JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

يصف هذا البروتوكول كيفية تقطيع أنسجة القلب واستزراعها في ظل ظروف فسيولوجية لمدة 6 أيام. يمكن استخدام هذا النظام الثقافي كمنصة لاختبار فعالية علاجات فشل القلب الجديدة وكذلك الاختبار الموثوق به للسمية القلبية الحادة في نموذج القلب ثلاثي الأبعاد.

Abstract

العديد من الأدوية الجديدة تفشل في الدراسات السريرية بسبب الآثار الجانبية السامة للقلب كما تتوفر حاليا في المقالات المختبرية وفي نماذج الحيوانات على الجسم الحي التنبؤ بشكل سيئ التزامات القلب البشري, تشكل عبئا بمليارات الدولارات على صناعة الأدوية. وبالتالي، هناك حاجة طبية غير ملباة في جميع أنحاء العالم إلى نهج أفضل لتحديد سمية القلب الدوائية قبل إجراء تجارب مكلفة وتستغرق وقتاطويلا "أولا في الإنسان". حاليا، يتم استخدام خلايا القلب غير ناضجة فقط (الإنسان المستحث ة متعددة القدرات الخلايا الجذعية المشتقة من القلب [hiPSC-CMs]) لاختبار الكفاءة العلاجية وسمية المخدرات لأنها الخلايا القلبية البشرية الوحيدة التي يمكن استزراعها لفترات طويلة مطلوب لاختبار فعالية الدواء والسمية. ومع ذلك، لا يمكن لنوع خلية واحدة تكرار النمط الظاهري لأنسجة القلب 3D المعقدة التي تتشكل من أنواع خلايا متعددة. والأهم من ذلك، يجب اختبار تأثير الأدوية على خلايا القلب البالغة، التي لها خصائص مختلفة واستجابات سمية مقارنة بـ hiPSC-CMs غير الناضجة. توفر هذه التقنية الوصول إلى نظام كامل متعدد الخلايا يحاكي أنسجة القلب البشرية ويعكس الظروف الفسيولوجية أو المرضية لعضلة القلب البشرية. في الآونة الأخيرة ، من خلال تحسين مكونات وسائل الإعلام الثقافية وظروف الثقافة لتشمل التحفيز الكهربائي المستمر في 1.2 هرتز والأوكسجين المتقطع للوسيط الثقافي ، قمنا بتطوير إعداد نظام ثقافة جديد يحافظ على قابلية البقاء وظائف الإنسان والخنازير شرائح القلب لمدة 6 أيام في الثقافة. في البروتوكول الحالي، نحن نفصّل طريقة تقطيع وزراعة قلب الخنزير كمثال. يستخدم نفس البروتوكول لثقافة شرائح من قلوب الإنسان أو الكلب أو الأغنام أو القطط. هذا النظام الثقافي لديه القدرة على أن يصبح الإنسان التنبؤية قوية في الموقع لاختبار السمية القلبية الحادة التي تسد الفجوة بين نتائج الاختبار قبل السريرية والسريرية.

Introduction

السمية القلبية الناجمة عن المخدرات هي سبب رئيسي لانسحاب السوق1. في العقد الأخير منالقرن العشرين، تم سحب ثمانية أدوية غير قلبية وعائية من السوق لأنها أدت إلى الوفاة المفاجئة بسبب عدم انتظام ضربات القلب البطيني2. بالإضافة إلى ذلك، يمكن أن تؤدي العديد من العلاجات المضادة للسرطان (في حين أنها فعالة في كثير من الحالات) إلى العديد من الآثار السامة للقلب بما في ذلك اعتلال عضلة القلب وعدم انتظام ضربات القلب. على سبيل المثال، يمكن أن يؤدي كل من العلاجات التقليدية (مثل الجمرة الخبيثة والإشعاع) والمستهدفة (على سبيل المثال، trastuzumab) علاجات سرطان الثدي إلى مضاعفات القلب والأوعية الدموية في مجموعة فرعية من المرضى3. وقد ساعد التعاون الوثيق بين أطباء القلب وأطباء الأورام (عبر المجال الناشئ من "أمراض القلب والأورام") على جعل هذه المضاعفات قابلة للإدارة لضمان أن المرضى يمكن علاجهم بفعالية2. أقل وضوحا هي آثار القلب والأوعية الدموية من العوامل الأحدث، بما في ذلك مثبطات Her2 و PI3K، وخاصة عندما يتم استخدام العلاجات في تركيبة. لذلك، هناك حاجة متزايدة لاستراتيجيات فحص موثوق بها قبل السريرية لسمية القلب والأوعية الدموية المرتبطة بالعلاجات الناشئة المضادة للسرطان قبل التجارب السريرية البشرية. عدم توافر نظم الثقافة لأنسجة القلب البشرية التي هي قابلة للحياة وظيفيا وهيكليا لأكثر من 24 ساعة هو عامل يحد من اختبار السمية القلبية موثوق بها. لذلك ، هناك حاجة ملحة لتطوير نظام موثوق به لزراعة أنسجة القلب البشرية في ظل ظروف فسيولوجية لاختبار سمية الدواء.

وقد وفر التحرك الأخير نحو استخدام خلايا القلب المشتقة من الخلايا الجذعية المتعددة القدرات التي يسببها الإنسان حلاً جزئياً لمعالجة هذه المسألة؛ ومع ذلك ، فإن الطبيعة غير الناضجة لhiPSC-CMs وفقدان سلامة الأنسجة مقارنة بالطبيعة متعددة الخلايا لأنسجة القلب هي قيود رئيسية لهذه التكنولوجيا4. وقد تغلبت دراسة حديثة جزئيا هذا القيد من خلال تصنيع أنسجة القلب من hiPSC-CMs على hydrogels وإخضاعها لزيادة تدريجية في التحفيز الكهربائي مع مرور الوقت5. ومع ذلك ، لم تحقق خصائصها الكهروميكانيكية النضج الذي شوهد في عضلة القلب البشرية البالغة. وعلاوة على ذلك، أنسجة القلب هو أكثر تعقيدا من الناحية الهيكلية، ويجري تتألف من أنواع مختلفة من الخلايا بما في ذلك الخلايا الانبهية والخلايا العصبية وأنواع مختلفة من الخلايا الليفية سترومال مرتبطة جنبا إلى جنب مع خليط محدد جدا من البروتينات مصفوفة خارج الخلية6. هذا التغاير من السكان خلية غير cardiomyocyte7,8,9 في قلب الثدييات الكبار هو عقبة رئيسية في نمذجة أنسجة القلب باستخدام أنواع الخلايا الفردية. هذه القيود الرئيسية تسليط الضوء على أهمية تطوير أساليب لتمكين زراعة الأنسجة القلبية سليمة للدراسات المثلى التي تنطوي على الحالات الفسيولوجية والمرضية للقلب5.

زراعة شرائح القلب البشري هو نموذج واعد من عضلة القلب البشرية سليمة. توفر هذه التقنية الوصول إلى نظام كامل متعدد الخلايا ثلاثي الأبعاد يشبه أنسجة القلب البشرية التي يمكن أن تعكس بشكل موثوق الظروف الفسيولوجية أو المرضية لعضلة القلب البشرية. ومع ذلك ، فقد تم تقييد استخدامه بشدة بسبب فترة قصيرة من الجدوى في الثقافة ، والتي لا تتجاوز 24 ساعة باستخدام أقوى البروتوكولات المبلغ عنها حتى عام 201810،11،12. ويرجع هذا القيد إلى عوامل متعددة بما في ذلك استخدام واجهة الهواء والسائل لثقافة الشرائح ، واستخدام وسيلة الثقافة البسيطة التي لا تدعم المطالب النشطة العالية للأنسجة القلبية. لقد قمنا مؤخرا بتطوير نظام الثقافة المغمورة التي هي قادرة على توفير التحفيز الكهربائي المستمر وتحسين مكونات وسائل الإعلام الثقافة للحفاظ على شرائح الأنسجة القلبية قابلة للحياة لمدة تصل إلى 6 أيام13. هذا النظام الثقافي لديه القدرة على أن يصبح الإنسان التنبؤية قوية في الموقع لاختبار السمية القلبية الحادة لسد الفجوة بين نتائج الاختبار قبل السريرية والسريرية. في المقالة الحالية ، ونحن تفاصيل بروتوكول لتقطيع وزراعة شرائح القلب باستخدام قلب الخنزير كمثال. يتم تطبيق نفس العملية على قلوب الإنسان أو الكلب أو الأغنام أو القطط. مع هذا البروتوكول، ونحن نأمل في نشر التكنولوجيا إلى مختبرات أخرى في المجتمع العلمي.

Protocol

وكانت جميع الإجراءات المتعلقة بالحيوانات متفقة مع المبادئ التوجيهية المؤسسية لجامعة لويزفيل ووافقت عليها اللجنة المؤسسية لرعاية الحيوانات واستخدامها.

1. التحضير للتشريح (قبل يوم واحد من تشريح)

  1. إعداد الميكروتوم المهتز
    1. ضع شفرة السيراميك في حاملها باتباع هذه الخطوات: بعد فك شفرة بعناية، ضع الحافة الحادة أولاً في فتحة أداة الشفرة. ثم، تناسب شفرة في حامل عن طريق تخفيف مسامير اثنين على ذراعي حامل والشريحة شفرة تحت كل الزواة ودفعها بقوة مرة أخرى ضد توقف الخلفي. تشديد مسامير لتأمين شفرة.
      ملاحظة: لا ينبغي تشديد البراغي.
    2. معايرة النصل باستخدام بروتوكول المعايرة والأدوات وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة.
      ملاحظة: لفترة وجيزة ، من أجل تسهيل محاذاة النصل مع محور السفر وتقليل انحرافات محور Z ، يستخدم الميكروتومي المهتز جهاز معايرة قابل للفك. عندما يتم توصيل جهاز المعايرة في الصك سيتم الكشف تلقائيا عن وجوده، وmicrotome تهتز سوف تأخذ السيطرة على ضبط إعدادات السعة والتردد من شفرة إلى حجم الذي يسمح على أفضل وجه تعديل خطأ محاذاة شفرة.
      1. اضغط على زر الشريحة لبدء عملية المحاذاة التي ستحرك النصل تلقائيًا بحيث تكون حافة القطع في الوضع الأمثل بالنسبة لجهاز المعايرة للحصول على أفضل تقييم للمحاذاة. اتبع التعليمات التي تظهر على الشاشة لإجراء تعديلات على النصل باستخدام مفك البراغي المقدم للتأكد من أن محاذاة Z تقع ضمن 1 ميكرومتر.
    3. الأوتوكلاف الحمام الداخلي وجميع الأجزاء المعدنية من microtome تهتز.
  2. أوتوكلاف الصواني المعدنية الكبيرة (لجمع شرائح ونقع يغطي لوحة التحفيز الكهربائي)، أي حاويات زجاجية، شفرات مستطيل العادية، الملقط، مقص، حزام توقيت الطابعة (قطع لهم إلى 6 ملم قطع واسعة)، وأغطية معدنية و 5 لتر من الماء المقطر المزدوج (ddH2O).
  3. تعقيم جرة واحدة 1 لتر، جرة واحدة 500 مل وصينية بلاستيكية واحدة للقلب في الموقع وفي المختبر التبصر مع محلول القلب البلى.
  4. إعداد 2 L من حل Tyrode تشريح في 2 L الكأس.
    1. ل1 L من محلول Tyrode تشريح، مزيج 3 ز /لتر 2،3-البوتانبيدون أحادي (BDM)، 140 mM NaCl (8.18 ز)، 6 mM KCl (0.447 غرام)، 10 mM D-الجلوكوز (1.86 غرام)، 10 mM HEPES (2.38 ز)، 1 mM MgCl2 (1 مل من محلول 1 M)، 1.8 mM CaCl2 (1.8 مل من محلول 1 M)، ما يصل إلى 1 لتر من ddH2O. ضبط درجة الحموضة إلى 7.40 باستخدام NaOH. ثم قم بتصفية الحل باستخدام 1000 مل ، 0.22 ميكرومتر ، نظام فلتر /تخزين فراغ وتخزينه عند 4 درجات مئوية بين عشية وضحاها.
  5. إعداد 4 لتر من محلول القلب والجنب.
    1. لـ 1 لتر من محلول القلب والجنب، اخلط 110 مللي متر ناكل (6.43 جم)، 1.2 مللي متر كاكل2 (1.2 مل من محلول 1 M)، 16 مللي متر KCl (1.19 جم)، 16 مللي متر MgCl2 (3.25 جم)، 10 مللي متر ناهكو 3 (0.84 جرام)، 1 U/mL heparin، 1 U/mL heparin، 16 mM MgCl 2 (3.25 غرام)، 10 mM NaHCO 3 (0.84 g)، 1 U/mL heparin، 1 U/mL heparin، 16 mM MgCl 2 (3.25 غرام)، 10 mM NaHCO3 (0.84 g)، 1 U/mL heparin، 1 U/mL heparin، 1U/mL ما يصل إلى 1 L من ddH2O. ضبط درجة الحموضة إلى 7.40 باستخدام NaOH. ثم قم بتصفية الحل باستخدام 1000 مل ، 0.22 ميكرومتر ، نظام فلتر /تخزين فراغ وتخزينه عند 4 درجات مئوية بين عشية وضحاها.
      ملاحظة: إضافة 1000 U / L الهيبارين في محلول القلب والجنب ة في يوم تشريح (انظر الخطوة 2.1).
  6. إعداد الطازجة 500 مل من الثقافة المتوسطة في زجاجة الأصلي في مجلس الوزراء السلامة البيولوجية: مزيج المتوسطة 199, 1x الأنسولين نقل السيلينيوم الملحق (ITS), 10% مصل البقر الجنين (FBS), 5 نانوغرام / مل عامل نمو الأوعية الدموية (VEGF), 10 نانوغرام / مل FGF الأساسية, و 2x المضاد للحيوية المضادة للأميكوتيك. تصفية تعقيم من خلال 0.22 ميكرون، فراغ مرشح / نظام التخزين وتخزينها في 4 درجة مئوية بين عشية وضحاها.
    ملاحظة: لا ضبط درجة الحموضة، إضافة VEGF وFGF الطازجة قبل الاستخدام.
  7. إعداد لوحات هلام أجار 4٪.
    1. إضافة 200 مل منddH2 O المعقمة في قارورة معقمة 500 مل. وزن 8 غرام من agarose، وتصب بلطف في قارورة. يُغلى المزيج لمدّة دقيقتين في ميكروويف، ثمّ يُُترك لمدّة 5 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
    2. صب 25 مل في كل طبق بيتري 100 ملم في خزانة السلامة البيولوجية (إعداد 6 أطباق) وانتظر 1 ساعة لترسيخ. ثم ختم لوحات مع فيلم البارافين، التفاف مع التفاف نظيفة، وتخزينها في 4 درجة مئوية.
  8. إعداد 4 L من 70٪ الإيثانول عن طريق تخفيف الإيثانول المطلق 200 واقية في ddH2O الأوتوكلاف.
  9. إعداد 2x مضاد حيوي مضاد الأميكوتي في ddH2O المعقم: مزيج 980 مل من ddH2O مع 20 مل من مضاد المضادات الحيوية المضادة للالأميكة تحت مجلس الوزراء السلامة البيولوجية.

2. قلب الخنزير التروية

  1. إضافة 1 مل من 1000 U/ مل الهيبارين إلى كل 1 لتر من محلول القلب والبلى. الحفاظ على الحل على الجليد.
    ملاحظة: هناك حاجة إلى ما لا يقل عن 3 L لشهي والحفاظ على القلب أثناء نقل إلى غرفة زراعة الأنسجة.
  2. خذ العناصر التالية إلى غرفة جراحة الخنزير: دلو ثلج كبير مليء بالثلج ، صينية معدنية معقمة (احتفظ بدلو الثلج لتروية القلب) ، جرة واحدة معقمة 500 مل ، جرة واحدة L 1 (لنقل القلب في محلول cardioplegia مرة أخرى إلى غرفة زراعة الأنسجة ، على الثلج)، وعلبة بلاستيكية واحدة معقمة مليئة بالجليد (للحفاظ على محلول القلب والجنبعلى الجليد).
  3. قم بإعداد نظام توثر القلب في الموقع الذي يحتوي على stopcock ثلاثي الاتجاه، وحقنة 60 مل، وقسطرة إبرة فراشة 18 G، وأنابيب التمديد إلى خزان محلول القلب والطحالب.
  4. تُزخّس خنزير يوركشاير الذكر (2-3 أشهر، 20-25 كجم) أولاً بحقنة عضلية من مزيج من الكيتامين (20 ملغم/كغ)/xylazine (2 ملغم/كغ). تأكيد التخدير السليم من خلال فقدان توتر الفك. ثم، نقل الخنزير إلى غرفة الجراحة، تنبيب وتهوية الرئتين ميكانيكيا كما هو موضح سابقا14.
  5. الحفاظ على التخدير مع (1.5-2٪ ) إيزوفران.
  6. ضع الحيوان على الموضع الجانبي الأيمن وزل الفراء من منطقة الصدر. تنظيف الجلد مع فرك الكحول، ثم تعقيم الموقع الجراحي مع 10٪ (ث / v) محلول اليود povidone.
  7. افتح الصدر عن طريق شق الصدر الأيسر باستخدام مشرط في الفضاء4 بين الكوستي، واستخدام مسحب الصدر بين الأضلاع لعقد الصدر مفتوحة وفضح القلب.
    ملاحظة: استخدام جميع الأدوات المعقمة لهذا الإجراء.
  8. أدخل قسطرة إبرة الفراشة في الأذين الأيسر وأصلح الإبرة مع إغلاق سلسلة محفظة. بعد الحقن الوريدي لجرعة بولوس من الهيبارين (100 U/kg)، ابدأ في تشخص القلب في الموقع مع 500 مل من محلول القلب البارد الجليد (لإبطاء معدل ضربات القلب) عبر القسطرة الأذينية اليسرى.
  9. تُسْكْنُ الخنزير ُ بعمق مع 5% إيزوفران. استئصال القلب بسرعة من الصدر مع مقص الجراحية. Cannulate الأبهر مع قنية أبهرية وperfuse القلب في المختبر مع آخر 1 لتر من محلول القلب البارد الجليد (100 مل / دقيقة) لطرد الدم الأوعية الدموية.
  10. بعد تهوّي القلب، حافظ على القلب في جرة 1 لتر مليئة بمحلول القلب البارد الثلجي والحفاظ على الثلج أثناء النقل إلى غرفة زراعة الأنسجة.

3. تشريح أنسجة قلب الخنزير

  1. إعداد حمام الأنسجة على الهزاز، إضافة الجليد إلى سترة تبريد حمام الأنسجة، ثم إضافة حل Tyrode في حمام الأنسجة. إعداد 1 L جرة بلاستيكية لجمع التخلص من الجليد الذائب من سترة تبريد حمام الأنسجة.
  2. تحت خزانة السلامة البيولوجية، نقل قلب الخنزير إلى صينية تحتوي على 1 لتر من محلول القلب البارد الطازج.
  3. تشريح القلب لعزل البطين الأيسر باستخدام مشرط معقم قابل للسحب. ثم قم بتقطيع البطين الأيسر إلى كتل من 1-2 سم3 لكل منها باستخدام شفرات مستطيل الحلاقة. استخدام قطعة واحدة للتقطيع والحفاظ على القطع المتبقية في أنبوب 50 مل في حل تايرودي الباردة على الجليد لقطع في وقت لاحق، إذا لزم الأمر.
    ملاحظة: تدليك الأنسجة قبل تشريح اليدين، وخاصة إذا كان هذا هو الكتلة الثانية. تدليك يساعد على استعادة تكوين الألياف العضلية الصحيح ويمنع أي تصلب داخل كتلة القلب.
  4. أضف 1-2 قطرات من الغراء النسيجي(جدول المواد)إلى حامل العينة المعدنية ولصق قطعة من كتلة أجار 4٪ بمساحة سطحية تبلغ حوالي 1 سم2.
  5. أضف 1-2 قطرات من الغراء النسيجي على العقيق.
  6. عصا كتلة القلب إلى أجار مع الجانب epicardium القلب التي تواجه إلى أسفل على الغراء الأنسجة وتأكد من أنها مسطحة قدر الإمكان. ثم، نقل حامل الأنسجة مع كتلة القلب إلى موقفها في حمام تشريح الهزاز.
  7. إرفاق أنبوب الأكسجين إلى حمام تشريح وعلبة معدنية مليئة حل Tyrode لجمع شرائح (حمام تايرودي الاكسجين). ثم، إضافة مصافي الخلايا 40 ميكرومتر في علبة معدنية لجمع شرائح بعد القطع.
  8. ضبط موضع التقطيع
    1. باستخدام برنامج التشغيل الهزاز ولوحة القيادة، وضبط ارتفاع شفرة / عينة. حدد زر الارتفاع واتبع الإرشادات التي تظهر على الشاشة لضبط الارتفاع. من الناحية المثالية ، يكون النصل بالقرب من الجزء العلوي من الأنسجة ولكن تحت العضلات الحليمية وتأكد من وجود سائل يغطي الأنسجة والنصل قبل تشريحها.
    2. ضبط أين تبدأ تقطيع الأنسجة عن طريق تحديد زر التقدم. اضغط على زر الشريحة وزيادة السرعة باستخدام مقبض الباب لتحريك شفرة نحو حافة الأنسجة. ثم اضغط على شريحة مرة أخرى للتوقف، واضغط على زر التقدم لتعطيل العملية.
    3. ضبط معلمات القطع: سرعة متقدمة = 0.03 مم/ سنة، تردد الاهتزاز = 80 هرتز، وسعة الاهتزاز الأفقي = 2 مم. ثم ابدأ التقطيع عن طريق تحديد زر الشريحة.
    4. السماح لشريحة الهزاز حتى تصل إلى نهاية الأنسجة ولكن قبل أن يضرب النهاية الخلفية لحامل العينة. عند هذه النقطة، اضغط على شريحة مرة أخرى للتوقف. اضغط على زر العودة للعودة إلى موضع البداية.
    5. حدد تكرار السيارات (النقر عليه مرتين) والتي سوف تسمح microtome تهتز لتكرار السيارات عملية تشريح لمدة تصل إلى 99 مرة.
  9. جمع شرائح
    1. انتظر حتى تكون الشرائح كاملة الطول وتبدو جيدة (بعد تجاوز طبقات العضلات الحليمية) ، ثم ابدأ في جمع الشرائح.
    2. جمع شرائح باستخدام ماصة باستور البلاستيك مليئة محلول Tyrode الباردة للاستيلاء بلطف على الأنسجة من الحمام. إذا لزم الأمر، استخدم ملقط ومقص الربيع لفصل الشريحة عن كتلة القلب إذا كان الأنسجة لا تزال متصلة.
    3. نقل شريحة إلى مصفاة خلية واحدة في حمام Tyrode الاوكسيجة (انظر الخطوة 3.7) واستخدام السائل في ماصة باستور البلاستيكية للحصول على الأنسجة لتقع مسطحة على واحدة من مصافي الخلية، ثم إضافة الغسيل المعدني على الجزء العلوي لعقد الأنسجة إلى أسفل.
      ملاحظة: الشرائح تحتاج إلى احتضان على الأقل لمدة 1 ساعة في حل Tyrode قبل المعالجة (وهذا هو لBDM للاسترخاء الأنسجة).

4. زراعة شرائح القلب

  1. إعداد شرائح للثقافة
    1. تقليم شريحة من حواف لتجنب أي حواف متفاوتة. ثم، الغراء من كلا الطرفين إلى البولي يوريثين تعقيم 6 مم حزام توقيت الطابعة واسعة مع الأسلاك المعدنية جزءا لا يتجزأ من استخدام الغراء الأنسجة.
    2. نقل شرائح القلب المدعومة إلى 6 لوحات جيدا التي تحتوي على 6 مل من الثقافة المتوسطة في كل بئر.
    3. وضع غطاء لوحة التحفيز(جدول المواد)على الجزء العلوي من لوحة بئر 6 وربط الغطاء إلى الخلايا ثقافة المحفز الكهربائي(جدول المواد). ضبط المحفز لتحفيز شرائح القلب كهربائيا في 10 V، 1.2 هرتز بشكل مستمر في كل وقت.
      ملاحظة: بعد توصيل التحفيز، ستبدأ شرائح القلب في الخفق، وستكون هذه الحركة واضحة بصريًا.
    4. نقل اللوحات إلى حاضنة والحفاظ على 37 درجة مئوية مع الهواء المرطب و 5٪ CO2.
  2. تغيير الثقافة المتوسطة 3x في اليوم وإضافة 6 مل من الثقافة المتوسطة جيدا خلال كل تغيير وسائل الإعلام.
    ملاحظة: يتم أكسجين الثقافة المتوسطة لمدة 5 دقيقة قبل كل تغيير وسائل الإعلام. يجب تغيير المتوسط على الأقل 1x في اليوم؛ هذا لا بأس به في عطلة نهاية الأسبوع إذا لزم الأمر. يومين من تغيير الوسائط واحد فقط في اليوم هو الحد الأقصى الذي يتم اختباره.
  3. تغيير غطاء لوحة التحفيز كل يوم لمنع إطلاق جزيئات الجرافيت السامة في وسط الثقافة (عادة خلال تغيير وسائل الإعلام في منتصف النهار).
    1. إزالة غطاء لوحة التحفيز من طبق الثقافة وإدراج المكونات رغوة بيضاء حيث يتصل الغطاء إلى كابل لمحفز الثقافة الخلية الكهربائية، لمنع تلف المياه للدائرة الكهربائية.
    2. ضع غطاء الطبق في حمام من الماء الأوتوكلاف مع 2x مضاد للمضادات الحيوية مضاد الأميكوتي. يبقيه في هذا الحمام (أي، حمام الرعنة) بين عشية وضحاها.
    3. في اليوم التالي، حرك غطاء اللوحة إلى حمام إيثانول بنسبة 70٪ لمدة 5-15 دقيقة لإزالة التلوث. تخلص من أكبر قدر من السائل من الجهاز قبل تبديل الحمامات.
    4. ثم، نقل غطاء لوحة إلى الحمام الثالث والأخير (أي حمام نظيف)، والذي يتكون من المياه الأوتوكلاف و2x مضاد للبكتيريا المضادة للالأميكتيك، لشطف أي آثار الإيثانول المتبقية.
    5. بعد التأنيب غطاء لوحة في حمام نظيف، استخدم مسح نظيفة خالية من الوبر (رش أسفل مع الإيثانول) لتجفيف أي المياه المتبقية على الأجزاء البلاستيكية، ثم إزالة قطعة رغوة بيضاء ووضع بعناية غطاء لوحة مرة أخرى على لوحة الثقافة.
      ملاحظة: لا تلمس أقطاب الجرافات السوداء التي تدخل إلى البئر ، حيث لن يكون الجهاز عقيمًا بعد الآن.
    6. باستخدام ملقط معقمة، تأكد من أن الأنسجة في وسط البئر حتى لا يلمس غطاء اللوحة الأنسجة. تأكد من أن الجانب المنحني من غطاء اللوحة يطابق مع الجانب الزاوية من اللوحة وأن الزوايا المربعة تصطف.
      ملاحظة: لتقليل تلوث أغطية لوحة التحفيز، احتفظ بها في 6 لوحات بئر نظيفة وفارغة بعد الانتهاء من التجربة.
  4. إجراء قياس MTT وقياسات الكالسيوم وتقييمات وظيفة العقد على شرائح قلب الخنزير الطازجة (اليوم 0) ، وبعد 6 أيام في الثقافة وفقًا لـ Ou et al.13.

النتائج

باستخدام محفز كهربائي لثقافة الخلية المتاحة تجاريًا يمكنه استيعاب ثمانية 6 لوحات بئر في وقت واحد ، قمنا بمحاكاة الوسط القلبي للبالغين عن طريق تحفيز التحفيز الكهربائي عند التردد الفسيولوجي (1.2 هرتز) ، وفحصنا للمكونات المتوسطة الأساسية لإطالة مدة شرائح قلب الخنزير الوظيف?...

Discussion

هنا نحن وصف بروتوكول الفيديو مفصلة لطريقتنا نشرت مؤخرا لإنتاجية متوسطة مبسطة (عمليات تصل إلى 48 شرائح / جهاز) الأسلوب الذي يتيح ثقافة شرائح قلب الخنزير لفترة طويلة بما فيه الكفاية لاختبار سمية القلب الحادة13. تحاكي الظروف المقترحة بيئة القلب، بما في ذلك تواتر التحفيز الكهربائي?...

Disclosures

TMAM حاصل على أسهم في تينايا للعلاجات. لم يبلغ المؤلفون الآخرون عن أي تعارضات.

Acknowledgements

ويدعم TMAM من قبل المعاهد القومية للصحة منحة P30GM127607 وجمعية القلب الأمريكية منحة 16SDG29950012. ويدعم RB من قبل P01HL78825 وUM1HL113530.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
1,000 mL, 0.22 µm, Vacuum Filter/Storage SystemsVWR28199-812
2,3-Butanedione monoxime (BDM)FisherAC150375000
500 mL, 0.22 µm, Vacuum Filter/Storage SystemsVWR28199-788
6-well C-Dish Cover (electrical-stimulation-plate-cover)Ion OptixCLD6WFC
6-well platesFisher08-772-1B
AgaroseBioline USABIO-41025
Antibiotic-AntimycoticThermo15-240-062
C-Pace EM (cell-culture-electrical-stimulator)Ion OptixCEP100
Calcium Chloride (CaCl2)FisherC79-500
Ceramic Blades for Vibrating MicrotomeCampden Instruments7550-1-C
Cooley Chest RetractorMillennium Surgical63-G5623
D-GlucoseFisherD16-1
Disposable Scalpel #20Biologyproducts.comDS20X
Falcon Cell Strainers, Sterile, CorningVWR21008-952
Fetal Bovine SerumThermoA3160502
Graefe ForcepsFisherNC9475675
Heparin sodium saltSigma-AldrichH3149-50KU
HEPESFisherBP310-1
Histoacryl BLUE Tissue glueAmazonhttps://www.amazon.com/HISTOACRYL-FLEXIBLE-1051260P-Aesculap-Adhesive/dp/B074WB5185/
Iris Spring scissorsFisherNC9019530
Iris Straight ScissorsFisher731210
Isoflurane, USPPiramalNDC 66794-017-25
ITS Liquid Media SupplementSigma-AldrichI3146-5ML
Ketamine HCl (500 mg/10 mL)West-WardNDC 0143-9508
Magnesium Chloride (MgCl2)FisherM33-500
Mayo SuperCut Surgical ScissorsAROSurgical Instruments CorporationAROSuperCut™ 07.164.17
Medium 199, Earle's SaltsThermo11-150-059
Oxygen regulatorPraxair
Oxygen tanks -Praxair
Plastic Pasteur pipettesFisher13-711-48
Potassium Chloride (KCl)FisherAC193780010
Printer Timing BeltAmazonhttps://www.amazon.com/Uxcell-a14081200ux0042-PRINTER-Precision-Timing/dp/B00R1J3KDC/
Razor rectangle bladesFisher12-640
Recombinant Human FGF basicR&D Systems233-FB-025/CF
Recombinant Human VEGFR&D Systems293-VE-010/CF
Retractable scalpelsFisher22-079-716
Sodium Bicarbonate (NaHCO3)FisherAC217125000
Sodium Chloride (NaCl)FisherAC327300010
Vibrating MicrotomeCampden Instruments7000 SMZ-2
Xylazine HCl (100 mg/mL)Heartland Veterinary SupplyNADA 139-236

References

  1. Onakpoya, I. J., Heneghan, C. J., Aronson, J. K. Post-marketing withdrawal of 462 medicinal products because of adverse drug reactions: a systematic review of the world literature. BMC Medicine. 14, 10 (2016).
  2. Fermini, B., Fossa, A. A. The impact of drug-induced QT interval prolongation on drug discovery and development. Nature Reviews Drug Discovery. 2 (6), 439-447 (2003).
  3. Moslehi, J. J. Cardiovascular Toxic Effects of Targeted Cancer Therapies. The New England Journal of Medicine. 375 (15), 1457-1467 (2016).
  4. Robertson, C., Tran, D. D., George, S. C. Concise review: maturation phases of human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. Stem Cells. 31 (5), 829-837 (2013).
  5. Ronaldson-Bouchard, K., et al. Advanced maturation of human cardiac tissue grown from pluripotent stem cells. Nature. 556 (7700), 239-243 (2018).
  6. Pinto, A. R., et al. Revisiting Cardiac Cellular Composition. Circulation Research. 118 (3), 400-409 (2016).
  7. Kanisicak, O., et al. Genetic lineage tracing defines myofibroblast origin and function in the injured heart. Nature Communications. 7, 12260 (2016).
  8. Fu, X., et al. Specialized fibroblast differentiated states underlie scar formation in the infarcted mouse heart. Journal of Clinical Investigations. 128 (5), 2127-2143 (2018).
  9. Kretzschmar, K., et al. Profiling proliferative cells and their progeny in damaged murine hearts. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (52), E12245-E12254 (2018).
  10. Perbellini, F., et al. Investigation of cardiac fibroblasts using myocardial slices. Cardiovascular Research. 114 (1), 77-89 (2018).
  11. Watson, S. A., et al. Preparation of viable adult ventricular myocardial slices from large and small mammals. Nature Protocols. 12 (12), 2623-2639 (2017).
  12. Kang, C., et al. Human Organotypic Cultured Cardiac Slices: New Platform For High Throughput Preclinical Human Trials. Scientific Reports. 6, 28798 (2016).
  13. Ou, Q., et al. Physiological Biomimetic Culture System for Pig and Human Heart Slices. Circulation Research. 125 (6), 628-642 (2019).
  14. Jones, S. P., et al. The NHLBI-sponsored Consortium for preclinicAl assESsment of cARdioprotective therapies (CAESAR): a new paradigm for rigorous, accurate, and reproducible evaluation of putative infarct-sparing interventions in mice, rabbits, and pigs. Circulation Research. 116 (4), 572-586 (2015).
  15. Crick, S. J., Sheppard, M. N., Ho, S. Y., Gebstein, L., Anderson, R. H. Anatomy of the pig heart: comparisons with normal human cardiac structure. Journal of Anatomy. 193 (Pt 1), 105-119 (1998).
  16. Fischer, C., et al. Long-term functional and structural preservation of precision-cut human myocardium under continuous electromechanical stimulation in vitro. Nature Communications. 10 (1), 117 (2019).
  17. Franke, J., Abs, V., Zizzadoro, C., Abraham, G. Comparative study of the effects of fetal bovine serum versus horse serum on growth and differentiation of primary equine bronchial fibroblasts. BMC Veterinary Research. 10, 119 (2014).
  18. Vuorenpaa, H., et al. Novel in vitro cardiovascular constructs composed of vascular-like networks and cardiomyocytes. In Vitro Cellular & Developmental Biology - Animal. 50 (4), 275-286 (2014).
  19. Qiao, Y., et al. Multiparametric slice culture platform for the investigation of human cardiac tissue physiology. Progress in Biophysics and Molecular Biology. 144, 139-150 (2018).
  20. Watson, S. A., et al. Biomimetic electromechanical stimulation to maintain adult myocardial slices in vitro. Nature Communications. 10 (1), 2168 (2019).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

157

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved