Fatiamento e cultivo de corações de porco condições fisiológicas

Resumo

Este protocolo descreve como cortar e cultivar tecido cardíaco condições fisiológicas por 6 dias. Este sistema de cultura poderia ser usado como uma plataforma para testar a eficácia de novas terapêuticas de insuficiência cardíaca, bem como testes confiáveis de cardiotoxicidade aguda em um modelo de coração 3D.

Resumo

Muitas drogas novas falham em estudos clínicos devido a efeitos colaterais cardiotóxicos como os ensaios in vitro disponíveis atualmente e modelos animais in vivo mal prevêem passivos cardíacos humanos, representando um fardo multibilionário para a indústria farmacêutica. Portanto, há uma necessidade médica não atendida mundial de melhores abordagens para identificar a cardiotoxicidade medicamentosa antes de realizar testes caros e demorados "primeiro no homem". Atualmente, apenas células cardíacas imaturas (cardiomiócitos pluripotentes derivados de células-tronco induzidas por humanos [hiPSC-CMs]) são usados para testar a eficiência terapêutica e a toxicidade das drogas, pois são as únicas células cardíacas humanas que podem ser cultivadas por períodos prolongados necessário para testar a eficácia e toxicidade da droga. No entanto, um único tipo de célula não pode replicar o fenótipo do complexo tecido cardíaco 3D que é formado por múltiplos tipos de células. É importante ressaltar que o efeito das drogas precisa ser testado em cardiomiócitos adultos, que têm características diferentes e respostas de toxicidade em comparação com os imaturos hiPSC-CMs. A combinação de fatias de coração humano é um modelo promissor de miocárdio humano intacto. Esta tecnologia fornece acesso a um sistema multicelular completo que imita o tecido cardíaco humano e reflete as condições fisiológicas ou patológicas do miocárdio humano. Recentemente, através da otimização dos componentes da mídia cultural e das condições de cultura para incluir estimulação elétrica contínua a 1,2 Hz e oxigenação intermitente do meio de cultura, desenvolvemos uma nova configuração do sistema de cultura que preserva a viabilidade e funcionalidade de fatias de coração humano e porco por 6 dias na cultura. No protocolo atual, estamos detalhando o método para cortar e cultivar coração de porco como exemplo. O mesmo protocolo é usado para cultivar fatias de corações humanos, cães, ovelhas ou gatos. Este sistema de cultura tem o potencial de se tornar um poderoso modelo preditivo humano in situ para testes de cardiotoxicidade aguda que fecha a lacuna entre os resultados de testes pré-clínicos e clínicos.

Introdução

A cardiotoxicidade induzida por drogas é uma das principais causas de retirada do mercado¹. Na última década do^{século XX,} oito drogas não cardiovasculares foram retiradas do mercado, pois resultaram em morte súbita por arritmias ventriculares². Além disso, várias terapias anticancerígenas (embora em muitos casos eficazes) podem levar a vários efeitos cardiotóxicos, incluindo cardiomiopatia e arritmias. Por exemplo, tanto as terapias tradicionais (por exemplo, antrasicopas e radiação) quanto as terapias direcionadas (por exemplo, trastuzumabe) podem resultar em complicações cardiovasculares em um subconjunto de pacientes³. Uma estreita colaboração entre cardiologistas e oncologistas (através do campo emergente da "cardio-oncologia") ajudou a tornar essas complicações gerenciáveis garantindo que os pacientes possam ser tratados efetivamente². Menos claros são os efeitos cardiovasculares de agentes mais novos, incluindo inibidores Her2 e PI3K, especialmente quando as terapias são usadas em combinação. Portanto, há uma necessidade crescente de estratégias de triagem pré-clínica confiáveis para toxicidades cardiovasculares associadas a terapias anticancerígenas emergentes antes de ensaios clínicos em humanos. A falta de disponibilidade de sistemas de cultura para tecido cardíaco humano que seja funcional e estruturalmente viável por mais de 24 h é um fator limitante para testes de cardiotoxicidade confiáveis. Portanto, há uma necessidade urgente de desenvolver um sistema confiável para a cultura do tecido cardíaco humano condições fisionicais para testar a toxicidade das drogas.

O recente movimento em direção ao uso de cardiomiócitos pluripotentes derivados de células-tronco induzidas por humanos (hiPSC-CMs) em testes de cardiotoxicidade forneceu uma solução parcial para resolver essa questão; no entanto, a natureza imatura dos hiPSC-CMs e a perda de integridade tecidual em comparação com a natureza multicelular do tecido cardíaco são grandes limitações desta tecnologia⁴. Um estudo recente superou parcialmente essa limitação através da fabricação de tecidos cardíacos de hiPSC-CMs em hidrogéis e submetendo-os ao aumento gradual da estimulação elétrica ao longo do tempo⁵. No entanto, suas propriedades eletromecânicas não atingiram a maturidade observada no miocárdio humano adulto. Além disso, o tecido cardíaco é estruturalmente mais complicado, sendo composto de vários tipos de células, incluindo células endoteliais, neurônios e vários tipos de fibroblastos estrônticos ligados a uma mistura muito específica de proteínas matrizes extracelulares⁶. Essa heterogeneidade da população de células não cardiomiócitos^7,8,9 no coração de mamíferos adultos é um grande obstáculo na modelagem do tecido cardíaco usando tipos de células individuais. Essas principais limitações destacam a importância do desenvolvimento de métodos para permitir a cultura de tecido cardíaco intacto para estudos ideais envolvendo condições fisiológicas e patológicas do coração⁵.

Cultivar fatias de coração humano é um modelo promissor de miocárdio humano intacto. Esta tecnologia fornece acesso a um sistema multicelular 3D completo que é semelhante ao tecido cardíaco humano que poderia refletir de forma confiável as condições fisiológicas ou patológicas do miocárdio humano. No entanto, seu uso tem sido severamente limitado pelo curto período de viabilidade na cultura, que não se estende além de 24 h utilizando os protocolos mais robustos relatados até 2018^10,11,12. Essa limitação deveu-se a múltiplos fatores, incluindo o uso da interface ar-líquido para cultivar as fatias, e o uso de um meio de cultura simples que não suporta as altas demandas energéticas do tecido cardíaco. Recentemente desenvolvemos um sistema de cultura submerso que é capaz de fornecer estimulação elétrica contínua e otimizar os componentes da mídia cultural para manter as fatias de tecido cardíaco viáveis por até 6 dias¹³. Este sistema de cultura tem o potencial de se tornar um poderoso modelo preditivo humano in situ para testes de cardiotoxicidade aguda para fechar a lacuna entre os resultados de testes pré-clínicos e clínicos. No artigo atual, estamos detalhando o protocolo para cortar e cultivar as fatias do coração usando como exemplo um coração de porco. O mesmo processo é aplicado a corações humanos, cães, ovelhas ou gatos. Com este protocolo, esperamos espalhar a tecnologia para outros laboratórios da comunidade científica.

Protocolo

Todos os procedimentos animais foram de acordo com as diretrizes institucionais da Universidade de Louisville e aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais.

1. Preparação para o corte (um dia antes do corte)

1. Preparação do microtome vibratório
   1. Coloque a lâmina de cerâmica no suporte seguindo estas etapas: depois de desembrulhar cuidadosamente a lâmina, coloque a borda afiada primeiro na ranhura da ferramenta da lâmina. Em seguida, coloque a lâmina no suporte afrouxando os dois parafusos nos braços do suporte e deslize a lâmina cada arandela e empurre-a firmemente para trás contra as paradas traseiras. Aperte os parafusos para fixar a lâmina.
      NOTA: Os parafusos não devem ser apertados demais.
   2. Calibrar a lâmina usando o protocolo de calibração e as ferramentas de acordo com o protocolo do fabricante.
      NOTA: Resumidamente, a fim de facilitar o alinhamento da lâmina com o eixo de viagem e minimizar as deflexões do eixo Z, o microtomo vibratório utiliza um dispositivo de calibração desmontável. Quando o dispositivo de calibração estiver conectado ao instrumento, sua presença será automaticamente detectada, e o microtomo vibratório assumirá o controle de ajustar as configurações de amplitude e freqüência da lâmina a uma magnitude que melhor permita o ajuste do erro de alinhamento da lâmina.
      1. Pressione o botão Slice para iniciar o processo de alinhamento que moverá automaticamente a lâmina de modo que a borda de corte esteja na posição ideal em relação ao dispositivo de calibração para melhor avaliação de alinhamento. Siga as instruções na tela para fazer ajustes na lâmina usando a chave de fenda fornecida para garantir que o alinhamento Z esteja dentro de 1 μm.
   3. Autoclave o banho interno e todas as partes metálicas do microtome vibratório.
2. Autoclave as grandes bandejas metálicas (para coletar as fatias e encharcar as tampas da placa de estimulação elétrica), quaisquer recipientes de vidro, lâminas de retângulo regulares, fórceps, tesouras, correia de cronometragem da impressora (cortá-las em pedaços de 6 mm de largura), aradoras metálicas e 5 L de água destilada dupla (ddH₂O).
3. Esterilize um frasco de 1 L, um frasco de 500 mL e uma bandeja de plástico para o coração in situ e perfusão in vitro com a solução cardioplégica.
4. Prepare 2 L da solução do Tyrode fatiando em um béquer de 2 L.
   1. Para 1 L da solução do Tyrode fatiado, misture 3 g/L 2,3-butanedione monoxime (BDM), 140 mM NaCl (8,18 g), 6 mM KCl (0,447 g), 10 mM D -glicose (1,86 g), HEPES de 10 mM (2,38 g), 1 mM MgCl₂ (1 mL de 1 Ml de solução), 1,8 mM CaCl₂ (1,8 mL de 1 M solução), até 1 L de ddH₂O. Ajuste o pH para 7,40 usando NaOH. Em seguida, filtre a solução usando um sistema de 1.000 mL, 0,22 μm, filtro/armazenamento a vácuo e armazene a 4 °C durante a noite.
5. Prepare 4 L da solução cardioplégica.
   1. Para 1 L da solução cardioplégica, misture 110 mM NaCl (6,43 g), 1,2 mM CaCl₂ (1,2 mL de 1 M solução), 16 mM KCl (1,19 g), 16 mM MgCl₂ (3,25 g), 10 mM NaHCO₃ (0,84 g), 1 U/mL heparin, até 1 L de ddH₂O. Ajuste o pH para 7,40 usando NaOH. Em seguida, filtre a solução usando um sistema de 1.000 mL, 0,22 μm, filtro/armazenamento a vácuo e armazene a 4 °C durante a noite.
      NOTA: Adicione 1.000 U/L heparina na solução de cardioplegia no dia do corte (ver passo 2.1).
6. Preparar recentemente 500 mL de meio de cultura na garrafa original em um armário de biossegurança: mix médio 199, 1x suplemento insulina-transferrin-selnium (ITS), 10% soro bovino fetal (FBS), 5 ng/mL fator de crescimento endotelial vascular (VEGF), 10 ng/mL FGF-básico e 2x antibiótico-antimicotic. O filtro esteriliza através do sistema de 0,22 μm, filtro/armazenamento de vácuo e armazena a 4 °C durante a noite.
   NOTA: Não ajuste o pH, adicione VEGF e FGF recentemente antes de usar.
7. Prepare 4% de placas de gel de ágar.
   1. Adicione 200 mL de ddH₂O esterilizado em um frasco esterilizado de 500 mL. Pesar 8 g de agarose e despeje delicadamente no frasco. Ferva por 2 min em um microondas, depois esfrie por 5 min em temperatura ambiente.
   2. Despeje 25 mL em cada placa de Petri de 100 mm em um armário de biossegurança (prepare 6 pratos) e aguarde 1h para solidificar. Em seguida, sele as placas com filme de parafina, enrole com envoltório limpo e armazene a 4 °C.
8. Prepare 4 L de 70% de etanol diluindo o etanol absoluto à prova de 200 em ddH₂O autoclaved.
9. Prepare 2x antibiótico-antimicotic em ddH₂O esterilizado: misture 980 mL de ddH₂O esterilizado com 20 mL de antibiótico-antimicótico o gabinete de biossegurança.

2. Perfusão de coração de porco

1. Adicione 1 mL de heparina U/mL a cada 1 L de solução cardioplégica. Mantenha a solução no gelo.
   NOTA: São necessários pelo menos 3 L para a perfusão e preservação do coração durante a transferência para a sala de cultura de tecidos.
2. Leve os seguintes itens para a sala de cirurgia do porco: um grande balde de gelo cheio de gelo, uma bandeja de metal esterilizada (mantenha no balde de gelo para perfusão cardíaca), um frasco esterilizado de 500 mL, um frasco de 1 L (para transferir o coração em solução de cardioplegia de volta para a sala de cultura de tecidos , no gelo), e uma bandeja de plástico esterilizada cheia de gelo (para manter solução cardioplégica no gelo).
3. Prepare um sistema de perfusão cardíaca in-situ contendo uma torneira de 3 vias, uma seringa de 60 mL, um cateter de agulha borboleta de 18 G e tubos de extensão para o reservatório de solução cardioplégica.
4. Anestesiar o porco macho yorkshire (2-3 meses de idade, 20-25 kg) primeiro com uma injeção intramuscular de um coquetel de cetamina (20 mg/kg)/xilazina (2 mg/kg). Confirme a anestesia adequada pela perda da tensão da mandíbula. Em seguida, transfira o porco para a sala de cirurgia, entubar e ventilar mecanicamente os pulmões como descrito anteriormente¹⁴.
5. Manter anestesia com (1,5-2%) Isoflurano.
6. Coloque o animal na posição lateral direita e raspe a pele da área do peito. Limpe a pele com esfoliante de álcool e, em seguida, esterilize o local cirúrgico com 10% (w/v) solução de povidone-iodo.
7. Abra o peito por incisão de toracotomia esquerda^th usando um bisturi no espaço intercostal 4, e use um retrátil entre as costelas para manter o peito aberto e expor o coração.
   NOTA: Use todos os instrumentos esterilizados para este procedimento.
8. Insira o cateter da agulha borboleta no átrio esquerdo e fixe a agulha com um fechamento de corda da bolsa. Após a injeção intravenosa de uma dose de bolus de heparina (100 U/kg), comece a perfundir o coração in situ com 500 mL de solução cardioplégica gelada (para diminuir a freqüência cardíaca) através do cateter atrial esquerdo.
9. Anestesiar profundamente o porco com 5% de isoflurano. Extirbe rapidamente o coração para fora do peito com uma tesoura cirúrgica. Cannulate a aorta com uma cânula aórtica e perfundir o coração in vitro com outro 1 L de solução cardioplégica gelada (100 mL/min) para liberar sangue de vasculatura.
10. Após a perfusão cardíaca, mantenha o coração em um frasco de 1 L cheio de solução cardioplegia gelada e mantenha no gelo durante a transferência para a sala de cultura de tecidos.

3. Corte de tecido cardíaco de porco

1. Coloque o banho de tecido no vibratomo, adicione gelo à jaqueta de resfriamento do banho de tecido, em seguida, adicione a solução de Tyrode no banho de tecido. Configure um frasco de plástico L para coletar o descarte de gelo derretido da jaqueta de resfriamento do banho de tecido.
2. o armário de biossegurança, transfira o coração de porco para uma bandeja contendo 1 L de solução cardioplégica fria e fria.
3. Disseque o coração para isolar o ventrículo esquerdo usando bisturis estéreis retráteis. Em seguida, corte o ventrículo esquerdo em blocos de 1-2 cm³ cada um usando lâminas retângulo de navalha. Use uma peça para cortar e mantenha as peças restantes em um tubo de 50 mL na solução fria de Tyrode no gelo para cortar mais tarde, se necessário.
   NOTA: Massageie o tecido antes de cortar com as mãos, especialmente se este for o segundo bloco. A massação ajuda a restaurar a configuração correta da fibra muscular e previne qualquer rigidez dentro do bloco cardíaco.
4. Adicione 1−2 gotas de cola de tecido(Tabela de Materiais)ao suporte da amostra metálica e cole um pedaço do bloco de ágar de 4% com uma área de superfície de aproximadamente 1 cm².
5. Adicione 1-2 gotas de cola de tecido no ágar.
6. Coloque o bloco cardíaco no ágar com o lado do epicárdio cardíaco voltado para baixo na cola do tecido e certifique-se de que é o mais plano possível. Em seguida, transfira o suporte de tecido com o bloco cardíaco para sua posição no banho de corte do vibratomo.
7. Conecte o tubo de oxigênio ao banho de corte e à bandeja de metal preenchida com a solução de Tyrode para coletar as fatias (banho de Tyrode oxigenado). Em seguida, adicione 40 μm de filtros de células na bandeja de metal para coletar as fatias após o corte.
8. Ajustando a posição de corte
   1. Usando o software operacional vibratome e o painel de instrumentos, ajuste a altura da lâmina/amostra. Selecione o botão de altura e siga as instruções na tela para ajustar a altura. Idealmente, tenha a lâmina perto do topo do tecido, mas abaixo dos músculos papilares e certifique-se de que há líquido cobrindo o tecido e a lâmina antes de cortar.
   2. Ajuste por onde começar a cortar o tecido selecionando o botão de avanço. Pressione o botão de fatia e aumente a velocidade usando o botão para mover a lâmina em direção à borda do tecido. Em seguida, pressione a fatia novamente para parar e pressione o botão de avanço para inativar o processo.
   3. Ajuste os parâmetros de corte: velocidade de avanço = 0,03 mm/s, frequência de vibração = 80 Hz e amplitude de vibração horizontal = 2 mm. Em seguida, comece a cortar selecionando o botão de fatia.
   4. Deixe o vibratome fatiar até atingir a extremidade do tecido, mas antes de atingir a parte de trás do suporte do espécime. Neste ponto, pressione fatia novamente para parar. Aperte o botão Retornar para voltar à posição inicial.
   5. Selecione repetição automática (clicando duas vezes) que permitirá que o microtome vibratório repita automaticamente o processo de corte por até 99 vezes.
9. Coletando fatias
   1. Espere até que as fatias estejam em comprimento total e pareça boa (depois de passar pelas camadas musculares papilares), em seguida, comece a coletar as fatias.
   2. Colete as fatias usando uma pipeta pasteur de plástico cheia de solução fria de Tyrode para pegar suavemente o tecido do banho. Se necessário, use fórceps e tesouras de mola para dissociar a fatia do bloco cardíaco se o tecido ainda estiver preso.
   3. Transfira a fatia para um coador de células no banho de Tyrode oxigenado (ver passo 3.7) e use o líquido na pipeta pasteur de plástico para fazer com que o tecido fique deitado em um dos filtros celulares, em seguida, adicione uma arandela metálica na parte superior para segurar o tecido para baixo.
      NOTA: As fatias precisam ser incubadas pelo menos por 1h na solução do Tyrode antes do processamento (isto é para o BDM relaxar o tecido).

4. Fatias de coração de culturing

1. Preparando as fatias para a cultura
   1. Corte a fatia das bordas para evitar bordas irregulares. Em seguida, cole-o de ambas as extremidades para poliuretano esterilizado de 6 mm de largura correia de cronometragem da impressora com fios metálicos embutidos usando cola de tecido.
   2. Transfira as fatias de coração suportadas para 6 placas de poço que contenham 6 mL de meio de cultura em cada poço.
   3. Coloque a tampa da placa de estimulação(Tabela de Materiais)na parte superior da placa de 6 poços e conecte a tampa ao estimulador elétrico de cultura celular(Tabela de Materiais). Ajuste o estimulador para estimular eletricamente as fatias de coração a 10 V, 1,2 Hz continuamente o tempo todo.
      NOTA: Depois de ligar a estimulação, as fatias de coração começarão a bater, e esse movimento será visualmente óbvio.
   4. Transfira as placas para uma incubadora e mantenha a 37 °C com ar umidificado e 5% CO₂.
2. Mude o meio de cultura 3x por dia e adicione 6 mL de meio de cultura por bem durante cada mudança de mídia.
   NOTA: O meio de cultura é oxigenado por 5 min antes de cada mudança de mídia. O meio deve ser trocado pelo menos 1x por dia; isso é bom nos fins de semana, se necessário. Dois dias de apenas 1 mudança de mídia por dia é o máximo que é testado.
3. Altere a tampa da placa de estimulação todos os dias para evitar a liberação de partículas tóxicas de grafite no meio de cultura (geralmente durante a mudança de mídia do meio-dia).
   1. Remova a tampa da placa de estimulação do prato de cultura e insira o plugue de espuma branca onde a tampa se conecta ao cabo para o estimulador elétrico da cultura celular, para evitar danos à água no circuito elétrico.
   2. Coloque a tampa da placa em um banho de água autoclaved com 2x antibiótico-antimicótico. Mantenha-o neste banho (ou seja, lavando banho) durante a noite.
   3. No dia seguinte, mova a tampa da placa para um banho de 70% de etanol por 5-15 min para descontaminar. Retire o máximo de líquido do dispositivo antes de trocar os banhos.
   4. Em seguida, transfira a tampa da placa para o terceiro e último banho (ou seja, banho limpo), que consiste em água autoclaved e 2x antibacteriano-antimicocético, para enxaguar quaisquer vestígios de etanol restantes.
   5. Depois de enxaguar a tampa da placa no banho limpo, use um lenço limpo sem fiapos (pulverizado com etanol) para secar qualquer água residual nas peças plásticas, em seguida, remova a peça de espuma branca e coloque cuidadosamente a tampa da placa de volta na placa de cultura.
      NOTA: Não toque nos eletrodos de grafite preto que vão para o poço, pois o dispositivo não será mais estéril.
   6. Usando fórceps estéreis, certifique-se de que o tecido está no centro do poço para que a tampa da placa não toque no tecido. Certifique-se de que o lado curvo da tampa da placa combina com o lado angular da placa e que os cantos quadrados se alintem.
      NOTA: Para minimizar a contaminação das tampas da placa de estimulação, mantenha-as limpas e vazias 6 placas de poço após o término do experimento.
4. Realizar um ensaio MTT, medidas de cálcio e avaliações de função contraída em fatias de coração de porco fresco (dia 0), e após 6 dias na cultura de acordo com Ou et al.¹³.

Resultados

Usando um estimulador elétrico de cultura celular comercialmente disponível que pode acomodar oito 6 placas de poço de uma só vez, emulamos o meio cardíaco adulto induzindo estimulação elétrica na frequência fisiológica (1,2 Hz), e rastreamos os componentes médios fundamentais para prolongar a duração das fatias funcionais do coração de porco na cultura¹³. Como os corações de porco e humano são semelhantes em tamanho e anatomia^15...

Discussão

Aqui descrevemos o protocolo de vídeo detalhado para o nosso método recém-publicado para o método de throughput médio simplificado (processos de até 48 fatias/dispositivo) que permite a cultura de fatias de coração de porco por um período suficientemente longo para testar cardiotoxicidade aguda¹³. As condições propostas imitam o ambiente do coração, incluindo frequência de estimulação elétrica, disponibilidade de nutrientes e oxigenação intermitente. Atribuímos a viabilidade pr...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
1,000 mL, 0.22 µm, Vacuum Filter/Storage Systems	VWR	28199-812
2,3-Butanedione monoxime (BDM)	Fisher	AC150375000
500 mL, 0.22 µm, Vacuum Filter/Storage Systems	VWR	28199-788
6-well C-Dish Cover (electrical-stimulation-plate-cover)	Ion Optix	CLD6WFC
6-well plates	Fisher	08-772-1B
Agarose	Bioline USA	BIO-41025
Antibiotic-Antimycotic	Thermo	15-240-062
C-Pace EM (cell-culture-electrical-stimulator)	Ion Optix	CEP100
Calcium Chloride (CaCl2)	Fisher	C79-500
Ceramic Blades for Vibrating Microtome	Campden Instruments	7550-1-C
Cooley Chest Retractor	Millennium Surgical	63-G5623
D-Glucose	Fisher	D16-1
Disposable Scalpel #20	Biologyproducts.com	DS20X
Falcon Cell Strainers, Sterile, Corning	VWR	21008-952
Fetal Bovine Serum	Thermo	A3160502
Graefe Forceps	Fisher	NC9475675
Heparin sodium salt	Sigma-Aldrich	H3149-50KU
HEPES	Fisher	BP310-1
Histoacryl BLUE Tissue glue	Amazon		https://www.amazon.com/HISTOACRYL-FLEXIBLE-1051260P-Aesculap-Adhesive/dp/B074WB5185/
Iris Spring scissors	Fisher	NC9019530
Iris Straight Scissors	Fisher	731210
Isoflurane, USP	Piramal	NDC 66794-017-25
ITS Liquid Media Supplement	Sigma-Aldrich	I3146-5ML
Ketamine HCl (500 mg/10 mL)	West-Ward	NDC 0143-9508
Magnesium Chloride (MgCl2)	Fisher	M33-500
Mayo SuperCut Surgical Scissors	AROSurgical Instruments Corporation	AROSuperCut™ 07.164.17
Medium 199, Earle's Salts	Thermo	11-150-059
Oxygen regulator	Praxair
Oxygen tanks -	Praxair
Plastic Pasteur pipettes	Fisher	13-711-48
Potassium Chloride (KCl)	Fisher	AC193780010
Printer Timing Belt	Amazon		https://www.amazon.com/Uxcell-a14081200ux0042-PRINTER-Precision-Timing/dp/B00R1J3KDC/
Razor rectangle blades	Fisher	12-640
Recombinant Human FGF basic	R&D Systems	233-FB-025/CF
Recombinant Human VEGF	R&D Systems	293-VE-010/CF
Retractable scalpels	Fisher	22-079-716
Sodium Bicarbonate (NaHCO3)	Fisher	AC217125000
Sodium Chloride (NaCl)	Fisher	AC327300010
Vibrating Microtome	Campden Instruments	7000 SMZ-2
Xylazine HCl (100 mg/mL)	Heartland Veterinary Supply	NADA 139-236