Подготовка биологических образцов к видообразованию при криогенной температуре с использованием рентгеновской абсорбционной спектроскопии высокого разрешения

Резюме

Этот протокол представляет собой подробную процедуру подготовки биологических криосамплей для экспериментов с рентгеновской абсорбционной спектроскопией на основе синхротронов. Мы описываем все шаги, необходимые для оптимизации пробоподготовки и криоконсервации, с примерами протокола с раковыми и фитопланктонными клетками. Этот метод обеспечивает универсальный стандарт криоподготовки образцов.

Аннотация

Изучение элементов с помощью рентгеновской абсорбционной спектроскопии (ХАС) представляет особый интерес при изучении роли металлов в биологических системах. Пробоподготовка является ключевой и часто сложной процедурой, особенно для биологических образцов. Хотя методы рентгеновского видообразования широко используются, подробный протокол еще не был распространен среди пользователей этого метода. Кроме того, модификация химического состояния вызывает беспокойство, и криотехнологии рекомендуются для анализа биологических образцов в их почти нативном гидратированном состоянии, чтобы обеспечить максимальное сохранение химической целостности клеток или тканей. Здесь мы предлагаем протокол клеточной подготовки, основанный на крио-сохраненных образцах. Это проявляется в флуоресцентном рентгеновском спектроскопическом исследовании селена в раковых клетках с высоким разрешением флуоресценции и исследовании железа в фитопланктоне. Этот протокол может быть использован с другими биологическими образцами и другими рентгеновскими методами, которые могут быть повреждены облучением.

Введение

Изучение клеточных биотрансформаций эссенциальных или токсичных элементов требует методов видообразования с высокой чувствительностью и должно свести к минимуму этапы подготовки образцов, которые часто склонны к модификации химических веществ.

Физиологические элементы, такие как селен и железо, как известно, особенно трудно видообразование из-за их сложного химического состава, различных стабильностей видов селена или железа и их низкой концентрации в диапазоне ppm (мг / кг) или даже ниже ppm. Таким образом, изучение видообразования этих элементов С помощью XAS может быть чрезвычайно сложным. Синхротронный XAS и особенно флуоресцентный XAS с высоким энергетическим разрешением (HERFD-XAS), который допускает очень низкое отношение сигнал/фон¹, доступны на синхротронных источниках для видообразования сильно разбавленных элементов в сложных биологических матрицах ^2,3. Обычные измерения флуоресценции-XAS могут быть выполнены с использованием твердотельного детектора с энергетическим разрешением (SSD) с полосой пропускания энергии ~ 150-250 эВ, на лучевой линии CRG-FAME в Европейской установке синхротронного излучения (ESRF)⁴, в то время как для измерений HERFD-XAS требуется спектрометр кристаллического анализатора (CAS) с полосой пропускания энергии ~ 1-3 эВ, на лучевой линии CRG-FAME-UHD на ESRF² . Флуоресцентные фотоны различаются по отношению к их энергии с помощью электронных или оптических процессов соответственно.

Криоподготовка образца необходима для сохранения структур и поддержания композиционной химической целостности, что позволяет проводить анализ вблизи биологического нативного состояния⁵. Кроме того, анализы, выполняемые при криогенных температурах до 10 К с использованием криогенного охлаждения жидкого гелия (LN₂), позволяют радиационному повреждению замедлить и сохранить элементарное видообразование для XAS. Хотя в некоторых обзорах методов XAS, применяемых к биологическим образцам, сообщается о необходимости подготовки и анализа образцов в криогенных условиях (например, Sarret et ^al.6, Porcaro et ^al.7), ни один из них четко не описывает соответствующий подробный протокол. В данной публикации описан способ криопрепарации раковых клеток и планктонных микроорганизмов для HERFD-XAS видообразования Se⁸ и Fe⁹ при криогенной температуре.

Надлежащая практика подготовки образцов и окружающей среды во время современных измерений XAS-спектроскопии требует 1) настройки; 2) процедура анализа, максимально ограничивающая последствия радиационного повреждения; и 3) образец (или эталонное соединение модели) как можно более однородный по отношению к размеру пучка рентгеновских фотонов. Первый пункт учитывается при выполнении сбора при низкой температуре, с использованием жидкого криостата гелия. Второй пункт решается путем выполнения каждого захвата на свежем участке образца путем перемещения его относительно луча. Наконец, учитывая третье условие, образцы (гранулы) и референции (порошки) кондиционируются в прессованных объемных гранулах, чтобы максимально ограничить пористость и неоднородность и избежать шероховатости по отношению к размеру пучка на поверхности исследуемого рентгеновского образца. Мы объясняем, как протокол решает все эти вопросы.

Мы использовали клеточную линию предстательной железы человека PC-3 (высокий метастатический потенциал) и клеточную линию яичников OVCAR-3 (на которую приходится до 70% всех случаев рака яичников) для исследования антипролиферативных свойств по отношению к раковым клеткам наночастиц селена (Se-NPs) и Phaeodactylum tricornutum diatom в качестве модельного вида для исследования секвестрации железа в фитопланктоне.

протокол

1. Подготовка гранул раковых клеток PC-3 и OVCAR-3 человека к видообразованию селена

ПРИМЕЧАНИЕ: Следующий протокол адаптирован из Weekley et ^al.10. Все этапы должны проводиться под колпаком клеточной культуры в условиях и ограничениях уровня биобезопасности 2, с использованием асептических методов.

1. Подсчитайте ячейки с помощью счетной камеры Malassez. Посейте 150 000–200 000 клеток на колбу для клеточной линии PC-3 и 300 000 клеток для клеточной линии OVCAR-3.
2. Семенные клетки в колбах Т-75 (по три колбы на условие для того, чтобы иметь трипликаты) в адекватной среде клеточного культивирования (таблица 1) под ламинарным проточным колпаком.
3. Оставьте клеточные культуры расти в инкубаторе при 37 °C и увлажненной атмосфере с 5% CO₂ , пока они не достигнут 80% слияния. Обычно клеточные линии рака предстательной железы PC-3 удваиваются через 24 ч, в то время как клеточные линии рака яичников OVCAR-3 занимают 72 ч. Колбы необходимо оставить в инкубаторе.
4. Между тем, разбавляют Se-NP, используемые для лечения, до конечной концентрации, соответствующей IC20 (ингибирующая концентрация для достижения 20% гибели клеток), которая была предопределена анализом МТТ (3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-2,5-дифенилтетразолия бромид) для оценки цитотоксичности. Эти концентрации специфичны для каждого типа Se-NPs, но также специфичны для исследуемой клеточной линии.
   1. Поместите раствор наночастиц (2 мг/мл бычьего сывороточного альбумина [BSA] или покрытых хитозаном Se-NPs) на ультразвуковую водяную баню в течение 30 мин при комнатной температуре (RT).
   2. Разбавляют раствор Se-NPs путем последовательных разведений в полноценной клеточной культуральной среде до достижения рабочих концентраций. Между каждым разведением вихрь в течение 1 мин.
5. Подготовьте селен-положительный контроль с разбавленной солью селена для обработки.
   1. Приготовьте водный раствор селенита натрия (1 мг/мл) в полипропиленовой трубке объемом 15 мл. Смешайте 1 мг порошка селенита натрия с 1 мл сверхчистой воды.
   2. Вихрь стокового раствора в течение 1 мин.
   3. Раствор селенита натрия разбавляют серийными разбавлениями в полноценной клеточной культуральной среде до достижения рабочих концентраций.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Не забывайте пипетировать несколько раз перед каждым разбавлением, чтобы гомогенизировать раствор.
6. Подвергайте раковые клетки лечению селеном.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Эта часть протокола должна быть повторена для каждой тестируемой наночастицы (NP). Здесь NP бывают двух типов, BSA и Хитозано покрытые Se-NP, плюс элементы управления. Раствор селенита натрия является положительным контролем, и никакое лечение не является отрицательным контролем.
   1. Откройте три колбы Т-75, содержащие ячейки в ламинарной вытяжке.
   2. Удалите среду и тщательно промойте клетки в 2 раза 5 мл подогретого (37 °C) фосфатного буферного физиологического раствора (PBS).
   3. Осторожно, на нижней стороне колбы, а не непосредственно на клеточном слое, добавьте 15 мл обработки в каждую колбу с помощью автоматической пипетки, оснащенной 25 мл стерильных пластиковых пипеток. Поместите крышки на колбы. Не закрывайте крышки плотно.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Как описано на этапах 1.3 и 1.4, растворы для обработки должны быть предварительно повторно суспендированы для гомогенизации.
   4. Оставьте три колбы горизонтально в инкубаторе при 37 °C и атмосферу, увлажненную 5% CO₂ в течение 24 часов.
7. Приготовление клеточных гранул
   1. Аккуратно промыть ячейки 2x с 5 мл нагретого PBS (37 °C) непосредственно в колбах T75.
   2. Добавьте 6 мл нагретой питательной среды клеток (37 °C) на клеточный слой в колбе Т-75 с помощью пипетки, оснащенной 10 мл стерильных пластиковых пипеток.
   3. Соберите ячейки путем мягкого соскабливания с помощью скребка для клеток. Используйте по одной ячейке скребка на колбу.
   4. Используя пипетку и пипетку 10 мл, аспирируйте жидкость и смывайте обратно клетку / среду на поверхность колбы, чтобы собрать все клетки. Повторите этот шаг несколько раз, чтобы диссоциировать и индивидуализировать клетки. Соберите среду, содержащую клетки, в полипропиленовую трубку объемом 15 мл.
   5. Открутите при 250 х г в течение 5 мин при RT. Аспирируйте супернатант.
   6. Промыть клетки, повторно разместив их в 5 мл PBS.
   7. Раскрутите при 250 х г в течение 5 мин при RT. Аспирируйте супернатант и повторите шаги 1,6,5 и 1,6,6 2 раза, чтобы избавиться от всех оставшихся следов обработки.
   8. Повторно суспендируйте клетки в 1 мл PBS и перенесите их в полипропиленовую трубку объемом 1,5 мл. Наконец, раскрутите их вниз при 250 х г в течение 5 мин при РТ. Рисунок 1 представляет собой гранулу ячейки, полученную после центрифугирования и выброса супернатанта.
   9. Аккуратно удалите все супернатанты PBS с помощью пипетки объемом 200 мкл.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Будьте осторожны, чтобы не коснуться и не повредить гранулу клетки. В идеале гранула должна быть высотой 2–3 мм или толщиной, диаметром 3–6 мм. Для клеточной линии PC-3 для анализа требуется 9 x 10⁶–10 x 10⁶ ячеек. Для клеточной линии OVCAR-3 требуется 8 x 10⁶–9 x 10⁶ ячеек (рисунок 1). Некоторые клетки, вероятно, будут потеряны во время последующих этапов промывки буфера. Чем выше число ячейки, тем лучше будет гранула.
8. Мгновенная заморозка гранул клеток
   1. Опустите нижнюю часть трубки объемом 1,5 мл, содержащей гранулу в жидком азоте (LN₂), до уровня гранулы ячейки.
   2. В бардачке, полностью очищенном инертной атмосферой, такой как газообразный азот, соберите гранулу ячейки, осторожно постукивая трубкой объемом 1,5 мл по плоской поверхности LN 2-охлаждаемого медного блока (рисунок 2). Затем гранула собирается без потери клеток.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте криозащитное оборудование, лабораторное пальто, закрытую обувь, криоперчатки и лицевой щиток или защитные очки для обработки LN₂ .
   3. При необходимости можно использовать охлажденную иглу LN₂ , чтобы помочь вынуть гранулу.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Полученная замороженная гранула ячейки может фрагментироваться. Эти шаги должны быть выполнены в течение нескольких минут и полагаться на ловкость и скорость исследователя.
   4. Размеры замороженных гранул должны соответствовать держателю образца криостата. Используя описанное оборудование, если гранула ячейки больше 2 мм в высоту и немного меньше отверстия держателя образца, используемого для XAS, образец может быть использован непосредственно. Если нет, или если требуется плоская поверхность для анализа, необходимо подготовить объемную цилиндрическую гранулу, сохраняя гранулу в замороженном состоянии. Если ячейка гранулы фрагментирована, следующие этапы могут быть использованы в идеале в перчаточном ящике, полностью очищенном инертной атмосферой.
9. Приготовление насыпных замороженных цилиндрических гранул
   1. Погрузите все части ручного гидравлического пресса, которые будут контактировать с образцом, в LN₂ (рисунок 3A; грануляционные матрицы диаметром 3 или 5 мм, пресс-форма, вытягивание поршня / проволоки).
   2. Переложите быстрозамороженные фрагменты гранул в форму, загруженную соответствующими грануляционными матрицами (рисунок 3B).
   3. Быстрое гранулирование с помощью гидравлического пресса. Достаточно использовать 1,5 тонны для гранул диаметром 5 мм или 0,5 тонны для гранул диаметром 3 мм (рисунок 3C).
      ПРИМЕЧАНИЕ: После каждой подготовки гранул с помощью гидравлического пресса все материалы должны быть разморожены и высушены должным образом с использованием газообразного азота, чтобы избежать каких-либо проблем с оставшимся морозом и влажностью.
   4. Быстро соберите объемную гранулу замороженных клеток и поместите ее в адекватную криотрубку для хранения.
   5. Храните его обратно в резервуар LN₂ для длительного хранения.
   6. Перенесите и смонтируйте криопеллеты для анализа. Гранула, хранящаяся в охлаждаемой криотрубе LN₂ , переносится в держатель для предварительно охлажденного криостата 77 К в жидкости_N2 (рисунок 4, используемый для лучевой линии CRG-FAME-UHD). Этот шаг должен быть выполнен как можно быстрее, но может занять несколько минут. Затем перенесите держатель образца в криостат и поддерживайте его на уровне 10 К в течение всего анализа XAS.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Этапы 1.9.3 и 1.9.6 являются сложными, поскольку их необходимо выполнить быстро, чтобы избежать образования мороза, который заблокирует поршень и пресс-форму. Альтернативой является выполнение этих шагов под пластиковой палаткой, полностью продуваемой газообразным азотом. _{LN 2-холодная} медная масса позволяет хранить гранулы замороженными.

2. Подготовка планктонных ячеек к видообразованию железа

ПРИМЕЧАНИЕ: Синтетическая морская вода, используемая для этого протокола, была получена путем добавления морских солей ультрачистой воды, морфолинопропансульфоновой кислоты, нитрата аммония, нитрата натрия, пентагидрата метасиликата натрия, моноосновного фосфата натрия, витаминного сырья, запаса следовых металлов, запаса антибиотиков и буфера HEPES при рН = 7,9. Концентрации каждого компонента указаны в Таблице материалов. Подробную информацию о культуре можно найти в Sutak et ^al.11

1. Центрифугируйте культуру диатомовых водорослей P. tricornutum в полипропиленовой трубке объемом 50 мл при 1 100 х г в течение 6 мин и переложите гранулу в колбу со свежей средой.
2. Дайте культуре расти в синтетической морской воде в камере роста в течение 24 ч.
3. Центрифугируют культуру планктона в течение 6 мин при 1,100 х г и переносят гранулу в свежую среду, содержащую Fe-цитрат (1 мкМ в конечной культуре). Инкубировать в течение 72 ч.
4. Подготовка планктонных ячеек
   1. Центрифугировать ячейки в течение 3 мин при 1 100 х г и промыть средой без железа.
   2. Переложите гранулу в полипропиленовую трубку объемом 1,5 мл, промыть сверхчистой водой и центрифугу 2x в течение 3 мин при 1 100 х г. Удалите супернатант.
   3. Погружают нижнюю часть полипропиленовой трубки объемом 1,5 мл, содержащей гранулу в LN₂ , как описано на этапе 1.8.
   4. Переместите замороженные ячейки в замороженный формовочный станок LN₂ и быстро прессуйте с помощью пресса для гранул XRF (рисунок 3 и рисунок 7), как описано на этапе 1.9.
   5. Извлеките гранулу и храните ее в резервуаре LN₂ для длительного хранения.
   6. Выполните шаг 1.9.6 (см. рисунок 4 для переноса в держатель для образцов криостата).

3. Получение и измерение эталонных соединений

ПРИМЕЧАНИЕ: Эталонные соединения (твердые или жидкие), представляющие вид и ожидаемые для обнаружения в биологической системе, должны быть подготовлены и проанализированы XAS для сравнения с экспериментальными биологическими образцами. Эталонные спектры также могут быть найдены в базах данных 12,13,14 и могут быть использованы при условии, что условия измерения (например, спектральное разрешение) были аналогичны экспериментальным образцам.

1. Для ссылок в водном растворе взвешивают исходные соединения в виде порошка или жидкости в анаэробном состоянии или инертной атмосфере. Подготавливайте окислительно-чувствительные референции в инертной атмосфере (т.е. в анаэробном перчаточном ящике или в линии Шленка, см. Фиг.5 и Фиг.6), чтобы избежать любой оксидоредуктивной реакции и сохранить химическую целостность соединения, которое может быть высокореакционноспособным и нестабильным в окружающем воздухе). Здесь все ссылки на селен были подготовлены с использованием линии Шленка и дегазированной сверхчистой воды (рисунок 6). Жидкий Fe^{III-малат} и ферритин получали на окружающем воздухе.
2. Смешивают с соответствующим раствором для достижения конечной концентрации 1% масс. исследуемого элемента (т.е. селена или железа) для сбора в режиме флуоресценции.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Сверхчистая вода является наиболее часто используемым раствором для приготовления ссылок XAS. Добавление глицерина (15%-20%) требуется для жидкостей, измеренных с использованием стандартной флуоресценции XAS, для предотвращения артефактов, возникающих в результате дифракции рентгеновских лучей кристаллами льда и сохранения качества сигнала XAS, собранного с помощью твердотельного детектора. Однако для HERFD-XAS глицерин не является обязательным. Используя спектрометр кристаллического анализатора вместо твердотельного детектора, энергия выбирается с чрезвычайно высоким разрешением и дифракция, индуцированная кристаллами льда, не влияет на сбор данных исследуемого элемента¹.
3. Сохраняют и хранят приготовленный раствор в герметичном баллоне Шленка (рисунок 5) или в полипропиленовой трубке объемом 1,5 мл до измерения в тех же условиях, что и образцы.
4. Для твердых ссылок взвешивайте порошки селена или железа на окружающем воздухе или в бардачке, если эти виды чувствительны к окислительно-восстановительным воздействиям. Здесь твердые ссылки на Fe^II (Fe II-ацетат и вивианит) были получены в газообразном перчаточном ящике_N2, в то время как Fe^III (Fe(OH)₃ и Fe^{III-фосфат}) были получены на окружающем воздухе.
5. Взвешивают порошок нитрида бора высокой чистоты и смешивают с модельными соединениями порошки для достижения конечной концентрации исследуемого элемента в 1% мас.масс. (рис. 7А).
6. Измельчите до мелкого порошка с помощью раствора в течение не менее 15 минут.
7. Поместите порошковую смесь в формовочную машину для приготовления гранул с помощью гидравлического пресса (рисунок 7B, аналогичный рисунку 3A для образца гранулы).
8. Закройте формовщик поршнем (рисунок 7C, аналогичный рисунку 3B для гранул образца).
9. Пресс для получения объемной гранулы (рисунок 7D, аналогичный рисунку 3C для образца гранулы).
10. Храните подготовленные объемные гранулы в бардачке до тех пор, пока они не будут проанализированы в тех же условиях, что и образцы.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Объемная гранула иногда прилипает к поршням, например, в зависимости от количества порошка. Удалить его мягко, не сломав его, тогда может быть сложно. В этом случае необходимо использовать следующую процедуру с использованием полиимидных (например, каптонных) дисков.
11. Положите каплю этанола на каждую сторону поршней, которые будут контактировать с порошком (рисунок 8А).
12. Подготовьте два полиимидных диска диаметром чуть меньше поршней. Толщина полиимида должна составлять 10–25 мкм (тоньше будет трудно манипулировать, толще будет поглощать слишком много рентгеновских фотонов во время анализа).
13. Положите диски на поршни. Они будут прилипать капиллярным действием (рисунок 8B).
14. Установите формовщик с поршнем, добавьте порошок и вставьте второй поршень (рисунок 8C).
15. Нажмите (см. шаг 3.11) и извлеките из поршней сжатую насыпную гранулу.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Твердые исходные данные могут быть установлены на держателе для образцов для криостата, как и образцы (см. этап 1.8.6). Ссылки на жидкость могут быть установлены на держателе для образцов криостата. См. рисунок 9A для держателя образца криостата CRG-FAME. Та же процедура может быть применена с помощью держателя образца CRG-FAME-UHD, показанного на рисунке 4D, с использованием следующей процедуры.
16. Установка жидкого эталона на держатель для образцов криостата.
    1. Установите полиимидную (например, каптонную) ленту (толщиной 25 мкм), чтобы запечатать одну сторону отверстия на держателе образца на RT (рисунок 9B).
    2. Используя шприц, медленно заполняйте полость раствором, пока он не достигнет вершины. Избегайте пузырьков. Резервуар должен быть заполнен (рисунок 9C, слева).
    3. Запечатайте другую сторону полости лентой (рисунок 9C, справа).
    4. Погрузите герметичный держатель образца в LN₂ (рисунок 9D, T₀–T₃).
    5. Термическая реакция вызывает пузырьки LN₂ . Подождите, пока пузырьки не прекратятся, сигнализируя об окончании реакции (рисунок 9D, T₃–T₅).
    6. Перенесите держатель образца при 77 К в криостат линии луча перед началом сбора данных (рисунок 9D, T₆) или хранения в LN₂ Dewar.
       ПРИМЕЧАНИЕ: Замороженный раствор хорошо распределяется в полости и образует однородную и однородную гранулу (рис. 9D, Т₇).

4. HERFD-XAS: процедура измерения

1. Оптимизируйте все кристаллы из CAS в условиях Брэгга относительно интересующей энергии флуоресцентной линии. Эта процедура может быть выполнена с концентрированным эталонным соединением.
2. Откалибруйте падающую монохроматическую энергию пучка, используя эталон, для которого известно энергетическое положение края поглощения (обычно это чистая металлическая фольга). Этот эталон может быть размещен на втором этапе после образца, в режиме двойной передачи, чтобы иметь возможность проверить калибровку для каждого полученного спектра и в конечном итоге выровнять их после обработки.
3. Поместите образец в жидкий криостат гелия для биологических образцов в соответствии с соответствующей процедурой, описанной на этапе 1.9.6.
4. Закройте экспериментальную хижину, следуя правилам синхротронной безопасности.
5. Выполните сбор XAS в диапазоне энергии, охватывающем выбранное периферийное поглощение.
6. После каждого спектрального захвата перемещайте образец по крайней мере в два раза больше размера пучка в направлении движения, прежде чем начинать новое приобретение.
   ПРИМЕЧАНИЕ: В этом случае измерения проводились с использованием кристаллов Ge(440) для выбора Линии_{Fe Ka 1} и с использованием кристаллов Ge(844) для выбора Se K_a1 линии. Размер луча на образце составлял 200 x 100 мкм² (H x V Full Width Half Maximum). Движение образца между каждым приобретением составляло 500 мкм в обоих направлениях, чтобы исследовать структурную однородность и каждый раз анализировать новую область, свободную от предыдущих возможных радиационных повреждений. Отдельные спектры сравниваются и объединяются, если они накладываются на шум. Измерение останавливается для данного образца, когда качество объединенного спектра является правильным. Затем анализ данных может быть выполнен с использованием любого программного обеспечения, предназначенного для анализа XAS, особенно тех, которые позволяют линейное комбинированное подгонка нормализованных спектров, например Athena и Artemis (группа программного обеспечения Demeter)¹⁵, SixPack¹⁶ или Viper¹⁷. Полные и подробные объяснения анализа XAS выходят за рамки этого протокола и могут быть найдены в последних работах^18,19, некоторые из которых более конкретно посвящены биологическим образцам²⁰. Эталонные спектры селена XANES уже собраны в базе данных спектров SSHADE²¹.

Результаты

Основными целями этих препаратов были исследование взаимодействия между наночастицами селена (Se-NPs) и раковыми клетками, а также связывания и связывания железа в фитопланктоне.

Спектры HERFD-XANES селена в исходном состоянии (BSA Se-NPs) и в клетках, инкубированных в питательной с?...

Обсуждение

Этот протокол использовался для изучения химической формы селена и железа в биологических образцах с помощью рентгеновской абсорбционной спектроскопии. Основное внимание уделяется криоподготовке и хранению биологических образцов и эталонных соединений, а также измерениям HERFD-XAS.

<...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Ammonium nitrate	Sigma-Aldrich	A3795	NH4NO3, 2.66 mg/L of milliQ water
Anaerobic chamber	Coy Laboratory, USA		equipped with Anaerobic Monitor (CAM-12)
Antibiotic stock	Sigma-Aldrich	A0166 for ampicillin, S9137 for streptomycin sulfate	1 mL/L of milliQ water (ampicillin sodium and streptomycin sulfate, 100 mg/mL)
Boron nitride powder	Sigma-Aldrich	255475
Cell counting chamber			Neubauer or Malassez
Cell scraper
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (DPBS)	GIBCO	14190-094	Without Calcium, Magnesium, Phenol Red
Eppendorf tubes			0.5 mL and 1.5 mL
Falcon tubes			15 mL and 50 mL
Ferric citrate Fe/citrate = 1/20	Sigma-Aldrich	F3388	aqueous solution of FeCl3 50 mM and Na-citrate 1M pH 6.5
Fetal Bovine Serum	GIBCO	A31604-02	Performance Plus, certified One Shot format, US origin
Flasks	Sigma-Aldrich	Z707503	TPP 150 cm2 area
Growth chamber	Sanyo	Sanyo MLR-352	at 20 °C and under a 12:12 light (3,000 lux) dark regime
HEPES buffer	Sigma-Aldrich	H4034	1 g/L of milliQ water HEPES
High grade serous, OVCAR-3	ATCC, Rockville, MD	HTB-161	Storage temperature: liquid nitrogen vapor temperature
Incubator			Incubator at 37°C, humidified atmosphere with 5% CO2
Insulin solution from bovine pancreas	Sigma-Aldrich	I0516	10 mg/mL insulin in 25mM HEPES, pH 8.2, BioReagent, sterile-filtered, suitable for cell culture
Manual hydraulic press	Specac, USA
Marine diatom Phaeodactylum tricornutum	Roscoff culture collection	RCC69	http://roscoff-culture-collection.org/rcc-strain-details/69
Morpholinepropanesulfonic acid	Sigma-Aldrich	M3183	MOPS, 250 mg/L of milliQ water (pH 7.3)
Optical microscope
PC-3	ECCAC, Salisbury, UK	90112714	Storage temperature: liquid nitrogen vapor temperature
Penicillin-Streptomycin	Sigma-Aldrich	P4333	Solution stabilized, with 10,000 units penicillin and 10 mg streptomycin/mL, sterile-filtered, BioReagent, suitable for cell culture
Pipette-boy			25mL-, 10mL-, and 5mL sterile plastic-pipettes
Plankton culture products, Mf medium: Sea salts	Sigma-Aldrich	S9883	40g/L of milliQ water. Composition: Cl- 19.29 g, Na+ 10.78 g, SO42- 2.66 g, Mg2+ 1.32 g, K+ 420 mg, Ca2+ 400 mg, CO32- /HCO3- 200 mg, Sr2+ 8.8 mg, BO2- 5.6 mg, Br- 56 mg, I- 0.24 mg, Li+ 0.3 mg, F- 1 mg
Plastic tweezers	Oxford Instrument	AGT 5230
RPMI MEDIUM 1640 (ATCC Modification)	GIBCO	A10491-01	Solution with 4.5 g/L D-glucose, 1.5 g/L Sodium Bicarbonate, 110 mg/L (1 mM) Sodium Pyruvate, 2.388 g/L (10 mM) HEPES buffer and 300 mg/L L-glutamine for research use
Selenium nanoparticles (Se-NPs), BSA coated, 2 mg/mL	NANOCS Company, USA	Se50-BS-1	BSA stabilized Se-NPs solution. Average size about 30 nm. Stored at 4°C in the dark, protected from the light.
Selenium nanoparticles (Se-NPs), Chitosan coated, 2 mg/mL	NANOCS Company, USA	11. Se50-CS-1	Chitosan stabilized Se-NPs solution. Average size about 30 nm. Stored at 4°C in the dark, protected from the light.
Sodium metasilicate pentahydrate	Sigma-Aldrich	71746	Na2SiO3.5H2O, 22.8 mg/L of milliQ water
Sodium nitrate	Sigma-Aldrich	S5022	NaNO3, 75 mg/L of milliQ water
Sodium phosphate monobasic	Sigma-Aldrich	S5011	NaH2PO4, 15 mg/L of milliQ water
T-75 flasks
Tissue culture hood
Trace metal stock	Sigma-Aldrich	M5005, Z1001, M1651, C2911, 450243, 451193, 229857	1 mL/L of milliQ water (MnCl2.4H2O 200 mg/L, ZnSO4.7H2O 40 mg/L, Na2MoO4.2H2O 20mg/L, CoCl2.6H2O 14 mg/L, Na3VO4.nH2O 10 mg/L, NiCl2 10 mg/L, H2SeO3 10 mg/L)
Trypan Blue Solution (0.4%)	GIBCO	15250061
Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red	GIBCO	25300-054
Vitamin stock	Sigma-Aldrich	T1270 for thiamine, B4639 for biotin, V6629 for B12	1 mL/L of milliQ water (thiamine HCl 20 mg/L, biotin 1 mg/L, B12 1 mg/L)
Water bath 37°C