni sono state eseguite utilizzando cristalli Ge(440) per selezionare la linea Fe K_a1 e utilizzando cristalli Ge(844) per selezionare la linea Se K_a1. La dimensione del fascio sul campione era di 200 x 100 μm² (H x V Full Width Half Maximum). Il movimento del campione tra ogni acquisizione era di 500 μm in entrambe le direzioni, al fine di sondare l'omogeneità strutturale e analizzare ogni volta una nuova area libera da precedenti possibili danni da radiazioni. I singoli spettri vengono confrontati e uniti se sono sovrapponibili all'interno del rumore. La misurazione viene interrotta per un determinato campione quando la qualità dello spettro unito è corretta. Quindi l'analisi dei dati può essere eseguita utilizzando qualsiasi software dedicato all'analisi XAS, in particolare quelli che consentono un adattamento combinato lineare di spettri normalizzati, ad esempio Athena e Artemis (gruppo di software Demeter)¹⁵, SixPack¹⁶ o Viper¹⁷. Spiegazioni complete e dettagliate dell'analisi XAS non rientrano nell'ambito di questo protocollo e possono essere trovate in recenti articoli^18,19, alcuni dei quali più specificamente dedicati ai campioni biologici²⁰. Gli spettri di riferimento del selenio XANES sono già raccolti nel database degli spettri SSHADE²¹.

Risultati

Gli obiettivi principali di questi preparati erano studiare l'interazione tra nanoparticelle di selenio (Se-NP) e cellule tumorali e il legame e il sequestro del ferro nel fitoplancton.

Gli spettri HERFD-XANES del selenio allo stato iniziale (BSA Se-NPs) e nelle cellule incubate in mezzo nutritivo (BSA Se-NPs dopo 24 ore di incubazione) sono mostrati nella Figura 10. I risultati hanno mostrato che il selenio nelle Se-NP iniziali era presente sia come se⁽⁰⁾

Discussione

Questo protocollo è stato utilizzato per studiare la forma chimica del selenio e del ferro in campioni biologici mediante spettroscopia di assorbimento dei raggi X. Si concentra sulla crio-preparazione e conservazione di campioni biologici e composti di riferimento, nonché sulle misurazioni HERFD-XAS.

Crio-preparazione e conservazione
La crio-preparazione dei pellet di campioni biologici sfusi consente di preservare l'integrità chimica delle specie presenti nei campioni....

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Ammonium nitrate	Sigma-Aldrich	A3795	NH4NO3, 2.66 mg/L of milliQ water
Anaerobic chamber	Coy Laboratory, USA		equipped with Anaerobic Monitor (CAM-12)
Antibiotic stock	Sigma-Aldrich	A0166 for ampicillin, S9137 for streptomycin sulfate	1 mL/L of milliQ water (ampicillin sodium and streptomycin sulfate, 100 mg/mL)
Boron nitride powder	Sigma-Aldrich	255475
Cell counting chamber			Neubauer or Malassez
Cell scraper
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (DPBS)	GIBCO	14190-094	Without Calcium, Magnesium, Phenol Red
Eppendorf tubes			0.5 mL and 1.5 mL
Falcon tubes			15 mL and 50 mL
Ferric citrate Fe/citrate = 1/20	Sigma-Aldrich	F3388	aqueous solution of FeCl3 50 mM and Na-citrate 1M pH 6.5
Fetal Bovine Serum	GIBCO	A31604-02	Performance Plus, certified One Shot format, US origin
Flasks	Sigma-Aldrich	Z707503	TPP 150 cm2 area
Growth chamber	Sanyo	Sanyo MLR-352	at 20 °C and under a 12:12 light (3,000 lux) dark regime
HEPES buffer	Sigma-Aldrich	H4034	1 g/L of milliQ water HEPES
High grade serous, OVCAR-3	ATCC, Rockville, MD	HTB-161	Storage temperature: liquid nitrogen vapor temperature
Incubator			Incubator at 37°C, humidified atmosphere with 5% CO2
Insulin solution from bovine pancreas	Sigma-Aldrich	I0516	10 mg/mL insulin in 25mM HEPES, pH 8.2, BioReagent, sterile-filtered, suitable for cell culture
Manual hydraulic press	Specac, USA
Marine diatom Phaeodactylum tricornutum	Roscoff culture collection	RCC69	http://roscoff-culture-collection.org/rcc-strain-details/69
Morpholinepropanesulfonic acid	Sigma-Aldrich	M3183	MOPS, 250 mg/L of milliQ water (pH 7.3)
Optical microscope
PC-3	ECCAC, Salisbury, UK	90112714	Storage temperature: liquid nitrogen vapor temperature
Penicillin-Streptomycin	Sigma-Aldrich	P4333	Solution stabilized, with 10,000 units penicillin and 10 mg streptomycin/mL, sterile-filtered, BioReagent, suitable for cell culture
Pipette-boy			25mL-, 10mL-, and 5mL sterile plastic-pipettes
Plankton culture products, Mf medium: Sea salts	Sigma-Aldrich	S9883	40g/L of milliQ water. Composition: Cl- 19.29 g, Na+ 10.78 g, SO42- 2.66 g, Mg2+ 1.32 g, K+ 420 mg, Ca2+ 400 mg, CO32- /HCO3- 200 mg, Sr2+ 8.8 mg, BO2- 5.6 mg, Br- 56 mg, I- 0.24 mg, Li+ 0.3 mg, F- 1 mg
Plastic tweezers	Oxford Instrument	AGT 5230
RPMI MEDIUM 1640 (ATCC Modification)	GIBCO	A10491-01	Solution with 4.5 g/L D-glucose, 1.5 g/L Sodium Bicarbonate, 110 mg/L (1 mM) Sodium Pyruvate, 2.388 g/L (10 mM) HEPES buffer and 300 mg/L L-glutamine for research use
Selenium nanoparticles (Se-NPs), BSA coated, 2 mg/mL	NANOCS Company, USA	Se50-BS-1	BSA stabilized Se-NPs solution. Average size about 30 nm. Stored at 4°C in the dark, protected from the light.
Selenium nanoparticles (Se-NPs), Chitosan coated, 2 mg/mL	NANOCS Company, USA	11. Se50-CS-1	Chitosan stabilized Se-NPs solution. Average size about 30 nm. Stored at 4°C in the dark, protected from the light.
Sodium metasilicate pentahydrate	Sigma-Aldrich	71746	Na2SiO3.5H2O, 22.8 mg/L of milliQ water
Sodium nitrate	Sigma-Aldrich	S5022	NaNO3, 75 mg/L of milliQ water
Sodium phosphate monobasic	Sigma-Aldrich	S5011	NaH2PO4, 15 mg/L of milliQ water
T-75 flasks
Tissue culture hood
Trace metal stock	Sigma-Aldrich	M5005, Z1001, M1651, C2911, 450243, 451193, 229857	1 mL/L of milliQ water (MnCl2.4H2O 200 mg/L, ZnSO4.7H2O 40 mg/L, Na2MoO4.2H2O 20mg/L, CoCl2.6H2O 14 mg/L, Na3VO4.nH2O 10 mg/L, NiCl2 10 mg/L, H2SeO3 10 mg/L)
Trypan Blue Solution (0.4%)	GIBCO	15250061
Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red	GIBCO	25300-054
Vitamin stock	Sigma-Aldrich	T1270 for thiamine, B4639 for biotin, V6629 for B12	1 mL/L of milliQ water (thiamine HCl 20 mg/L, biotin 1 mg/L, B12 1 mg/L)
Water bath 37°C