חיתוך ולבבות חזיר מקולף בתנאים פיסיולוגיים

Summary

פרוטוקול זה מתאר כיצד לחתוך את רקמת הלב והתרבות בתנאים פיסיולוגיים במשך 6 ימים. מערכת זו של התרבות יכול לשמש פלטפורמה לבדיקת היעילות של אי ספיקת לב הרומן therapeutics, כמו גם בדיקות אמינות של הקרדיוקרדיטיות חריפה במודל לב תלת-ממדי.

Abstract

תרופות הרומן הרבות להיכשל במחקרים קליניים בשל תופעות לוואי cardiotoxic כמו כיום זמין מחוץ לתחום במודלים בעלי חיים vivo לחזות התחייבויות לב האדם, פוזות נטל רב מיליארד דולר על תעשיית התרופות. לפיכך, יש צורך רפואי ברחבי העולם לגישות טובות יותר כדי לזהות קרדיולוקסיניטי סמים לפני התחייבות יקר זמן רב ' הראשון במבחנים של האדם. כיום, רק תאים לב בלתי מפותחים (האדם המושרה ביותר בתאי גזע הנגרמת על ידי מערכת החייאה) משמשים כדי לבדוק יעילות טיפולית רעילות הסמים כפי שהם היחידים בתאי הלב האנושיים שיכולים להיות מתורבתים לתקופות ממושכות נדרש כדי לבדוק את יעילות הסמים ואת הרעילות. עם זאת, סוג תא בודד אינו יכול לשכפל את הפנוטיפ של רקמת הלב 3D מורכבת אשר נוצרת של סוגי תאים מרובים. וחשוב מכך, השפעת הסמים צריכה להיבדק על הקרדיוציטים מבוגרים, שיש להם מאפיינים שונים ותגובות רעילות בהשוואה ל-היפנוסק-CMs בלתי-מפותח. הפרוסות של לב האדם מהווה מודל מבטיח של שריר הלב האנושי ללא פגע. טכנולוגיה זו מספקת גישה למערכת מסחר מלאה המחקה את רקמת הלב האנושית ומשקפת את התנאים הפיזיולוגיים או הפתולוגיים של שריר הלב האנושי. לאחרונה, באמצעות אופטימיזציה של רכיבי מדיה התרבות ותנאי התרבות לכלול גירוי חשמלי רציף ב 1.2 Hz ו חמצן לסירוגין של מדיום התרבות, פיתחנו התקנה חדשה של מערכת התרבות אשר שומרת על יכולת הקיום והפונקציונליות של פרוסות לב של אדם וחזיר למשך 6 ימים בתרבות. בפרוטוקול הנוכחי, אנו מפרט את השיטה לחיתוך לב חזיר מקולף כדוגמה. אותו פרוטוקול משמש גם לפרוסות תרבות מלבבות אנושיים, כלבים, כבשים או חתולים. זו מערכת התרבות יש את הפוטנציאל להיות האדם ניבוי חזק במודל באתרו עבור בדיקות קרדיולקסיטיות חריפה הסוגרת את הפער בין תוצאות בדיקה קלינית קליני.

Introduction

שיטת התרופות הנגרמת היא גורם מרכזי לגמילה משוק¹. בעשור האחרון של המאה^ה -20, שמונה תרופות ללא לב וכלי דם הונסוגו מן השוק כתוצאה מכך מוות פתאומי בשל הפרעות קצב הלב². בנוסף, מספר טיפולים נגד סרטן (בעוד במקרים רבים יעיל) יכול להוביל לכמה אפקטים cardiotoxic כולל שריר הלב הפרעות קצב. לדוגמה, הן מסורתיות (למשל, פחם וקרינה) ו ממוקד (g., trastuzumab) טיפולים סרטן השד יכול לגרום לסיבוכים לב וכלי דם בקבוצת משנה של חולים³. שיתוף פעולה קרוב בין קרדיולוגים ו אונקולוגים (באמצעות השדה המתעוררים של "סיבולת לב ריאה") עזר להפוך את הסיבוכים האלה לניהול להבטיח כי חולים יכולים להיות מטופלים ביעילות². פחות ברור הם השפעות לב וכלי דם של סוכנים חדשים, כולל Her2 ו PI3K מעכבי, במיוחד כאשר הטיפולים משמשים בשילוב. לכן, יש צורך הולך וגדל אסטרטגיות ההקרנה הקדם קלינית עבור רעלים קרדיווסטיים הקשורים המתעוררים נגד סרטן טיפולים לפני ניסויים קליניים אנושיים. חוסר הזמינות של מערכות התרבות לרקמת הלב האנושית כי הוא פונקציונלי מבחינה מבנית עבור יותר מ -24 h הוא גורם מגביל עבור בדיקות הקרדיולוקסיטי אמין. לכן, יש צורך דחוף לפתח מערכת אמינה עבור רקמת לב האדם culturing בתנאים פיזיולוגיים לבדיקת רעילות לסמים.

המהלך האחרון לקראת השימוש של האדם המושרה הנגרמת לתאי גזע-הקרדיוציטים (היפנוטית-CMs) בבדיקות קרדיולוקסיטי סיפקה פתרון חלקי לטיפול בבעיה זו; עם זאת, הטבע בוגר של היפנוsc-CMs ואובדן שלמות רקמות בהשוואה לטבע רב-תאי של רקמת הלב הם מגבלות גדולות של טכנולוגיה זו⁴. מחקר שנערך לאחרונה התגבר באופן חלקי על מגבלה זו באמצעות הייצור של רקמות לב מ-היפרsc-CMs על הידרוג ' לים והוא החזיק אותם לעלייה הדרגתית גירוי חשמלי לאורך זמן⁵. עם זאת, התכונות האלקטרו-מכאני שלהם לא השיגו את הבגרות הנתפסת בשריר הלב האנושי המבוגר. יתר על כן, רקמת הלב הוא מורכב יותר מבחינה מבנית, להיות מורכב מסוגי תאים שונים כולל תאים אנדותל, נוירונים וסוגים שונים של מסטרומה פיברותקיעות מקושרים יחד עם תערובת ספציפית מאוד של חלבונים מטריתאיים מטריצות⁶. הטרוגניות הזאת של אוכלוסיית התאים הבלתי-קרדיוציט^7,8,9 בליבו של היונקים הגדולים הוא מכשול משמעותי ברקמת לב מידול באמצעות סוגי תאים נפרדים. מגבלות גדולות אלה מדגישות את החשיבות של פיתוח שיטות להפיכת התרבות של רקמת לב שלמה למחקרים אופטימליים הכרוכים בתנאים פיזיולוגיים ופתולוגיים של הלב⁵.

מודל מבטיח של שריר הלב. האנושי ללא פגע טכנולוגיה זו מספקת גישה למערכת מלאה 3D הרב-תאיים הדומה לרקמת הלב האנושי אשר יכול באופן מהימן לשקף את התנאים הפיזיולוגיים או הפתולוגיים של שריר הלב האנושי. עם זאת, השימוש שלו כבר מוגבל באופן חמור על ידי התקופה הקצרה של הכדאיות בתרבות, אשר לא להאריך מעבר 24 h באמצעות הפרוטוקולים החזקים ביותר שדווחו עד 2018^10,11,12. מגבלה זו הייתה בשל גורמים מרובים, לרבות השימוש בממשק נוזלי האוויר לתרבות הפרוסות, והשימוש במדיום תרבותי פשוט שאינו תומך בדרישות האנרגטיות הגבוהות של רקמת הלב. פיתחנו לאחרונה מערכת תרבות מתחת לגוף, אשר מסוגלת לספק גירוי חשמלי רציף ואופטימיזציה של רכיבי מדיה התרבות כדי לשמור פרוסות רקמות לב קיימא עד 6 ימים¹³. זו מערכת התרבות יש את הפוטנציאל להיות האדם ניבוי חזק במודל באתרו עבור בדיקות קרדיולקסיטיות חריפה כדי לסגור את הפער בין תוצאות בדיקה קלינית קליני. במאמר הנוכחי, אנו מפרט את הפרוטוקול לחיתוך ולתפירה של פרוסות הלב באמצעות לב חזיר כדוגמה. אותו תהליך מוחל על לבבות אנושיים, כלבים, כבשים או חתולים. באמצעות פרוטוקול זה, אנו מקווים להפיץ את הטכנולוגיה למעבדות אחרות בקהילה המדעית.

Protocol

כל נוהלי החיות היו בהתאם להנחיות המוסדיים של אוניברסיטת לואיוויל ואושרו על ידי הוועדה לטיפול בבעלי חיים מוסדיים ושימוש.

1. הכנה לפריסה (יום אחד לפני החיתוך)

1. הכנת מיקרוטומה הרוטטת
   1. הניחו את הלהב הקרמי לתוך המחזיק בו באמצעות הצעדים הבאים: לאחר הסרת הלהב בזהירות, הצב את הקצה החד תחילה בחריץ של כלי הלהב. אז, להתאים את הלהב לתוך המחזיק על ידי התרופפות שני ברגים על זרועותיו של המחזיק ולהחליק את הלהב תחת כל מכונת כביסה ולדחוף אותו בחוזקה על העצירות האחוריות. הדק את הברגים כדי לאבטח את הלהב.
      הערה: אין לחזק יותר מדי את הברגים.
   2. כיול הלהב באמצעות פרוטוקול הכיול והכלים בהתאם לפרוטוקול היצרן.
      הערה: בקצרה, כדי להקל על יישור הלהב באמצעות ציר הנסיעות וכלה בהפחתת החידוד של הציר Z, המיקרוטומה הרוטטת משתמשת בהתקן כיול מתקפל. כאשר התקן הכיול מחובר לתוך המכשיר שנוכחותו תזוהה באופן אוטומטי, והמיקרוטומה הרוטטת תיקח שליטה בהתאמת משרעת והגדרות התדר של הלהב לסדר גודל המאפשר התאמה מיטבית של שגיאת יישור הלהב.
      1. לחץ על לחצן פרוסה כדי להתחיל את תהליך היישור שיגרום להזזת הלהב באופן אוטומטי כך שהקצה החדשני יהיה במצב אופטימלי יחסית להתקן הכיול להערכת היישור המיטבית. בצע את ההוראות שעל המסך כדי לבצע התאמות ללהב באמצעות המברג שסופק כדי להבטיח שיישור Z יהיה בטווח של 1 μm.
   3. הטבו את האמבט הפנימי ואת כל חלקי המתכת של המיקרוטומה הרוטטת.
2. אוטוקלב מגשי מתכת גדולים (עבור איסוף הפרוסות לספוג את הצלחת גירוי חשמלי מכסה), כל מיכלי זכוכית, להבי מלבן רגיל, מלקחיים, מספריים, מדפסת תזמון חגורה (לחתוך אותם לתוך 6 חלקים רחבים), שיבות מתכת 5 L של מים מזוקקים כפולים (ddH₂O).
3. לחטא צנצנת 1 L, 1 500 mL ומגש פלסטיק אחד ללב באתרו ובפרזיה מבחנה עם הפתרון הקרדיופיחה.
4. הכינו 2 ליטר של התמיסה. "
   1. עבור 1 L של הפתרון של הפרוסות, מערבבים 3 g/L 2, 3-butanedione מונוקסימי (BDM), 140 מ"מ הנאל (8.18 g), 6 מ"מ KCl (0.447 g), 10 מ"מ D-גלוקוז (1.86 g), 10 מ"מ HEPES (2.38 g), 1 מ"מ MgCl₂ (1 mL של 1 m פתרון), 1.8 Mm cacl₂ (1.8 ml של 1 m פתרון), עד 1 L של ddh₂O. להתאים את ה-PH ל7.40 באמצעות naoh. לאחר מכן, סנן את הפתרון באמצעות 1,000 mL, 0.22 μm, מערכת לסנן ואקום/אחסון ולאחסן ב 4 ° c בלילה.
5. הכינו 4 ליטר של התמיסה הקרדיוליסטית.
   1. עבור 1 L של הפתרון cardioplegic, לערבב 110 מ"מ הנאל (6.43 g), 1.2 mM CaCl₂ (1.2 mL של 1 M פתרון), 16 מ"מ kcl (1.19 g), 16 מ"מ mgcl₂ (3.25 g), 10 מ"מ נחקו₃ (0.84 g), 1 U/mL הפארין, עד 1 L של Ddh₂O. כוונן את ה-pH ל7.40 באמצעות naoh. לאחר מכן, סנן את הפתרון באמצעות 1,000 mL, 0.22 μm, מערכת לסנן ואקום/אחסון ולאחסן ב 4 ° c בלילה.
      הערה: הוסיפו 1,000 U/L הפארין בפתרון קרדיו, היום של החיתוך (ראה שלב 2.1).
6. טרי להכין 500 mL של התרבות הבינונית בבקבוק המקורי בקבינט אבטחה טיחות: לערבב בינוני 199, 1x אינסולין-העברת-סלניום (שלה) תוספת, 10% סרום העובר העוברי (fbs), 5 ng/ml כלי הצמיחה אנדותל (מעבד), 10 ng/ml fbs-basic, 2x אנטיביוטי-antimycotic מסנן לעקר דרך מערכת 0.22 μm, מסנן ואקום/אחסון ולאחסן ב 4 ° c בלילה.
   הערה: אין לכוונן את ה-pH, להוסיף לפני השימוש ב-, ולאחר FGF.
7. הכינו 4% לוחיות ג'ל באגר.
   1. הוסף 200 mL של העיקור ddH₂O ב 500 מ"ל בקבוקון מעוקר. שוקלים 8 גר' של התעורר, ובעדינות לשפוך לתוך הבקבוקון. מרתיחים עבור 2 דקות במיקרוגל, ואז קריר עבור 5 דקות בטמפרטורת החדר.
   2. יוצקים 25 מ ל בכל צלחת פטרי 100 מ"מ בקבינט אבטחה טיחות (להכין 6 מנות) ולחכות 1 h כדי לגבש. לאחר מכן, לאטום את הצלחות עם סרט פרפין, לעטוף בניילון נקי, ולאחסן ב 4 ° c.
8. להכין 4 L של 70% אתנול על ידי דילול האתנול 200-הוכחה מוחלטת באופן אוטומטי ddH₂O.
9. להכין 2x אנטיביוטי-antimycotic ב העיקור ddh₂o: מערבבים 980 mL של העיקור ddh₂o עם 20 מ ל של אנטיביוטי-antimycotic תחת הקבינט אבטחה טיחות.

2. לב חזיר Perfusion

1. הוסף 1 מ ל של הפארין 1,000 U/mL לכל 1 L של הפתרון הקרדיופיחה. . שמור על הפתרון בקרח
   הערה: לפחות 3 יש צורך בפרזיה ושימור הלב במהלך ההעברה לחדר התרבות של הרקמה.
2. לקחת את הפריטים הבאים לחדר ניתוח חזיר: אחד קרח גדול דלי מלא קרח, מתכת אחת המגש מעוקר (לשמור על דלי קרח עבור perfusion לב), אחד מעוקר 500 mL צנצנת, אחד לצנצנת 1 L (כדי להעביר את הלב בחזרה הפתרון לחדר תרבות הרקמה , על הקרח), ומגש פלסטיק אחד מעוקר מלא קרח (כדי לשמור על הפתרון הקרדיואופאלי על הקרח).
3. להכין מערכת ההיתוך לב באתרו המכיל הקפאה 3-כיוון, מזרק 60 mL, 18 G פרפר המחט הצינור, ואת צינורות הרחבה למאגר הפתרון cardioplegic.
4. שאיפה חזיר הזכר יורקשייר (2-3-חודש בן, 20 על 25 ק ג) הראשון עם הזרקת השרירים של קטמין (20 מ"ג/ק"ג)/xylazine (2 מ"ג/ק"ג) קוקטייל. לאשר הרדמה נכונה על ידי אובדן של מתח הלסת. ואז, להעביר את החזיר לחדר הניתוח, צנרור ולאוורר מכנית את הריאות כפי שתוארה בעבר¹⁴.
5. שמירה על הרדמה עם (1.5-2%) איזופלוריין.
6. הנח את החיה בתנוחה הצדדית הימנית וגלח את הפרווה מאזור החזה. נקה את העור עם לשפשף אלכוהול, ואז לחטא את האתר כירורגי עם 10% (w/v) povidone-פתרון יוד.
7. פתח את החזה על ידי חתך האונה השמאלי השמאלית באמצעות^th אזמל בחלל האינטרקוסטל 4, ולהשתמש במפסק החזה בין הצלעות כדי להחזיק את החזה פתוח לחשוף את הלב.
   הערה: השתמש בכל המכשירים הציריליים עבור הליך זה.
8. הכנס את קטטר המחט פרפר לתוך האטריום השמאלי ולתקן את המחט עם סגירת מחרוזת הארנק. לאחר הזרקה ורידי של מינון מנת הפבית (100 U/kg), להתחיל לעשות את הלב באתרו עם 500 mL של פתרון קרדיו, קר הקרח הקרה (כדי להאט את קצב הלב) דרך צנתר שמאל פרפור.
9. מורדם בצורה עמוקה את. החזיר עם 5% מלוריאן בזריזות את הלב מהחזה. עם מספריים כירורגיים בעזרת צינורית של אבי העורקים והפעלת הלב במבחנה עם עוד 1 L של התמיסה הקרה קרדיופיחה (100 mL/min) כדי לרוקן את הדם של vascuלטורה.
10. לאחר הפרזיה לב, יש לשמור את הלב בצנצנת 1 L מלאה בתמיסת כבישה קרה ולשמור על קרח במהלך ההעברה לחדר התרבות של הרקמה.

3. חותך רקמת לב חזיר

1. להגדיר את האמבטיה רקמה על הרטט, להוסיף קרח למעיל הקירור באמבט רקמות, ואז להוסיף את הפתרון של Tyrode לתוך האמבטיה רקמה. הגדרת כד פלסטיק 1 L כדי לאסוף את הסילוק של קרח נמס מן המעיל לקירור רקמת הרקמה.
2. מתחת לארון הבטיחות, העבירו את לב החזיר למגש המכיל 1 ל' של התמיסה הקרה.
3. מנתחים את הלב כדי לבודד את החדר השמאלי באמצעות מנתחים סטרילי לשליפה. ואז, לחתוך את החדר השמאלי לתוך בלוקים של 1-2 ס מ³ כל אחד באמצעות להבים מלבן תער. השתמש בחתיכה אחת לחיתוך ולשמור את החלקים הנותרים בצינור 50 mL בתמיסה הקרה של טירכב על קרח לחיתוך מאוחר יותר, במידת הצורך.
   הערה: עסה את הרקמה לפני החיתוך בידיים, במיוחד אם זהו הבלוק השני. עיסוי מסייע לשחזר את התצורה הנכונה של סיבי השריר ומונע כל נוקשות בתוך בלוק הלב.
4. הוסף 1-2 טיפות של דבק רקמות (טבלה של חומרים) על מחזיק דגימת מתכת ולתקוע פיסת 4% אגר בלוק עם שטח של כ 1 ס מ².
5. הוסיפו 1-2 טיפות. של דבק רקמות באגר
6. לתקוע את בלוק הלב לאגר עם צד הלב האפילידיום הפונה למטה על דבק רקמות ולוודא שהוא שטוח ככל האפשר. ואז, להעביר את מחזיק הרקמה עם בלוק הלב למיקומה באמבט הפרוסות של הרטט.
7. הצמד את צינור החמצן לאמבט הפרוסות ולמגש המתכת המלא בתמיסה של טירודה לאיסוף הפרוסות (אמבט טירודה מחמצן). לאחר מכן, להוסיף 40 יקרומטר תא מכשירי במגש מתכת כדי לאסוף את הפרוסות לאחר חיתוך.
8. התאמת מיקום הפרוסות
   1. באמצעות תוכנת ההפעלה והרטט של לוח המחוונים, התאם את גובה הלהב/דגימה. בחר את לחצן הגובה ובצע את ההוראות שעל המסך כדי לכוונן את הגובה. באופן אידיאלי, יש את הלהב קרוב לראש הרקמה אבל מתחת לשרירי הלסת ולוודא שיש נוזל המכסה את הרקמה ואת הלהב לפני החיתוך.
   2. התאם היכן להתחיל לחתוך את הרקמה על-ידי בחירת הלחצן מראש . לחץ על כפתור פרוסה ולהגדיל את המהירות באמצעות הכפתור כדי להזיז את הלהב לכיוון קצה הרקמה. לאחר מכן, הקש על פרוסה שוב כדי להפסיק ולחץ על הלחצן מראש כדי לבטל את התהליך.
   3. להתאים את הפרמטרים גזירה: מהירות מראש = 0.03 מ"מ/s, תדר רטט = 80 Hz, ו משרעת הרטט אופקי = 2 מ"מ. לאחר מכן, התחל בחיתוך על-ידי בחירה בלחצן פרוסה .
   4. תן את הרטט הפרוסות עד שהוא מגיע לסוף הרקמה, אך לפני שהוא פוגע בקצה האחורי של מחזיק הדגימה. בשלב זה, הקש שוב על חתוך כדי להפסיק. להכות את כפתור ההחזרה כדי לחזור למיקום ההתחלה.
   5. בחרו ' חזרה אוטומטית ' (לחיצה פעמיים) שתאפשר למיקרוטומה הרוטטת לחזור באופן אוטומטי על תהליך הפריסה עד 99 פעמים.
9. איסוף פרוסות
   1. המתן עד שפרוסות הן באורך מלא ונראות טוב (לאחר שעברו את שכבות השריר הפטובות), ולאחר מכן התחילו לאסוף את הפרוסות.
   2. לאסוף את הפרוסות באמצעות פיפטה פלסטיק פסטר ממולא הפתרון של Tyrode הקרים כדי לתפוס בעדינות את הרקמה מהאמבטיה. במקרה הצורך, השתמש מלקחיים ומספריים האביב כדי לנתק את הפרוסה מבלוק הלב אם הרקמה עדיין מחוברת.
   3. להעביר את הפרוסה לתוך מסננת תא אחד באמבטיה של Tyrode מחמצן (ראה שלב 3.7) ולהשתמש בנוזל הצינורות הפלסטיק פסטר כדי לקבל את הרקמה לשכב שטוח על אחד מהניידים התא, ולאחר מכן להוסיף מנקה מתכת על גבי להחזיק את הרקמה למטה.
      הערה: הפרוסות צריך להיות מודלפחות עבור 1 h בפתרון של Tyrode לפני העיבוד (זה עבור BDM כדי להרגיע את הרקמה).

4. שבבי פרוסות לב

1. הכנת הפרוסות לתרבות
   1. חתוך את הפרוסה מהקצוות כדי למנוע קצוות לא אחידים. אז, להדביק אותו משני הקצוות של פוליאוריטן מעוקר 6 מ"מ מדפסת רחב חגורה תזמון עם חוטי מתכת מוטבע באמצעות דבק רקמת.
   2. העבר את פרוסות הלב הנתמכות ל-6 לוחות היטב המכילים 6 מ ל של התרבות הבינונית בכל באר.
   3. מניחים את מכסה לוחית הגירוי (טבלת חומרים) בחלק העליון של 6 הצלחות היטב ומחברים את המכסה לגירוי חשמלי של תרבות התא (טבלת חומרים). כוונן את הגירוי לחשמל כדי לגרות את פרוסות הלב ב-10 V, 1.2 Hz ברציפות כל הזמן.
      הערה: לאחר חיבור הגירוי, פרוסות הלב יתחילו לפעום, ותנועה זו תהיה ברורה מבחינה חזותית.
   4. העבירו את הלוחות לאינקובטור ושמרו על 37 ° c עם מחולל לחות ו-5% CO₂.
2. שינוי תרבות בינונית 3 x ליום ולהוסיף 6 מ ל של התרבות בינונית לכל טוב במהלך כל שינוי המדיה.
   הערה: בינונית תרבותית במשך 5 דקות לפני כל שינוי במדיה. יש לשנות בינונית לפחות 1x ליום; זה בסדר בסופי שבוע אם צריך. יומיים של רק שינוי אחד במדיה ביום הוא המקסימום שנבדק.
3. שנה את כיסוי לוחית הגירוי מדי יום כדי למנוע שחרור חלקיקי גרפיט רעילים במדיום התרבותי (בדרך כלל במהלך שינוי המדיה באמצע היום).
   1. הסר את מכסה לוחית הגירוי מתוך צלחת התרבות והכנס את תקע הקצף הלבן שבו המכסה מתחבר לכבל של הגירוי החשמלי של תרבות התא, כדי למנוע נזק למים למעגל החשמלי.
   2. מניחים את כיסוי הצלחת באמבטיה של מים אוטומטיים עם 2x אנטיביוטי-antimycotic. שמור אותו באמבטיה זו (כלומר, אמבטיה שטיפה) בלילה.
   3. למחרת, הזיזו את כיסוי הצלחת לאמבט אתנול של 70% עבור 5-15 דקות עד טהרים. הרעד הנוזלי הרבה יותר מהמכשיר לפני החלפת האמבטיות.
   4. ואז, להעביר את כיסוי הצלחת לאמבטיה השלישי והאחרון (כלומר, לנקות אמבטיה), אשר מורכב מים אוטוקלבים ו-2x אנטיבקטריאלי-antimycotic, כדי לשטוף את כל עקבות אתנול שנותרו.
   5. לאחר שטיפה את כיסוי הצלחת באמבטיה נקייה, להשתמש נקי מוך לנגב (מרוסס עם אתנול) כדי לייבש את כל המים השאריות על חלקי פלסטיק, לאחר מכן להסיר את פיסת קצף לבן מקום בזהירות לכסות את הצלחת בחזרה על צלחת התרבות.
      הערה: אין לגעת באלקטרודות גרפיט שחורים שנכנסים לתוך הבאר, כמו המכשיר לא יהיה יותר סטרילי.
   6. באמצעות מלקחיים סטרילי, לוודא את הרקמה היא במרכז הבאר כך כיסוי הצלחת לא לגעת ברקמה. ודא כי הצד המעוקל של כיסוי הצלחת מתאים עם הצד הזוויתי של הצלחת וכי פינות מרובעות קו למעלה.
      הערה: כדי למזער את הזיהום של מכסה לוחית גירוי, לשמור אותם נקי וריק לוחית 6 לאחר סיום הניסוי.
4. בצע ביצוע של שיטת MTT, מדידות סידן והערכות הפונקציה על פרוסות לב חזיר טרי (יום 0), ואחרי 6 ימים בתרבות לפי Ou et al^.13.

תוצאות

באמצעות ממריץ מסחרי של תרבות התא הזמין מסחרית כי יכול להכיל שמונה 6 צלחות היטב בבת אחת, אנו לחיקוי של למבוגרים את הסביבה הלב על ידי גרימת גירוי חשמלי בתדר הפיזיולוגי (1.2 Hz), והוקרן עבור רכיבים בינוניים בסיסיים כדי להאריך את המשך של פרוסות לב של חזיר פונקציונלי בתרבות

Discussion

כאן אנו מתארים את פרוטוקול וידאו מפורט עבור השיטה שפורסמה לאחרונה עבור תפוקה בינונית פשוטה (תהליכים עד 48 פרוסות/התקן) שיטה המאפשרת תרבות של פרוסות לב חזיר לתקופה ארוכה מספיק כדי לבדוק את הקרדיולקסיניטי החריפה¹³. התנאים המוצעים מחקים את הסביבה של הלב, כולל תדירות של גירוי חשמלי...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
1,000 mL, 0.22 µm, Vacuum Filter/Storage Systems	VWR	28199-812
2,3-Butanedione monoxime (BDM)	Fisher	AC150375000
500 mL, 0.22 µm, Vacuum Filter/Storage Systems	VWR	28199-788
6-well C-Dish Cover (electrical-stimulation-plate-cover)	Ion Optix	CLD6WFC
6-well plates	Fisher	08-772-1B
Agarose	Bioline USA	BIO-41025
Antibiotic-Antimycotic	Thermo	15-240-062
C-Pace EM (cell-culture-electrical-stimulator)	Ion Optix	CEP100
Calcium Chloride (CaCl2)	Fisher	C79-500
Ceramic Blades for Vibrating Microtome	Campden Instruments	7550-1-C
Cooley Chest Retractor	Millennium Surgical	63-G5623
D-Glucose	Fisher	D16-1
Disposable Scalpel #20	Biologyproducts.com	DS20X
Falcon Cell Strainers, Sterile, Corning	VWR	21008-952
Fetal Bovine Serum	Thermo	A3160502
Graefe Forceps	Fisher	NC9475675
Heparin sodium salt	Sigma-Aldrich	H3149-50KU
HEPES	Fisher	BP310-1
Histoacryl BLUE Tissue glue	Amazon		https://www.amazon.com/HISTOACRYL-FLEXIBLE-1051260P-Aesculap-Adhesive/dp/B074WB5185/
Iris Spring scissors	Fisher	NC9019530
Iris Straight Scissors	Fisher	731210
Isoflurane, USP	Piramal	NDC 66794-017-25
ITS Liquid Media Supplement	Sigma-Aldrich	I3146-5ML
Ketamine HCl (500 mg/10 mL)	West-Ward	NDC 0143-9508
Magnesium Chloride (MgCl2)	Fisher	M33-500
Mayo SuperCut Surgical Scissors	AROSurgical Instruments Corporation	AROSuperCut™ 07.164.17
Medium 199, Earle's Salts	Thermo	11-150-059
Oxygen regulator	Praxair
Oxygen tanks -	Praxair
Plastic Pasteur pipettes	Fisher	13-711-48
Potassium Chloride (KCl)	Fisher	AC193780010
Printer Timing Belt	Amazon		https://www.amazon.com/Uxcell-a14081200ux0042-PRINTER-Precision-Timing/dp/B00R1J3KDC/
Razor rectangle blades	Fisher	12-640
Recombinant Human FGF basic	R&D Systems	233-FB-025/CF
Recombinant Human VEGF	R&D Systems	293-VE-010/CF
Retractable scalpels	Fisher	22-079-716
Sodium Bicarbonate (NaHCO3)	Fisher	AC217125000
Sodium Chloride (NaCl)	Fisher	AC327300010
Vibrating Microtome	Campden Instruments	7000 SMZ-2
Xylazine HCl (100 mg/mL)	Heartland Veterinary Supply	NADA 139-236